JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تحدد الدراسة الحالية طريقة قابلة للتكرار وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة لدراسة أحداث إشارات Wnt غير المتعارف عليها في المختبر. تم تطبيق هذا البروتوكول لتقييم تأثير إشارات باراكرين Wnt5a في خلايا القمة العصبية للفئران والأرومات العضلية.

Abstract

تنظم إشارات Wnt غير المتعارف عليها تنظيم خيوط الأكتين داخل الخلايا والهجرة المستقطبة للخلايا السلفية أثناء التطور الجنيني. تتطلب هذه العملية تفاعلات باراكرين معقدة ومنسقة بين خلايا إرسال الإشارات وخلايا استقبال الإشارات. بالنظر إلى أن هذه التفاعلات يمكن أن تحدث بين أنواع مختلفة من الخلايا من سلالات مختلفة ، فإن التقييم في الجسم الحي للعيوب الخاصة بالخلية يمكن أن يكون صعبا. تصف الدراسة الحالية طريقة قابلة للتكرار بدرجة كبيرة لتقييم إشارات Wnt غير المتعارف عليها في المختبر. تم تصميم هذا البروتوكول مع القدرة على (1) إجراء تقييمات وظيفية وجزيئية لإشارات Wnt غير المتعارف عليها بين أي نوعين من الخلايا ذات الأهمية. (2) تشريح دور جزيئات إرسال الإشارات مقابل جزيئات استقبال الإشارات في مسار إشارات Wnt غير المتعارف عليه ؛ و (3) إجراء تجارب إنقاذ النمط الظاهري باستخدام الأساليب الجزيئية أو الدوائية القياسية.

تم استخدام هذا البروتوكول لتقييم إشارات Wnt غير المتعارف عليها بوساطة خلية القمة العصبية (NCC) في الأرومات العضلية. يرتبط وجود NCCs بزيادة عدد الفيلوبوديا السيتوبلازمية الإيجابية للقضيب والصفيحيات في الأرومات العضلية وتحسين هجرة الأرومة العضلية في مقايسة التئام الجروح. تم تحديد محور Wnt5a-ROR2 على أنه مسار إشارات Wnt غير قانوني حاسم بين NCC وأسلاف الأرومة العضلية القلبية في مجال القلب الثاني (SHF). في الختام ، هذا بروتوكول قابل للتتبع للغاية لدراسة آليات إشارات Wnt غير المتعارف عليها في المختبر.

Introduction

إشارات Wnt غير المتعارف عليها هي مسار محفوظ تطوريا ينظم تنظيم الخيوط الخلوية والهجرة الاتجاهية. وقد تورط هذا المسار في عمليات بيولوجية متعددة ، بما في ذلك تشكل الأنسجة الجنينية1،2،3 ، وتكوين الأوعية الدموية اللمفاوية والأوعية الدموية4،5،6،7 ، ونمو السرطان وورم خبيث8،9،10 . على المستوى الخلوي ، يتم تنفيذ إشارات Wnt غير المتعارف عليها من خلال تفاعلات paracrine المنسقة بين خلايا إرسال الإشارات واستقبال الإشارات. تحدث هذه التفاعلات بشكل متكرر بين الخلايا من سلالات أو أنواع مختلفة وتتضمن شبكة جزيئية متنوعة تشمل ما يصل إلى 19 رابطا ومستقبلات متعددة ومستقبلات مشتركة ومستجيبات نقل إشارة المصب11. ومما يزيد من تعقيد عملية الإشارات هذه ، أظهرت الدراسات السابقة أن مجموعات مستقبلات الرباط يمكن أن تختلف بطريقة تعتمد على السياق والأنسجة 12,13 ، وأن نفس روابط المصدر التي تقود إشارات Wnt غير المتعارف عليها في خلايا استقبال الإشارة يمكن إنتاجها بواسطة أنواع متعددة من الخلايا المرسلة للإشارات 14,15 . نظرا للتعقيد الخلوي والجزيئي المرتبط بإشارات Wnt غير المتعارف عليها ، كانت القدرة على دراسة الآليات الفردية وذات الصلة سريريا في الجسم الحي محدودة.

