מבחני ACT1-CUP1 קובעים את הרגישויות הספציפיות למצע של מוטנטים שחבורים בשמרים ניצנים

Summary

בדיקת ACT1-CUP1, בדיקת גידול נחושת, מספקת קריאה מהירה של שחבור RNA שליח מבשר (pre-mRNA) וההשפעה שיש לגורמי שחבור מוטנטיים על תפקוד השחבור השחבור. מחקר זה מספק פרוטוקול ומדגיש את ההתאמה האישית האפשרית כדי להתמודד עם שאלת השחבור המעניינת.

Abstract

מוטציות שהוכנסו בספליקוזום או במצע שלו תרמו באופן משמעותי להבנתנו את המורכבות של תפקוד השחבור. בין אם הן קשורות למחלה או נבחרו באופן פונקציונלי, רבות מהמוטציות הללו נחקרו באמצעות מבחני גדילה באורגניזם המודל Saccharomyces cerevisiae (שמרים). בדיקת צמיחת הנחושת הספציפית לשחבור, או בדיקת ACT1-CUP1, מספקת ניתוח מקיף של מוטציה ברמה הפנוטיפית. בדיקת ACT1-CUP1 משתמשת בעיתונאים המעניקים עמידות לנחושת כאשר הם מחוברים כהלכה. לפיכך, בנוכחות נחושת, שינויים בכדאיות השמרים מתואמים לשינויים בייצור mRNA באמצעות שחבור. בניסוי טיפוסי, שחבור השמרים מאותגר עם כתבי שחבור שונים שאינם בקונצנזוס ומוטציה של גורם שחבור מעניין כדי לזהות כל השפעה סינרגטית או אנטיתטית על השחבור. כאן ניתן תיאור מלא של הכנת לוחות נחושת, ציפוי של תאי שמרים והערכת נתונים. מתואר מבחר של ניסויים משלימים, המדגישים את הרבגוניות של כתבי ACT1-CUP1. בדיקת ACT1-CUP1 היא כלי שימושי בארגז הכלים של השחבור הודות לקריאה ישירה של אפקטים מוטציוניים והאפשרויות ההשוואתיות מהמשך השימוש בשטח.

Introduction

השחבור הוא מכונה ביולוגית גדולה המזרזת הסרה של אינטרונים, אזורים שאינם מקודדים ב-RNA שליח מבשר (pre-mRNA)^1,2. אפיון ההשפעה של מוטציה נקודתית אחת ב-1 מתוך כמעט 100 חלבונים ו-5 רנ"א שאינם מקודדים הוא לעתים קרובות דו-משמעי כאשר חוקרים את החלבון או הרנ"א בבידוד. את השינוי בתפקוד הרכיב המוטנטי ניתן להעריך בצורה הטובה ביותר in vivo בהקשר של השחבור המלא והמתפקד.

בדיקת צמיחת הנחושת המתוארת כאן היא מדד מהיר של יעילות שחבור ב- Saccharomyces cerevisiae או שמרים ניצנים. בדיקה זו, שפותחה על ידי C.F. Lesser ו- C. Guthrie ופורסמה בשנת 1993, משלבת את קלות העבודה עם אורגניזם מודל פשוט ואת הקריאה הפשוטה של כדאיות התא³. הכדאיות מתואמת עם מידת היכולת של השחבורים בתאים אלה לזהות ולפצל את תעתיק הכתב.