بذلت محاولات لدراسة إشارات Wnt غير المتعارف عليها باستخدام تقنيات زراعة الخلايا في المختبر. على سبيل المثال ، تم استخدام فحوصات التئام الجروح التي يتم إجراؤها في أحاديات الطبقة الخلوية لتقييم الهجرة الاتجاهية الخلويةوظيفيا 4،16،17،18،19. تم استخدام تقنيات التلوين المناعي لإجراء تحليلات مكانية لتعبير البروتين السطحي لتقييم التغيرات غير المتعارف عليها Wnt في التشكل الخلوي7،10 ، والهندسة المعمارية ، والاستقطاب غير المتماثل18،19،20. على الرغم من أن هذه الأساليب قد وفرت أدوات مهمة لتوصيف الأنماط الظاهرية المرتبطة ب Wnt في خلايا استقبال الإشارات ، إلا أن عدم وجود مكونات إرسال إشارة في هذه البروتوكولات يحد من قدرتها على نمذجة آليات إشارات paracrine بدقة والتي لوحظت في الجسم الحي. نتيجة لذلك ، لا تزال هناك حاجة ماسة لتطوير أنظمة في المختبر تسمح بإجراء تقييم قوي وقابل للتكرار لتفاعلات إشارات paracrine بين خلايا إرسال الإشارات وتلقيها لمسار Wnt غير المتعارف عليه ، لا سيما تلك الخاصة بأنواع الخلايا المختلفة.

تحقيقا لهذه الغاية ، كان الهدف الأساسي من هذه الدراسة هو إنشاء بروتوكول لنمذجة تفاعلات إشارات Wnt غير المتعارف عليها في المختبر. لقد طورنا نظام زراعة مشتركة غير متصل يلخص مكونات إرسال الإشارات واستقبال الإشارات لهذه التفاعلات ويسمح باستخدام الأساليب الجزيئية أو الجينية أو الدوائية القياسية لدراسة آليات مستقبلات الليجند المحددة بشكل مستقل في مسار Wnt غير القانوني. تم فحص آليات إشارات Wnt بوساطة NCC في الأرومات العضلية باستخدام خطوط خلايا الفئران الثابتة. كدليل على المبدأ ، تم استخدام هذا النموذج لتأكيد نتائج الدراسات السابقة في الجسم الحي في الفئران التي تورط محور Wnt5a-ROR2 كمسار إشارات Wnt غير قانوني ذي صلة بين NCCs21 وأسلاف الأرومة العضلية القلبيةSHF 3،22،23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. التوسع قبل التجريبي وتمرير الخلايا