בדיקת גידול נחושת זו נקראת בדרך כלל בדיקת ACT1-CUP1. השם ACT1-CUP1 מקורו בשני הגנים שהתמזגו ליצירת כתב של יעילות שחבור. ACT1 הוא גן האקטין של שמרים, אשר בא לידי ביטוי גבוה ויש לו אינטרון^שחבור יעיל ^4,5. Cup1p הוא צ'לטור נחושת המסנן נחושת בתא כדי למנוע הפרעה לתפקודים תאיים סדירים ^6,7,8. כתב ACT1-CUP1 מכיל את הגנים האלה ברצף כך ש-CUP1 נמצא במסגרת הקריאה הנכונה רק אם מתרחשת שחבור קדם-mRNA של האינטרון של ACT1 (איור 1). חלבון הפיוז'ן המתקבל מכיל את 21 חומצות האמינו הראשונות של אקטין ואת חלבון Cup1p באורך מלא, מה שמגדיל את כדאיות השמרים בסביבה עשירה בנחושת³. לפיכך, עלייה בכמות השחבור של הכתב גורמת לריכוז גבוה יותר של Cup1p ולהתנגדות נחושת גבוהה יותר (איור 1). בהשוואה לגנים מדווחים אחרים, CUP1 משפיע על כדאיות התאים גם ברמות נמוכות, יש לו טווח רגישות רחב, וניתן להשתמש בו כדי לבחור ישירות עבור שחבור מוטציות ^3,6,7. בנוסף, CUP1 אינו חיוני לצמיחת שמרים סטנדרטית, ולכן הומאוסטזיס תאי אינו מושפע במהלך ההתקנה לבדיקה זו. ACT1-CUP1, המשלים את מבחני המחיקה או הצמיחה בטמפרטורה, מספק מידע על ההשפעות על שחבור בתנאי גידול שמרים אופטימליים אחרים.

השחבור מזהה את המצע שלו באמצעות שלושה רצפים אינטרוניים, כלומר אתר שחבור 5' (5' SS), אתר הסתעפות (BS) ואתר שחבור 3' (3' SS). באתרים אלה נוצרו מספר רב של כתבי ACT1-CUP1 המכילים רצפים שאינם בקונצנזוס. מבחר מהכתבים הנפוצים ביותר של ACT1-CUP1 מוצג באיור 1 ובטבלה 1. מכיוון שהשחבור מקיים אינטראקציה עם כל אתר שחבור באופן ייחודי בנקודות שונות במחזור השחבור, ניתן לבחון את חוסנו של השחבור בשלבים שונים על סמך איזה כתב שאינו קונצנזוס משמש. כתבים שאינם בקונצנזוס נקראים על שם העמדה שעברה מוטציה בתוך האינטרון והבסיס שאליו הוא עבר מוטציה. לדוגמה, A3c הוא כתב עם מוטציה ב-5' SS, במיוחד מיקום 3 מהקונצנזוס אדנוזין לציטוזין. כתב זה יקיים אינטראקציה חזקה עם מוטציות spliceosome המשפיעות על בחירת 5' SS ושימוש. במחקר הראשוני שלהם, לסר וגות'רי קבעו אילו מוטציות SS 5' מעכבות שחבור³. מאוחר יותר באותה שנה, כתבים שאינם בקונצנזוס בכל שלושת אתרי השחבור פורסמו על ידי ברג'ס וגות'רי במסך מדכא של מוטציות ב-ATPase Prp16p⁹. בהשוואה בין קונצנזוס לכתבים שאינם בקונצנזוס, מבחן ACT1-CUP1 היה מפתח חשוב להבנת החוסן והסלקטיביות של שחבור השמרים ולהסקת התפקוד של שחבורים אחרים של אאוקריוטים.

מכיוון שכתבי ACT1-CUP1 שאינם בקונצנזוס חושים את השחבור להפרעה נוספת, ניתן לאפיין את ההשפעה של מוטציה של גורם שחבור יחיד באמצעות הכתבים שהיא משפיעה עליהם באופן חיובי או שלילי. זה יושם על שחבור שאלות מחקר במגוון דרכים. ראשית, בדיקת ACT1-CUP1 יכולה לשמש כבדיקה גנטית למוטציות בגורמי שחבור. לדוגמה, Prp8p, חלבון השחבור הגדול ביותר, משמש כפלטפורמה שעליה ליבת הרנ"א של השחבור מזרזת את תגובת השחבור. זה הסיק, בין השאר, באמצעות האופן שבו מוטנטים של Prp8p שיפרו או הפחיתו את השחבור של כתבי ACT1-CUP1 שונים 10,11,12,13,14,15,16,17^. רכיבי חלבון אחרים של השחבור נחקרו גם הם באמצעות ACT1-CUP1, כולל Hsh155p, Cwc2p, Cef1p ו-Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. הסף האנרגטי של Prp16p וארבעה ATPases אחרים המעורבים במעבר spliceosomal נחקרו גם הם באמצעות בדיקה זו 9,26,27,28,29,30. הרנ"א הגרעיניים הקטנים (snRNAs) נחקרו בהרחבה תוך שימוש ב-ACT1-CUP1 כדי לזהות את רצפי הקדם-mRNA שהם מתאמים ואת השינויים במבנה המשני שה-snRNAs עוברים במהלך שחבור 3,31,32,33,34,35,36,37^.