  1. ثقافة الخلايا C2C12:
    1. قم بإعداد 500 مل من وسط الاستزراع C2C12 من خلال الجمع بين وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
    2. قم بإذابة قارورة من خلايا C2C12 في حمام مائي 37 درجة مئوية. أثناء ذوبان خلايا C2C12 ، أضف 5 مل من وسط C2C12 إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. انقل الخلايا المذابة على الفور إلى أنبوب 15 مل باستخدام ماصة P1000.
      ملاحظة: خلايا C2C12 هي خلايا الأرومة العضلية للفأر التي تم استخدامها سابقا والتحقق من صحتها كخط خلية أولي لنمذجة أسلاف الأرومة العضلية القلبية.
    3. امزج خلايا C2C12 برفق في الأنبوب المخروطي باستخدام ماصة مصلية. بعد ذلك ، أضف الحجم الكامل للخلايا المذابة في وسط C2C12 (6 مل) إلى دورق 75 سم2 .
    4. أضف 6 مل من وسط C2C12 الطازج إلى الدورق ليصبح حجمه الإجمالي 12 مل. قم بتدوير القارورة برفق بحيث يغطي محلول الخلية والوسائط الجزء السفلي من القارورة بالكامل. ضع القارورة في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) للسماح للخلايا بالالتصاق.
    5. اسمح للخلايا بالتوسع في الحاضنة حتى تصل إلى ~ 60٪ التقاء.
      ملاحظة: يمكن تحديد ذلك عن طريق إزالة الخلايا بشكل دوري من الحاضنة والتحقق بسرعة من التقائها تحت المجهر. تأكد من تقليل الوقت الذي تتم فيه إزالة الخلايا من الحاضنة.
  2. تمرير خلايا C2C12:
    1. قم بتسخين وسط C2C12 ، و 500 مل من 1x PBS ، و 0.25٪ تربسين-EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد تسخين الكواشف ، انقل جميع الكواشف إلى غطاء زراعة الخلية.
    2. أحضر الدورق الذي يحتوي على خلايا C2C12 إلى غطاء زراعة الخلية. اشطف القارورة التي تحتوي على خلايا C2C12 برفق باستخدام 1x PBS الدافئ مرتين.
      1. قم بإمالة القارورة بزاوية 45 درجة واستنشاق وسط C2C12 باستخدام ماصة زجاجية متصلة بالشفط الفراغي. مع الحفاظ على زاوية 45 درجة ، أضف بعناية 10 مل من 1x PBS الدافئ إلى زاوية القارورة باستخدام ماصة مصلية. ضع القارورة بشكل مسطح على السطح وحرك القارورة برفق بحركات دائرية للتأكد من أن 1x PBS يغسل فوق الطبقة الأحادية بأكملها من الخلايا.
        ملاحظة: احرص على عدم تعطيل الطبقة الأحادية C2C12 أثناء شفط الوسط.
    3. قم بإزالة 1x PBS بعد الغسيل الثاني. أضف 1 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA إلى القارورة ، وحرك القارورة برفق كما هو موضح أعلاه للسماح لمحلول التربسين-EDTA بالانتشار على أكبر قدر ممكن من الطبقة الأحادية ووضع القارورة في الحاضنة لمدة 2 دقيقة.
    4. بعد 2 دقيقة من الحضانة ، قم بإزالة القارورة من الحاضنة واضغط عليها برفق لفصل أي خلايا متبقية.
    5. أضف 9 مل من وسط C2C12 إلى القارورة باستخدام ماصة مصلية لإخماد التربسين. باستخدام ماصة المصلية ، شطف الخلايا برفق مع الوسط وجمع 10 مل من تعليق الخلايا التربسينية. أضف 10 مل من معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
    6. أعد الأنبوب المخروطي إلى غطاء زراعة الخلية وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة زجاجية متصلة بالشفط الفراغي. أثناء استنشاق المادة الطافية ، احرص على عدم تعطيل حبيبات الخلية في قاع الأنبوب المخروطي. للقيام بذلك ، اترك ~ 0.2 مل من المادة الطافية في الأنبوب المخروطي. أعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط C2C12 الطازج.
    7. لمزيد من المرور ، أضف 1 مل من الخلايا المعاد تعليقها إلى دورق 75 سم2 . أضف 11 مل من وسط C2C12 إلى القارورة باستخدام ماصة مصلية وضع القارورة في الحاضنة.
  3. زراعة خلايا STO:
    1. قم بإعداد وسط استزراع STO عن طريق صنع 500 مل من DMEM مع 7٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين و 2 نانومتر L-glutamine.
    2. تحضير 0.1 ٪ الجيلاتين عن طريق إضافة 0.5 غرام من مسحوق الجيلاتين إلى زجاجة تحتوي على 500 مل من المياه من الدرجة الأنسجة أو التعقيم. أضف 7 مل من محلول الجيلاتين 0.1٪ إلى دورق 75 سم2 . قم بتدوير القارورة بحيث يغطي محلول الجيلاتين الجزء السفلي من القارورة بالكامل. دع القارورة تحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غطاء زراعة الخلية.
    3. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، قم بإزالة الجيلاتين الزائد باستخدام ماصة متصلة بالشفط الفراغي. دع القوارير تبقى في الحاضنة لمدة 30 دقيقة أخرى قبل الاستخدام.
    4. قم بإذابة قارورة من خلايا STO في حمام مائي 37 درجة مئوية. باستخدام ماصة P1000 ، انقل الخلايا المذابة على الفور إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من وسط استزراع STO الطازج.
      ملاحظة: خلايا STO هي خلايا ليفية جنينية للفئران تستخدم بشكل روتيني كخلايا مغذية في بروتوكولات زراعة الخلايا.
    5. امزج الخلايا الموجودة في الأنبوب المخروطي برفق باستخدام ماصة مصلية. أضف الحجم الكامل (6 مل) من الخلايا إلى دورق مغلف بالجيلاتين 75 سم2 . قم بتدوير الدورق للتأكد من توزيع معلق الخلية جيدا على طول الجزء السفلي من القارورة.
    6. أضف 6 مل من وسط STO الطازج إلى القارورة بحجم إجمالي 12 مل. قم بتدوير الدورق كما هو موضح أعلاه للتأكد من توزيع الخلايا والوسط بشكل جيد على طول الجزء السفلي من الدورقة. ضع القارورة في حاضنة 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالالتصاق. اسمح للخلايا بالتكاثر في الحاضنة حتى تصل إلى التقاء ~ 60-70٪.
  4. تمرير خلايا STO:
    1. وسط خلية STO دافئ ، 1xPBS ، و 0.25٪ تربسين-EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. اشطف القارورة التي تحتوي على خلايا STO برفق باستخدام برنامج تلفزيوني دافئ 1x مرتين كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.1.
    3. أضف 1 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA إلى القارورة باستخدام ماصة P1000. ضع القارورة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. بعد 5 دقائق من الحضانة ، قم بإزالة القارورة من الحاضنة. اضغط برفق على القارورة لفصل أي خلايا ملتصقة.
    5. أضف 9 مل من وسط STO إلى القارورة لإخماد التربسين وجمع 10 مل من معلق الخلايا التربسينية كما هو موضح أعلاه. أضف 10 مل من معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
    6. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط STO كما هو موضح أعلاه. لمزيد من المرور ، أضف 1 مل من الخلايا المعاد تعليقها إلى دورق 75 سم2 . أضف 11 مل من وسط STO ، وقم بتدوير القارورة لضمان التوزيع المتساوي للخلايا والوسط على طول الجزء السفلي من القارورة ، وضع القارورة في الحاضنة.
  5. زراعة خلايا STO غير النشطة وإعداد الوسط القاعدي للخلية O9-1:
    1. تحضير وسط الاستزراع القاعدي للخلايا O9-1 عن طريق خلط 500 مل من DMEM مع 15٪ FBS ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 2 نانومتر L-جلوتامين ، 0.1 مللي متر كحد أدنى من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، 1 نانومتر بيروفات الصوديوم ، و 55 ميكرومتر بيتا ميركابتوإيثانول.
    2. تحضير محلول ميتومايسين سي في 1x PBS بتركيز 0.5 مجم / مل بإضافة 4 مل من 1x PBS مباشرة إلى قارورة ميتوميسين سي. ماصة الحل عدة مرات مع ماصة P1000. لمزيد من إذابة الميتوميسين C في 1x PBS ، ضع القارورة على خلاط دوامة أو هزاز منضدة لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة.
    3. قم بإلغاء تنشيط خلايا STO عن طريق معالجة ألواح STO بتركيز نهائي قدره 0.01 مجم / مل ميتوميسين C مضاف إلى وسط STO القياسي. ضع ألواح STO داخل الحاضنة لمدة 2 ساعة ، مع الحرص على حماية القارورة التي تحتوي على ميتوميسين C من الضوء عن طريق تقليل الوقت الذي يقضيه خارج الحاضنة. بعد علاج الميتوميسين ، اغسل الخلايا في 1x PBS مرتين كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.1.
      ملاحظة: يمنع ميتوميسين C تكاثر خلايا STO بحيث يمكن استخدامها لتوليد وسط مكيف على مدى عدة أيام دون أن تصبح مفرطة في الدورقة.
    4. بعد إزالة 1x PBS ، أضف 12 مل من وسط الاستزراع القاعدي O9-1 إلى مزارع خلايا STO المعطلة واحتضانها لمدة 24 ساعة. اجمع وسط الاستزراع القاعدي STO + O9-1 المشروط والمعطل وضعه في أنابيب مخروطية سعة 50 مل ملفوفة بورق لحمايته من الضوء.
    5. أضف 12 مل من وسط الاستزراع القاعدي O9-1 الطازج إلى مزارع خلايا STO المعطلة كما هو موضح أعلاه. كرر هذه الخطوة بإضافة وسط استزراع قاعدي O9-1 جديد إلى نفس الأجنحة التي تحتوي على خلايا STO المعطلة كل 24 ساعة.
      ملاحظة: بعد علاج ميتوميسين سي ، لا يمكن أن تتكاثر خلايا STO المعطلة ؛ وبالتالي ، يمكن إعادة استخدام القوارير التي تحتوي على خلايا STO المعطلة لتوليد وسيط مشروط.
    6. قم بتخزين الأنابيب المخروطية المغلفة بالرقائق سعة 50 مل والتي تحتوي على وسط استزراع قاعدي مشروط ومعطل STO + O9-1 عند 4 درجات مئوية حتى يتم جمع إجمالي 500 مل من الوسط.
  6. O9-1 ثقافة الخلية:
    1. تحضير وسط زراعة الخلايا O9-1 باستخدام 500 مل من الوسط القاعدي المشروط STO + O9-1 ، وإضافة 103 وحدات من العامل المثبط لسرطان الدم (LIF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي 25 نانوغرام / مل (FGF الأساسي).
    2. تحضير 0.1٪ قوارير مغلفة بالجيلاتين كما هو موضح في الخطوات 1.3.2-1.3.3.
    3. قم بإذابة قارورة من خلايا O9-1 في حمام مائي 37 درجة مئوية. انقل الخلايا المذابة على الفور إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من وسط نمو O9-1 الطازج.
      ملاحظة: خط الخلية O9-1 هو خط خلية القمة العصبية الوحيد المستقر ومتعدد القدرات الذي تم إنشاؤه من الماوس. يستخدم خط الخلية هذا بشكل شائع في القمة العصبية في التجارب المختبرية .
    4. امزج الخلايا برفق باستخدام ماصة مصلية. أضف 6 مل من الخلايا بالكامل إلى دورق 75 سم2 مغلف بالجيلاتين.
    5. أضف 6 مل من وسط نمو O9-1 إلى القارورة لحجم إجمالي قدره 12 مل. ضع القارورة في حاضنة 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالالتصاق. اسمح للخلايا بالتكاثر في الحاضنة حتى تصل إلى التقاء ~ 60-70٪.
  7. تمرير خلايا O9-1:
    1. وسط نمو O9-1 دافئ ، 1x PBS ، و 0.25٪ تربسين-EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. اشطف اللوحة التي تحتوي على خلايا O9-1 برفق باستخدام برنامج تلفزيوني دافئ 1x مرتين كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.1.
    3. أضف 1 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA إلى القارورة وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. بعد 5 دقائق من الحضانة ، أخرج القارورة من الحاضنة واضغط على القارورة برفق لفصل أي خلايا ملتصقة.
    5. أضف 9 مل من وسط نمو O9-1 إلى القارورة لإخماد التربسين. اجمع 10 مل من معلق الخلايا التربسينية وأضف 10 مل من هذا التعليق الخلوي إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
    6. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط نمو O9-1. للحصول على تمرير إضافي ، أضف 1 مل من الخلايا المعاد تعليقها إلى دورق 75 سم2 . أضف 11 مل من وسط نمو O9-1 وضع القارورة التي تحتوي على الخلايا في 12 مل من الوسط في حاضنة 37 درجة مئوية.