בדיקת ACT1-CUP1 דורשת זן שמרים שבו כל העותקים של הגן CUP1 הודבקו. מכיוון של-CUP1 יכול להיות מספר עותק גבוה ^6,38, הכנה של מאמץ נוק-אאוט מלא יכולה לדרוש סיבובים מרובים או סינון נרחב. כתוצאה מכך, זני שמרים cup1Δ חולקו לעתים קרובות בין המעבדות, וכך גם הכתבים.

אם מוטציות בפקטור שחבור נבדקות מעותק פלסמיד, יש לדפוק את הגן מסוג בר עבור גורם זה. בנוסף, רקע השמרים אמור לאפשר בחירה של לפחות שני פלסמידים, אחד המכיל כתב ACT1-CUP1, באופן היסטורי על פלסמיד לבחירת חומרים מזינים של לאוצין, ואחד המכיל מוטציה או הפרעה במנגנון השחבור שייחקרו (איור 2). בדרך כלל, בבדיקה אחת, זני שמרים מרובים, שכל אחד מהם נושא את השאילתה splicing perturbation (QSP) וכתב אחר, יבדקו את השפעת השאילתה על השחבור.

המשתנים הבלתי תלויים במבחן ACT1-CUP1 מאפשרים לחוקר להעריך את חומרת ה-QSP. משתנים בלתי תלויים אלה הם ריכוז הנחושת ובחירתם של כתבים רבים שאינם בקונצנזוס. ראשית, כאשר זני השמרים גדלים על לוחות המכילים מגוון ריכוזי נחושת (איור 2), הגדרת הבדיקה כוללת בחירת השיפוע של הריכוזים שבהם נעשה שימוש. מחקרים יכולים להשתמש בשיפוע ריכוז נחושת קורס כדי לקבל קריאה ראשונית של הכדאיות ולאחר מכן לחזור על הבדיקה עם שיפוע עדין יותר כדי לזהות הבדלים עדינים בכדאיות. המשתנה השני הוא המגוון הרחב של כתבי ACT1-CUP1 שניתן לבדוק (איור 1 וטבלה 1). אם ה-QSP משפיע באופן שונה על כדאיות השמרים בנוכחות כתב שאינו קונצנזוס לעומת סוג פראי, ניתן להסיק מסקנה שה-QSP משפיע על שלב בשחבור או על אזור של השחבור החשוב במהלך הזיהוי או העיבוד של אותו אזור של האינטרון.

ארגז הכלים של השמרים הוא נרחב, ובדיקת ACT1-CUP1 היא חלק בלתי נפרד ממחקר השחבור. בדיקת ACT1-CUP1 מבוצעת לעתים קרובות לצד ניתוח גנטי, מבני ו/או ביוכימי מעמיק יותר על ההשפעה של QSP. מכיוון שלמחקרים מפורטים יותר אלה יש בדרך כלל הליך ארוך יותר ו/או תג מחיר גבוה יותר, גישה שכיחה היא סינון מוטנטים מעניינים עם ACT1-CUP1 תחילה.

מסופק כאן פרוטוקול בדיקה ACT1-CUP1, כולל הכנת לוחות נחושת. בדיקה זו מספקת לחוקרים תשובה ראשונית להשפעת QSP על שחבור ואילו אזורים פנימיים מושפעים ביותר מההפרעה.

Protocol

1. בניית זן שמרים

1. צור או קבל זן S. cerevisiae שהרקע שלו כולל leu2 ו - cup1Δ. כדי ליצור את הרקע הזה, השתמש בשיטת השמרים המבוססת היטב המשתמשת בליתיום אצטט ובדנ"א^{חד-גדילי 39}.
   הערה: זני שמרים הפלואידים עשויים להכיל עותק אחד, שניים או יותר של CUP1 ^6,38. עיין במידע גנומי עבור זן השמרים שנבחר בעת תכנון פריימרים נוק-אאוט כדי לאגף את מיקומי הגנים CUP1.
2. בצע טרנספורמציה של שמרים כדי לשלב את ה- QSP באמצעות שילוב גנומי או על פלסמיד. השתמש בפרוטוקול מבוסס היטב כמו אלה שתוארו במחקרים קודמים^40,41,42.
3. בצע טרנספורמציה של שמרים עם הזנים המתקבלים משלב 1.2. כדי להוסיף את פלסמיד הכתב הרצוי של ACT1-CUP1.
   הערה: יש לשמור על התאים על צלחות ומדיה של נשירת לאוצין (-Leu) כדי להבטיח שימור של פלסמידים מדווחים ACT1-CUP1 לאחר שינוי זה.
4. בצע את שלבים 1.2. ו-1.3. עבור כל QSP וכל כתב ACT1-CUP1 פלסמיד להיבדק, כולל זני בקרה.

2. הכנת צלחת נחושת

1. בחר טווח ריכוז נחושת המתאים לכתבים לבדיקה (ראה טבלה 1 לקטלניות של כתבים הנמצאים בשימוש תכוף).
   הערה: דוגמה לטווח ריכוזי נחושת מקיף היא 30 ריכוזי נחושת שונים של 0 mM, 0.025 mM, 0.05 mM, 0.075 mM, 0.1 mM, 0.15 mM, 0.2 mM, 0.25 mM, 0.3 mM, 0.35 mM, 0.4 mM, 0.45 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 מ"מ, 1.5 מ"מ, 1.6 מ"מ, 1.7 מ"מ, 1.8 מ"מ, 1.9 מ"מ, 2.0 מ"מ, 2.25 מ"מ ו-2.5 מ"מ Cu²⁺.
2. צור תמיסת מלאי של 1 M CuSO₄ ומסנן סטרילי באמצעות מסנן סטרילי PES (polyethersulfone) בגודל 0.22 מיקרומטר.
3. לפי צלחת הנחושת הרצויה, הכינו דילול של 2 מ"ל של מלאי CuSO₄ במים סטריליים.
   הערה: מכיוון שהצלחת עם 0 mM Cu 2+ תמיד תנותח ותוצג כהפניה, מומלץ ליצור שתי צלחות 0 mM Cu²⁺, אחת בהתחלה ואחת בסוף שלב הציפוי (שלב 3.4.).
   1. חישוב כמות המלאי עבור ריכוז הנחושת הרצוי הסופי ב-40 מ"ל מנפח הצלחת (טבלה משלימה 1).
   2. הוסף את הכמות המחושבת של מים סטריליים ומלאי 1 M CuSO₄ לצינור סטרילי, 2 מ"ל.
4. יוצקים צלחות לבדיקת ACT1-CUP1.
   הערה: חלופה לפרוטוקול שלהלן היא לשלב בתחילה את המדיה והאגר במיכל גדול ועליקוט לאחר אוטוקלאבינג למכלים קטנים יותר כדי להשיג ריכוזי נחושת שונים עבור כל צלחת. לא משנה באיזו שיטה ננקטת, חשוב לוודא שריכוז המדיה עקבי בין כל הלוחות למרות שלכל אחד מהם יש ריכוז נחושת שונה.
   1. סמן כל צלחת ריקה שיש למזוג עם ריכוז הנחושת הסופי שהיא תכיל. הכינו לפחות צלחת מרובעת אחת לכל ריכוז נחושת לבדיקה.
   2. תייג בקבוק של 100 מ"ל לכל ריכוז נחושת לבדיקה.
   3. לכל בקבוק, יש להוסיף 790 מ"ג אגר (2% עם אגר) וחטיף מוקפץ.
   4. בכוס גדולה, שלב את מצע הצמיחה -Leu כדי שכל לוחות הנחושת יישפכו. בכל צלחת שיש להכין, יש להמיס 265 מ"ג של בסיס חנקן שמרים (YNB) ו-64 מ"ג של תערובת נשירה פחות לאוצין (וכל חומר מזין אחר שעשוי להידרש כדי לשמור על פלסמיד QSP בתאים) ב-34 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה.
   5. הוסיפו 34 מ"ל של תמיסת מדיית הגידול -Leu לכל בקבוק ופקק מוכן של 100 מ"ל עם רדיד אלומיניום. סמן את נייר הכסף בריכוז הנחושת המיועד.
   6. אוטוקלאב כדי לעקר ולהמיס את האגר באמצעות מחזור הנוזל המומלץ עבור האוטוקלב.
   7. בהקדם האפשרי, יש להוסיף 4 מ"ל של 20% גלוקוז (מסונן סטרילי) לכל בקבוק.
   8. התאימו את התוויות והוסיפו את הדילולים של 2 מ"ל של CuSO₄ לבקבוק המיועד.
      הערה: מכיוון שניתן לייצר עשרות לוחות נחושת בו זמנית, כל אחד עם ריכוז שונה, סימון כל הבקבוקים, הצינורות והצלחות בבירור עם ריכוז הנחושת המיועד ימנע בלבול במהלך מזיגת הצלחת.
   9. השתמש בצלחת ערבוב כדי לערבב במשך ~ 30 שניות ולשפוך או פיפט 35 מ"ל לתוך הצלחת המסומנת, הימנעות בועות. יש להניח להתקרר לפני אחסון או שימוש.
      הערה: לעתים קרובות, הצלחות מיוצרות יום אחד או יומיים לפני הבדיקה ומאוחסנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד מספר שעות לפני השימוש. הצלחות צריכות להיות בטמפרטורת החדר (RT) לפני תחילת הציפוי (שלב 3.4).