2. تصفيح الخلايا في نظام الاستزراع المشترك

  1. طلاء غرف الخلايا C2C12:
    1. بعد التربسين (كما هو موضح في الخطوة 1.2) ، أعد تعليق حبيبات الخلية C2C12 في 10 مل من وسط C2C12. قم بتخفيف الخلايا بنسبة 1:20 في وسط C2C12 عن طريق إزالة 0.5 مل من خلايا C2C12 المعاد تعليقها وإضافتها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل يحتوي على 9.5 مل من وسط C2C12 الطازج. امزج التعليق برفق مع ماصة مصلية.
    2. أضف 1 مل من خلايا C2C12 المخففة 1:20 إلى كل بئر من بئر جديد مكون من 4 غرف باستخدام ماصة P1000 وضع البئر المكون من 4 غرف في الحاضنة.
  2. تصفيح O9-1 إدراج الخلية:
    1. بعد التربسين, إعادة تعليق بيليه خلية O9-1 في 10 مل من وسط نمو O9-1. قم بتخفيف الخلايا بنسبة 1:20 في وسط نمو O9-1 عن طريق إزالة 0.5 مل من خلايا C2C12 المعاد تعليقها وإضافتها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل يحتوي على 9.5 مل من وسط نمو O9-1 الطازج. امزج التعليق برفق مع ماصة مصلية.
    2. ضع ملحقا واحدا قابلا للنفاذ (انظر جدول المواد) داخل كل بئر في بئر جديد مكون من 4 غرف مملوء ب 1 مل من وسط نمو O9-1.
      ملاحظة: يجب أن يكون هذا البئر المكون من 4 غرف مختلفا عن البئر الذي يحتوي على خلايا C2C12 من الخطوة 2.1.3.
    3. أضف 300 ميكرولتر من معلق الخلية O9-1 المخفف إلى كل ملحق باستخدام ماصة P1000. تأكد من غمر الجزء السفلي من كل ملحق داخل البئر المملوء ب 1.3 مل من وسط نمو O9-1. ضع البئر في حاضنة 37 درجة مئوية.
  3. (اختياري). قم بإجراء ضربة قاضية siRNA في خلايا O9-1 أو خلايا C2C12.
    1. قم بإجراء ضربة قاضية للجين بواسطة siRNA 18-24 h بعد طلاء إما إدخالات خلية O9-1 أو آبار غرفة الخلية C2C12.
      1. قم بتخفيف siRNA وكاشف النقل في وسط مصل مختزل (انظر جدول المواد) وفقا لتوصيات الشركات المصنعة والتركيزات المطلوبة للتجربة. اخلطي برفق siRNA المخفف وكاشف النقل (1: 1) واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق.
        ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم استخدام تركيزات 50 نانومتر حيث تم تحديد تركيز siRNA هذا ليؤدي إلى ضربة قاضية كافية للتعبير الجيني المستهدف.
      2. أضف مجمعات الدهون siRNA إما إلى إدخالات خلية O9-1 أو آبار غرفة الخلية C2C12 على النحو الذي يحدده التصميم التجريبي واحتضان الخلايا بمجمعات الدهون siRNA لمدة ~ 36-48 ساعة.