3. בדיקת ACT1-CUP1

1. פזרו את הזנים הרצויים על צלחות -Leu.
   הערה: אם אתם עובדים ממלאי קריו, יש להקפיד על כך שהתאים יקומו לתחייה מספקת מהאחסון לפני הציפוי. הליך מומלץ לכך הוא לפסוע מהמלאי הקריוגני ולאפשר לו לגדול במשך 3-5 ימים ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, פזרו דוגמית קטנה ואפשרו לה לגדול עוד 2-3 ימים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
2. לגדל תרבויות בן לילה ב 10 מ"ל של מדיה.
   1. הכן את מדיית הצמיחה של Leu באמצעות אותם יחסים כמתואר בשלב 2.4.2. לכל 10 מ"ל של מדיה, יש להוסיף 66 מ"ג של בסיס חנקן שמרים (YNB) ו-16 מ"ג של תערובת נשירה פחות לאוצין ל-9 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה. יש לעבור דרך מסנן סטרילי PES בגודל 0.22 מיקרומטר.
   2. לכל זן שמרים, יש להוסיף 9 מ"ל של מדיית צמיחה -Leu ו-1 מ"ל של 20% w/v גלוקוז (מסונן סטרילי) לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.
   3. בעזרת מקל סטרילי או קצה פיפט, אספו דוגמית קטנה (~1 מ"מ עגולה) של שמרים וחסנו את המדיה.
   4. נערו את כל תרביות הלילה ב-180 סל"ד וב-30 מעלות צלזיוס.
      הערה: אם זמין, ניתן להשתמש בסיבובים במקום בשייקר.
3. דלל את הזנים ל-OD₆₀₀ 0.5 ± 0.05 ב-10% גליצרול.
   1. לכל זן, יש להוסיף 100 μL של תרבית לקובטה המכילה 900 μL מים.
   2. מדוד את OD₆₀₀ באמצעות ספקטרופוטומטר.
   3. חשב את הדילול הנדרש כדי להיות ב- OD₆₀₀ של 0.5 בנפח סופי של 2 מ"ל.
   4. יש לדלל כל זן ל-OD₆₀₀ 0.5 ב-10% גליצרול (סטרילי).
   5. מדוד מחדש את OD₆₀₀ כדי לוודא שצפיפות התאים נמצאת בטווח הרצוי של 0.5 ± 0.05.
4. צלחת את הזנים על לוחות הנחושת.
   הערה: ניתן להשתמש במגוון שיטות כדי לצלוח את הזנים, כולל פיפטר ידני בנפחים של 5-10 μL, שימוש בפיפטטור חוזר או רב-ערוצי, או הטבעה עם משכפל פינים. שיטה אחרונה זו מתוארת להלן, אם כי רוב השלבים יהיו דומים ללא קשר לשיטה.
   1. הגדר מיקום עבודה סטרילי ומבער בונזן מואר.
   2. עבור משכפל 48 פינים, פיפט 200 μL של כל זן מדולל לתוך באר נפרדת של צלחת 96 באר. מלא את החללים הריקים ברשת 6 x 8 עם 200 μL של 10% גליצרול (סטרילי).
      הערה: דוגמה לסכמת ציפוי עבור תשעה זני שמרים נמצאת בטבלה משלימה 2.
   3. טובלים את המשכפל בצלחת רדודה של 95% (v/v) אתנול ולהבה כדי לעקר. תן לו להתקרר לפחות 2 דקות לאחר הלהבה כבה, כדי למנוע חום מזעזע את התאים.
   4. מניחים ארבע צלחות ליד המבער ומסירים את המכסים.
   5. טבלו את המשכפל בצלחת 96 הבארות והרימו אותו בתנועה מהירה אחת.
   6. מניחים בעדינות על הצלחת ומתנדנדים קלות קדימה ואחורה כדי להקל על העברה טובה.
   7. הרם בתנועה מהירה אחת והניח באותו כיוון בדיוק בלוח 96 הבאר.
   8. חזרו על הפעולה לקבלת עד שלוש צלחות נוספות. חזור על התהליך של טבילת המשכפל באתנול, בוער כדי לעקר, ומחכה להתקרר כל ארבע צלחות.
   9. לאחר שצלחת, נעים בתנועה חלקה לצד אך עדיין בתוך מטריית העיקור של הלהבה.
      הערה: מומלץ לבצע את דילול השמרים וציפוי ליד להבה. הצלחות יכולות בקלות להזדהם בזמן הייבוש.
   10. תנו לצלחות להתייבש לחלוטין לפני שאתם מניחים את המכסים, בדרך כלל 3-5 דקות.
   11. לדגור את הצלחות במשך 3 ימים ב 30 מעלות צלזיוס.

4. איסוף וניתוח נתונים

1. הסר את הלוחות מהאינקובטור ובדוק אותם חזותית.
2. הקלט את התמונות של הלוחות באמצעות מצלמה זמינה או מערכת הדמיה דיגיטלית אחרת.
3. שיא (או ניקוד) עבור כל זן את ריכוז הנחושת האחרון נראה לעין צמיחה.
   הערה: התאים מסוגלים לחבור ולהישאר בני קיימא עד לריכוז זה. לקבלת עקביות, השתמש תמיד באותה שיטה, בעין או מתמונות הצלחת, כדי להשיג את ריכוז הנחושת הישים האחרון. מושבות קטנות מאוד נראות לפעמים בעין אך לא בתמונה. ההבדל בין בדיקה חזותית ישירה או הקלטה מתמונות הוא קטן, בדרך כלל שלב בשיפוע. מכיוון שתמונות של המושבות משמשות לעתים קרובות בפרסומים, מומלץ להבקיע לפי התמונות.
4. שלב נתונים ממבחני ACT1-CUP1 מרובים עבור אותו זן כדי להסיק מסקנות לגבי האופן שבו ה-QSP משפיע על השחבור.
   הערה: נתוני הפרסום נוהגים להציג תמונות של מושבות השמרים בריכוז 0 mM Cu²⁺ , ריכוז הנחושת האחרון בר קיימא, והריכוז שלאחר מכן שבו המושבה מתה. ניתן להציג נתונים גם כגרף עמודות עם קווי שגיאה עבור סטיית התקן בין עותקים משוכפלים. אין צורך לנרמל את הנתונים, אך ניתן לעשות זאת על ידי הגדרת הכדאיות של בקרת גורם השחבור WT ל-1 והשוואת ההשפעה של המוטציות(ות) שהוכנסו.