3. إجراء فحص الجروح والتقييم الكمي لهجرة الأرومة العضلية

  1. فحص الجرح:
    1. اسمح لإدخالات الخلية O9-1 وآبار غرفة الخلية C2C12 بالالتصاق والتكاثر في الحاضنة حتى تصل كلتا الخليتين إلى التقاء ~ 70-80٪ قبل متابعة هذا الجزء من البروتوكول. إذا نمت الخلايا بنسبة >90٪ ، فلا تتابع فحص الخدش ، لأن الخلايا ستنفصل فقط عن البئر.
    2. قم بتسخين 1x PBS و C2C12 المتوسطة بوضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    3. قم بإزالة الوسط الطافي من غرفة C2C12 جيدا واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS. قم بإزالة 1x PBS وخدش الخلايا على الفور بطرف ماصة P10 معقم.
      1. مرر طرف ماصة P10 المعقم بإحكام في اتجاه واحد ليمتد بطول أو عرض الطبقة الأحادية للخلية بالكامل (على سبيل المثال ، من اليمين إلى اليسار ، من أعلى إلى أسفل). تأكد من خدش كل بئر تحتوي على خلايا مرة واحدة فقط.
        ملاحظة: لتحسين نتائج الخدش ، خدش الآبار ذات الظروف التجريبية المختلفة عند مستوى التقاء مماثل. للقيام بذلك ، تأكد من أن كل بئر مكون من 4 غرف يحتوي على خلايا لكل حالة تجريبية مطلوبة (على سبيل المثال ، التحكم السلبي # 1 ، التحكم الإيجابي # 2). بالإضافة إلى ذلك ، استخدم ماصة P10 معقمة جديدة لكل خدش وقم بتطبيق مقدار مماثل من القوة على الماصة في كل مرة. لا تحاول إنشاء أكثر من خدش واحد في كل بئر.
      2. بعد الخدش ، أضف بسرعة 1 مل من 1x PBS مرة أخرى إلى البئر باستخدام طرف ماصة P1000. كرر هذه العملية لكل بئر سيتم خدشه.
        ملاحظة: نظرا للتباين المرتبط بكل خدش ، يوصى باستخدام آبار متعددة (ن = 3) لإنشاء الجرح في كل حالة تجريبية. اعمل على وجه السرعة لأنه من الأهمية بمكان تقليل المدة التي تكون فيها الخلايا بدون 1x PBS أثناء هذه الخطوات. بعد إزالة 1x PBS من كل بئر ، لا ينبغي للمرء أن يأخذ أكثر من 5 ثوان لتوليد جرح في كل بئر.
    4. بعد توليد جرح وإضافة 1x PBS مرة أخرى إلى كل بئر ، قم بتصوير الخدش باستخدام مجهر مقلوب برايتفيلد واستخدم هذه الصورة كحجم الجرح الأساسي (الوقت 0). لالتقاط الصور ، قم بتنفيذ الخطوات التالية:
      1. قم بتشغيل الكمبيوتر والمجهر (انظر جدول المواد) بالضغط على زر الطاقة. ضع شريحة الحجرة على المسرح وقم بتدوير قرص الهدف إلى تكبير 5x.
      2. افتح برنامج التصوير (انظر جدول المواد) بالنقر المزدوج فوق رمز البرنامج على سطح مكتب الكمبيوتر. انقر فوق علامة التبويب الكاميرا على الشاشة الرئيسية للبرنامج. انقر فوق الزر Live لتصور الخلايا الموجودة في علامة التبويب AxioCam IC .
      3. تأكد من سحب مرشح الضوء بالكامل للسماح للضوء بالمرور إلى الكاميرا وشاشة الكمبيوتر. حرك و/أو قم بتدوير شريحة الحجرة يدويا لوضع منطقة الجرح في وسط الصورة الحية على علامة التبويب AxioCam IC .
      4. لالتقاط الصور، انقر فوق محاذاة لفتح علامة تبويب جديدة بجوار علامة التبويب AxioCam IC التي تحتوي على الصورة.
      5. لحفظ هذه الصورة الثابتة ، انقر فوق ملف في الجزء العلوي الأيسر من الصفحة الرئيسية للبرنامج | حفظ باسم | أدخل اسم الملف في مربع اسم الملف . احفظ الشكل بتنسيق Carl Zeiss image (*.czi) (الإعداد الافتراضي)، وحدد desktop على الشريط الموجود على اليسار لحفظ الملف على سطح المكتب كملف . czi ، والذي لا يمكن فتحه إلا في برنامج Zen lite 2012.
      6. لحفظ الصورة كملف .tiff، انقر فوق ملف | حفظ باسم | أدخل اسم الملف في المربع اسم الملف. احفظ الشكل كملف صورة موسومة (*.tiff) بالنقر فوق الزر حفظ كنوع وتحديد *.tiff من القائمة المنسدلة.
        ملاحظة: يمكن فتح تنسيق .tiff في أي برنامج لمعالجة الصور.
      7. قم بتغيير موضع شريحة الحجرة يدويا لالتقاط 2-3 صور أخرى في نقاط أخرى من الجرح في نفس البئر.
        ملاحظة: في المجموع ، سيؤدي ذلك إلى 3-4 صور غير متداخلة وعالية التكبير للجرح في كل بئر.
    5. قم بإزالة 1x PBS من كل بئر وأضف 1 مل من وسط C2C12.
      ملاحظة: احرص على عدم استخدام الماصة بقوة شديدة عند إزالة أو إضافة محاليل إلى الغرفة جيدا بعد توليد الجرح ، لأن هذا قد يتسبب في انفصال الخلايا عن بئر الغرفة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإمالة الغرفة جيدا بحيث يمكن إجراء الشفط وإعادة إدخال المحاليل في زوايا كل بئر لتقليل اضطراب الطبقة الأحادية للخلية.
    6. قم بتجميع نظام الاستزراع المشترك لإدخال البئر عن طريق وضع الإدخالات التي تحتوي على خلايا O9-1 يدويا في كل بئر من بئر الغرفة. ادفع الإدخالات برفق لأسفل في البئر بحيث يقع الجزء السفلي من الإدخال فوق خلايا C2C12 الأساسية مباشرة. أعد تركيبات إدراج البئر إلى الحاضنة.
      ملاحظة: لا تسمح للجزء السفلي من الملحق باللمس المادي وتعطيل خلايا C2C12 الأساسية ميكانيكيا.
    7. اسمح للخلايا بالترحيل لمدة 9-12 ساعة. لتحديد وقت الترحيل الأمثل ، تحقق من الخلايا في 6 ساعات بعد إنشاء الجرح ، ثم كل 2-3 ساعات بعد ذلك. قم بإنهاء التجربة عندما تبدأ الخلايا المسيطرة أو ظروف التحكم الإيجابية في تغطية الجرح بالكامل.
      ملاحظة: نظرا لطبيعة عدم الاتصال للبناء ، لا يلزم إزالة الملحق العلوي من الآبار عند التحقق من تقدم ترحيل الفاصل الزمني. سيتم ملاحظة تباين الهجرة اعتمادا على عوامل مثل أنواع الخلايا المستخدمة في هذا الفحص ، والكثافة الخلوية في وقت توليد الجرح ، وعرض الجرح الذي تم إنشاؤه ، والظروف التجريبية للخلايا التي تم التلاعب بها (على سبيل المثال ، ضربة قاضية للجينات ، إضافة البروتين المؤتلف). يجب تحديد تركيزات هذه الكواشف تجريبيا بتوجيه من توصيات الشركة المصنعة.