תוצאות

מבחני צמיחה, כמו ACT1-CUP1, דורשים הערכה חזותית והשוואתית של מושבות מרובות. כאן, כל זן גדל לרוויה בן לילה, מדולל_{ל-OD 600} של 0.5, ומצופה על 20 לוחות המכילים טווח של ריכוזי נחושת מ-0 mM עד 1.1 mM CuSO₄ (איור 3). טווח זה קטן יותר מזה המופיע בפרוטוקול מכיוון שהוא מאפשר הערכה מלאה של ההשפע...

Discussion

ACT1-CUP1 הוא מבחן גדילה, ויש לנקוט בזהירות כדי להבטיח שניתן לייחס הבדלי גדילה שנצפו רק לפגמים בשחבור. יש לטפל בכל הזנים באופן דומה לפני הציפוי, כולל אורך וסוג דומים של תנאי גידול ואחסון. אם משתמשים בזנים רגישים לטמפרטורה, יש לבצע בדיקות ACT1-CUP1 רק בתנאים שבהם זנים אלה גדלים באופן דומה לסוג בר. באו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL sterile microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129	Or comparable item from a different manufacturer.
2 mL sterile microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-138	Or comparable item from a different manufacturer.
50 mL sterile centrifuge tubes	Fisher Scientific	07-201-332	Or comparable item from a different manufacturer.
96-well round bottom microplate	Fisher Scientific	07-200-760	Or comparable item from a different manufacturer.
190 proof ethanol	Fisher Scientific	22-032-600	Or comparable item from a different manufacturer.
500 mL Filter System (0.22 µm)	CellTreat Scientific Products	229707	Or comparable item from a different manufacturer.
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500	Any molecular grade agar will work.
Autoclave	Tuttnauer	3870EA	Or comparable item from a different manufacturer.
Bunsen burner	Humboldt	PN6200.1	Or comparable item from a different manufacturer.
Cell Density Meter	VWR	490005-906	Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.
Copper sulfate Pentahydrate	Fisher Scientific	LC134051	Or comparable item from a different manufacturer.
Digital imaging system	Cytiva	29399481	ImageQuant 4000 (used for Figure 3),  Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.
Dropout mix (-Leu)	USBiological Life Sciences	D9525	Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu
D-Glucose	Fisher Scientific	AAA1682836	Or comparable item from a different manufacturer.
Gel band quantifying software	Cytiva	29-0006-05	ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.
Hand held camera	Nikon	D3500	Or comparable item from a different manufacturer.
Near infra-red gel imaging device	Cytiva	29238583	Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade clamp	Fisher Scientific	05-769-7Q	Or comparable item from a different manufacturer.
Laboratory grade stand and clamp	Fisher Scientific	12-000-101	Or comparable item from a different manufacturer.
Magnetic stir bars	Fisher Scientific	14-513-51	Or comparable item from a different manufacturer.
Pin replicator	VP Scientific	VP 407AH
Semi-micro disposable cuvettes	VWR	97000-590	Or comparable item from a different manufacturer.
Shaker	JEIO Tech	IST-3075	Or comparable item from a different manufacturer.
Spectrophotometer	Biowave	80-3000-45	Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.
Square plates	VWR	102091-156	Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.
Stir plate	Fisher Scientific	11-520-16S	Or comparable item from a different manufacturer.
Yeast nitrogen base	USBiological Life Sciences	Y2025	Or comparable item from a different manufacturer.