4. تلطيخ المناعي وتصوير الخلايا العضلية المهاجرة

  1. إنهاء فحص الترحيل وتفكيك نظام إدخال البئر:
    1. قم بإزالة إدخالات الخلية O9-1 بعد فترة ترحيل 9-12 ساعة (أو وقت بديل تحدده الظروف التجريبية). استنشاق وسط C2C12 بعناية باستخدام ماصة P1000. أضف 0.5 مل من 1x PBS إلى آبار الغرفة ، والتقط صورا نهائية للخلايا بعد الترحيل.
    2. استنشاق بعناية كل 0.5 مل من 1x PBS مختلطة مع وسيط وإزالة الغرف البلاستيكية من آبار الغرفة باستخدام تعليمات المجموعة ، وترك الشريحة الأساسية التي تحتوي على خلايا C2C12.
      ملاحظة: احرص على عدم تعطيل خلايا C2C12 الملتصقة بالشريحة عند إزالة آبار الغرفة.
  2. أداء التلوين المناعي:
    1. ضع الشريحة على الفور في حامل منزلق يحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اسكب 4٪ PFA وأضف 0.1٪ Triton X-100 المحتوي على 1x PBS (1x PBST) إلى حامل الشريحة لغسل الشريحة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اسكب 1x PBST وأضف 1x PBS إلى حامل الشريحة لغسل الشريحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة مرة أخرى لما مجموعه غسلتين 1x PBS.
    2. قم بإزالة الشريحة من حامل الشريحة. تتبع الحواف الخارجية للشريحة باستخدام قلم كاره للماء لإنشاء حدود كارهة للماء حول الشريحة لمنع انسكاب المحاليل من الشريحة. احرص على عدم تعطيل الخلايا الملتصقة.
    3. أضف محلول حجب ألبومين مصل البقر (BSA) بنسبة 1٪ (مخفف في 1x PBS) إلى الشريحة (~ 0.5 مل لكل شريحة). تأكد من احتواء المحلول داخل الحدود الكارهة للماء التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.4. احتضان الشريحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة شريحة مرطبة.
      ملاحظة: على الرغم من أن حجب BSA غير مطلوب للتلطيخ المناعي للقضيب ، فإن هذه الخطوة في البروتوكول تسمح بالاقتران مع تلطيخ الأجسام المضادة الفلورية.
    4. بعد الحجب لمدة 1 ساعة ، اسكب محلول الحجب من الشريحة ، وأضف الجسم المضاد phalloidin (المخفف إلى 1: 200 في محلول حجب BSA بنسبة 1٪ عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من الجسم المضاد إلى 995 ميكرولتر من محلول BSA) إلى الشريحة واحتضانها عند 4 درجات مئوية طوال الليل. مرة أخرى ، تأكد من احتواء المحلول داخل الحدود الكارهة للماء التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.4. بالنظر إلى أن الجسم المضاد phalloidin مقترن بصبغة Alexa Fluor-488 ، قلل من التعرض للضوء لكاشف الأجسام المضادة قبل وبعد الإضافة إلى الشريحة.
    5. في اليوم التالي، ضع الشريحة في حامل منزلق محمي من التعرض للضوء (على سبيل المثال، لف حامل الشريحة بورق أو استخدم حامل منزلق غير شفاف). اغسل الخلايا الموجودة في حامل الشرائح باستخدام 1x PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الغسيل لمدة ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق.
    6. أضف 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) - وسيط تركيب يحتوي على وركب الشرائح بأغطية زجاجية. قم بتصوير الخلايا التي هاجرت باستخدام مجهر مضان قياسي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

آثار NCCs على القدرة المهاجرة للأرومات العضلية للفئران
تم تطبيق هذا الاختبار لأول مرة لتقييم تأثير NCCs على القدرة المهاجرة للخلايا العضلية. يوضح الشكل 1 النموذج التخطيطي للفحص. لاختبار هذا التأثير ، تم إجراء فحوصات الخدش باستخدام الأرومات العضلية التي نمت في عزلة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يعد مسار إشارات Wnt / قطبية الخلية المستوية (PCP) غير المتعارف عليه مسارا للإشارات الخلوية مهما للغاية وقد تورط في عمليات تنموية متعددة 24,25 ومرض24,26. أثناء التطور الجنيني ، تتضمن إشارات Wnt غير المتعارف عليها شبكة موسعة من الإش...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال جوائز المعاهد الوطنية للصحة F30HL154324 إلى O.T. و K08HL121191 و R03HL154301 إلى SRK. يود المؤلفون أن يعترفوا بأن المخطط في الشكل 1 في هذه المخطوطة تم إنشاؤه باستخدام biorender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma AldrichM-7522
Antifade mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200-10Stored at 4 °C
Bovine serum albuminSanta Cruz Biotechnologysc-2323Stored at 4 °C
C2C12 murine myoblast cell lineATCCCRL-1772
Cell culture flasks, 75 cm2ThermoFisher Scientific156499
Chamber Slide System, 4-wellThermoFisher Scientific154526
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM)Corning10-017-CVStored at 4 °C
Falcon conical centrifuge tubes, 15 mLFisher Scientific14-959-53A
Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membraneCorning353095
Fetal bovine serumFisher ScientificW3381EStored in 50 mL aliquots at -20 °C
Gelatin solution, 0.1%ATCCPCS-999-027Stored at 4 °C
Graduated and sterile pipette tips, 10 µLUSA Scientific1111-3810
Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mLMillipore SigmaESG1106
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100xGibco11140-050
Minimum essential medium (MEM)Corning10-022-CV
Mitomycin CRoche10107409001
Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mmSpringside ScientificHRTCG2455
O9-1 neural crest cell lineMillipore SigmaSCC049
Opti-MEM I, 1xGibco31985-070
Paraformaldehyde solution in PBS, 4%Santa Cruz Biotechnologysc-281692Stored at 4 °C
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin)Fisher ScientificW3470HStored in 10 mL aliquots at -20 °C
Phalloidin-iFluor 488Abcamab176753Stored at -20 °C, Keep out of light
Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4Corning21-040-CVStored at 4 °C
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)R&D Systems233-FB-025
Recombinant human/mouse Wnt5a proteinR&D Systems645-WN-010
Sodium pyruvate, 100 mMGibco11360-070
Square Petri dish with gridThomas Scientific1219C98
STO murine fibroblast feeder cellsATCCCRL-1503
Triton X-100 solutionSigma AldrichX100-100ML
Trypsin-EDTA, 0.25%Fisher ScientificW3513CStored at 4 °C
Zeiss Apotome.2 fluoresence microscopeCarl Zeiss AG
Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscopeCarl Zeiss AG
Zen lite 2012 microscopy softwareCarl Zeiss AGimaging software

References

  1. Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
  2. Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093(2019).
  3. Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719(2019).
  4. Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).
  5. Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).
  6. Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
  7. Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
  8. Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
  9. Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
  10. Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
  11. Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
  12. Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
  13. Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).
  14. Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
  15. Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305(2016).
  16. Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
  17. Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456(2010).
  18. Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
  19. Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).
  20. Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
  21. Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).
  22. Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
  23. Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
  24. Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
  25. Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).
  26. Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
  27. Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
  28. Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).
  29. Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
  30. Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
  31. Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).
  32. Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).
  33. Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved