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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente studio delinea un metodo altamente riproducibile e trattabile per studiare gli eventi di segnalazione Wnt paracrini non canonici in vitro. Questo protocollo è stato applicato per valutare l'impatto della segnalazione paracrina Wnt5a nelle cellule della cresta neurale murina e nei mioblasti.

Abstract

La segnalazione Wnt non canonica regola l'organizzazione intracellulare del filamento di actina e la migrazione polarizzata delle cellule progenitrici durante l'embriogenesi. Questo processo richiede interazioni paracrine complesse e coordinate tra le cellule che inviano e ricevono il segnale. Dato che queste interazioni possono verificarsi tra vari tipi di cellule di diversi lignaggi, la valutazione in vivo dei difetti specifici delle cellule può essere difficile. Il presente studio descrive un metodo altamente riproducibile per valutare la segnalazione Wnt paracrina non canonica in vitro. Questo protocollo è stato progettato con la capacità di (1) condurre valutazioni funzionali e molecolari della segnalazione Wnt non canonica tra due tipi di cellule di interesse; (2) analizzare il ruolo delle molecole che inviano il segnale rispetto a quelle che ricevono il segnale nella via di segnalazione Wnt non canonica; e (3) eseguire esperimenti fenotipici di salvataggio con approcci molecolari o farmacologici standard.

Questo protocollo è stato utilizzato per valutare la segnalazione Wnt non canonica mediata dalle cellule della cresta neurale (NCC) nei mioblasti. La presenza di NCC è associata ad un aumento del numero di filopodi citoplasmatici e lamellipodi positivi alla falloidina nei mioblasti e a una migliore migrazione dei mioblasti in un test di guarigione delle ferite. L'asse Wnt5a-ROR2 è stato identificato come una via di segnalazione Wnt cruciale non canonica tra NCC e progenitori del secondo campo cardiaco (SHF). In conclusione, questo è un protocollo altamente trattabile per studiare i meccanismi di segnalazione Wnt paracrini non canonici in vitro.

Introduzione

La segnalazione Wnt non canonica è una via evolutivamente conservata che regola l'organizzazione dei filamenti cellulari e la migrazione direzionale. Questa via è stata implicata in molteplici processi biologici, tra cui la morfogenesi del tessuto embrionale 1,2,3, l'angiogenesi linfatica e vascolare 4,5,6,7 e la crescita e le metastasi del cancro 8,9,10 . A livello cellulare, la segnalazione Wnt non canonica viene effettuata attraverso interazioni paracrine coordinate tra cellule che inviano e ricevono il segnale. Queste interazioni si verificano frequentemente tra cellule di diversi lignaggi o tipi e coinvolgono una rete molecolare diversificata che comprende fino a 19 ligandi e recettori multipli, co-recettori ed effettori di trasduzione del segnale a valle11. A complicare ulteriormente questo processo di segnalazione, studi precedenti hanno dimostrato che le combinazioni ligando-recettore possono variare in modo dipendente dal contesto e dal tessuto 12,13 e che gli stessi ligandi sorgente che guidano la segnalazione Wnt non canonica nelle cellule riceventi del segnale possono essere prodotti da più tipi di cellule che inviano segnale 14,15 . Data la complessità cellulare e molecolare associata al segnale Wnt non canonico, la capacità di studiare in vivo meccanismi individuali e clinicamente rilevanti è stata limitata.

Sono stati fatti tentativi per studiare la segnalazione Wnt non canonica utilizzando tecniche di coltura cellulare in vitro. Ad esempio, sono stati utilizzati saggi di guarigione delle ferite eseguiti in monostrati cellulari per valutare funzionalmente la migrazione direzionale cellulare 4,16,17,18,19. Le tecniche di immunocolorazione sono state utilizzate per eseguire analisi spaziali dell'espressione proteica di superficie per valutare i cambiamenti non canonici indotti da Wnt nella morfologia cellulare 7,10, nell'architettura e nella polarizzazione asimmetrica18,19,20. Sebbene questi approcci abbiano fornito importanti strumenti per caratterizzare i fenotipi correlati a Wnt nelle cellule che ricevono il segnale, la mancanza di componenti di invio del segnale in questi protocolli limita la loro capacità di modellare accuratamente i meccanismi di segnalazione paracrina osservati in vivo. Di conseguenza, rimane una necessità critica di sviluppare sistemi in vitro che consentano una valutazione robusta e riproducibile delle interazioni di segnalazione paracrina tra le cellule mittenti e riceventi del segnale della via Wnt non canonica, in particolare quelle di diversi tipi cellulari.

A tal fine, l'obiettivo primario di questo studio è stato quello di stabilire un protocollo per modellare le interazioni di segnalazione Wnt paracrine non canoniche in vitro. Abbiamo sviluppato un sistema di cocoltura senza contatto che ricapitola le componenti di invio e ricezione del segnale di queste interazioni e consente l'uso di approcci molecolari, genetici o farmacologici standard per studiare in modo indipendente specifici meccanismi ligando-recettore nel percorso Wnt non canonico. I meccanismi di segnalazione Wnt mediata da NCC sono stati esaminati nei mioblasti utilizzando linee cellulari murine stabilite. Come prova di principio, questo modello è stato utilizzato per corroborare i risultati di precedenti studi in vivo nei topi che implicano l'asse Wnt5a-ROR2 come una via di segnalazione Wnt non canonica rilevante tra NCC 21 e progenitori dei cardiomioblasti SHF 3,22,23.

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Protocollo

1. Espansione presperimentale e passaggio delle cellule

  1. Coltura cellulare C2C12:
    1. Preparare 500 ml di terreno di coltura C2C12 combinando il terreno di coltura modificato di Dulbecco (DMEM) con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina.
    2. Scongelare un flaconcino di cellule C2C12 a bagnomaria a 37 °C. Mentre le celle C2C12 si scongelano, aggiungere 5 ml di terreno C2C12 a un tubo conico da 15 ml. Trasferire immediatamente le cellule scongelate nel tubo da 15 mL utilizzando una pipetta P1000.
      NOTA: Le cellule C2C12 sono cellule di mioblasti murini che sono state precedentemente utilizzate e convalidate come linea cellulare primaria per la modellazione dei progenitori dei cardiomioblasti.
    3. Mescolare delicatamente le cellule C2C12 nel tubo conico usando una pipetta sierologica. Quindi, aggiungere l'intero volume di cellule scongelate in mezzo C2C12 (6 ml) a un matraccio da 75 cm2 .
    4. Aggiungere 6 mL di terreno C2C12 fresco al matraccio per un volume totale di 12 mL. Ruotare delicatamente il pallone in modo che la cella e la soluzione multimediale coprano l'intero fondo del pallone. Porre il matraccio in un incubatore per colture cellulari (37 °C, 5% CO2) per consentire alle cellule di aderire.
    5. Lasciare che le cellule si espandano nell'incubatore fino a raggiungere ~ 60% di confluenza.
      NOTA: Questo può essere determinato rimuovendo periodicamente le cellule dall'incubatore e controllando rapidamente la loro confluenza al microscopio. Assicurati di ridurre al minimo il tempo in cui le cellule vengono rimosse dall'incubatore.
  2. Passaggio delle cellule C2C12:
    1. Riscaldare il mezzo C2C12, 500 ml di 1x PBS e tripsina-EDTA allo 0,25% in bagnomaria a 37 °C. Dopo che i reagenti sono stati riscaldati, trasferire tutti i reagenti nella cappa di coltura cellulare.
    2. Introdurre il matraccio contenente le cellule C2C12 nel cappuccio della coltura cellulare. Risciacquare delicatamente il matraccio contenente le cellule C2C12 con 1x PBS caldo due volte.
      1. Inclinare il matraccio con un angolo di 45° e aspirare il mezzo C2C12 con una pipetta di vetro collegata all'aspirazione a vuoto. Mantenendo un angolo di 45°, aggiungere con cautela 10 ml di 1x PBS caldo all'angolo del matraccio utilizzando una pipetta sierologica. Appoggiare il pallone piatto sulla superficie e muoverlo delicatamente con movimenti circolari per assicurarsi che 1x PBS lavi l'intero monostrato di cellule.
        NOTA: Fare attenzione a non interrompere il monostrato C2C12 durante l'aspirazione del fluido.
    3. Rimuovere 1x PBS dopo il secondo lavaggio. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% al matraccio, spostare delicatamente il matraccio come descritto sopra per consentire alla soluzione di tripsina-EDTA di diffondersi su quanto più monostrato possibile e porre il matraccio nell'incubatore per 2 minuti.
    4. Dopo 2 minuti di incubazione, rimuovere il pallone dall'incubatrice e picchiettarlo delicatamente per staccare eventuali cellule rimanenti.
    5. Aggiungere 9 mL di terreno C2C12 al matraccio con una pipetta sierologica per estinguere la tripsina. Utilizzando la pipetta sierologica, sciacquare delicatamente le cellule con il mezzo e raccogliere i 10 ml di sospensione cellulare tripsinizzata. Aggiungere 10 mL della sospensione cellulare in un tubo conico fresco da 15 mL e centrifugare a 100 × g per 5 minuti.
    6. Riportare il tubo conico alla cappa di coltura cellulare e rimuovere il surnatante con una pipetta di vetro collegata all'aspirazione a vuoto. Durante l'aspirazione del surnatante, fare attenzione a non disturbare il pellet cellulare sul fondo del tubo conico. Per fare ciò, lasciare ~ 0,2 ml del surnatante nel tubo conico. Risospendere le cellule in 10 ml di terreno C2C12 fresco.
    7. Per un ulteriore passaggio, aggiungere 1 mL delle celle risospese in un matraccio da 75 cm2 . Aggiungere 11 mL di terreno C2C12 al matraccio con una pipetta sierologica e porre il matraccio nell'incubatrice.
  3. Coltura cellulare STO:
    1. Preparare il terreno di coltura STO producendo 500 ml di DMEM con il 7% di FBS, l'1% di penicillina / streptomicina e 2 nM L-glutammina.
    2. Preparare la gelatina allo 0,1% aggiungendo 0,5 g di gelatina in polvere a un flacone contenente 500 ml di acqua tissutale o autoclavata. Aggiungere 7 ml di soluzione di gelatina allo 0,1% in un matraccio da 75 cm2 . Ruotare il matraccio in modo che la soluzione di gelatina copra l'intero fondo del pallone. Lasciare incubare il matraccio per 30 minuti a temperatura ambiente nella cappa di coltura cellulare.
    3. Dopo 30 minuti di incubazione, rimuovere la gelatina in eccesso utilizzando una pipetta collegata all'aspirazione sotto vuoto. Lasciare che i palloni rimangano nell'incubatrice per altri 30 minuti prima dell'uso.
    4. Scongelare un flaconcino di cellule STO a bagnomaria a 37 °C. Utilizzando una pipetta P1000, trasferire immediatamente le cellule scongelate in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di terreno di coltura STO appena preparato.
      NOTA: Le cellule STO sono fibroblasti embrionali murini abitualmente utilizzati come cellule di alimentazione nei protocolli di coltura cellulare.
    5. Mescolare delicatamente le cellule nel tubo conico usando una pipetta sierologica. Aggiungere l'intero volume (6 ml) delle cellule in un matraccio da 75 cm2 ricoperto di gelatina. Ruotare il matraccio per assicurarsi che la sospensione cellulare sia ben distribuita lungo il fondo del pallone.
    6. Aggiungere 6 mL di terreno STO fresco al matraccio per un volume totale di 12 ml. Ruotare il matraccio come descritto sopra per assicurarsi che le cellule e il mezzo siano ben distribuiti lungo il fondo del pallone. Collocare il matraccio nell'incubatore a 37 °C per consentire alle cellule di aderire. Lasciare che le cellule proliferano nell'incubatore fino a raggiungere ~ 60-70% di confluenza.
  4. Passaggio di celle STO:
    1. Mezzo cellulare STO caldo, 1xPBS e tripsina-EDTA allo 0,25% in bagnomaria a 37 °C.
    2. Risciacquare delicatamente il matraccio contenente celle STO con 1x PBS caldo due volte come descritto al punto 1.2.2.1.
    3. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% al matraccio utilizzando una pipetta P1000. Introdurre il matraccio nell'incubatrice a 37 °C per 5 minuti.
    4. Dopo 5 minuti di incubazione, rimuovere il pallone dall'incubatore. Picchiettare delicatamente il pallone per staccare eventuali cellule aderenti.
    5. Aggiungere 9 mL di terreno STO al matraccio per estinguere la tripsina e raccogliere i 10 mL di sospensione cellulare tripsinizzata come descritto sopra. Aggiungere 10 mL della sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 100 × g per 5 minuti.
    6. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di mezzo STO come descritto sopra. Per un ulteriore passaggio, aggiungere 1 mL delle celle risospese in un matraccio da 75 cm2 . Aggiungere 11 mL di mezzo STO, ruotare il matraccio per garantire una distribuzione uniforme delle celle e del mezzo lungo il fondo del matraccio e collocare il matraccio nell'incubatrice.
  5. Coltura cellulare STO inattiva e preparazione del terreno basale delle cellule O9-1:
    1. Preparare il terreno di coltura basale delle cellule O9-1 mescolando 500 ml di DMEM con il 15% di FBS, l'1% di penicillina/streptomicina, 2 nM di L-glutammina, 0,1 mM di amminoacidi non essenziali minimi, 1 nM di piruvato di sodio e 55 μM di beta-mercaptoetanolo.
    2. Preparare la soluzione di mitomicina C in 1x PBS ad una concentrazione di 0,5 mg/ml aggiungendo 4 mL di 1x PBS direttamente a un flaconcino di mitomicina C. Pipettare la soluzione più volte con una pipetta P1000. Per sciogliere ulteriormente la mitomicina C in 1x PBS, posizionare il flaconcino su un mixer a vortice o un bilanciere da banco per 45 minuti a 1 ora.
    3. Inattivare le cellule STO trattando le piastre STO con una concentrazione finale di 0,01 mg/mL di mitomicina C aggiunta al mezzo STO standard. Posizionare le piastre STO all'interno dell'incubatore per 2 ore, avendo cura di proteggere il matraccio contenente mitomicina C dalla luce riducendo al minimo il tempo trascorso all'esterno dell'incubatore. Dopo il trattamento con mitomicina, lavare le cellule in 1x PBS due volte come descritto al punto 1.2.2.1.
      NOTA: La mitomicina C inibisce la proliferazione delle cellule STO in modo che possano essere utilizzate per generare terreno condizionato per diversi giorni senza diventare troppo confluenti nel pallone.
    4. Dopo aver rimosso 1x PBS, aggiungere 12 mL di terreno di coltura basale O9-1 alle colture cellulari STO inattivate e incubarle per 24 ore. Raccogliere il terreno di coltura basale STO + O9-1 condizionato e inattivato e metterlo in tubi conici da 50 ml avvolti in un foglio per proteggerlo dalla luce.
    5. Aggiungere 12 ml di terreno di coltura basale fresco O9-1 alle colture cellulari STO inattivate come descritto sopra. Ripetere questo passaggio aggiungendo terreno di coltura basale O9-1 fresco agli stessi fianchi contenenti le cellule STO inattivate ogni 24 ore.
      NOTA: Dopo il trattamento con mitomicina C, le cellule STO inattivate non possono proliferare; quindi, i palloni contenenti le celle STO inattivate possono essere riutilizzati per generare mezzo condizionato.
    6. Conservare a 4 °C a 4 °C le provette coniche da 50 mL avvolte in pellicola contenenti terreni di coltura basale STO + O9-1 condizionati e inattivati.
  6. Coltura cellulare O9-1:
    1. Preparare il terreno di coltura cellulare O9-1 utilizzando 500 ml di terreno basale STO + O9-1 condizionato e aggiungere 103 unità di fattore inibitorio della leucemia (LIF) e 25 ng / mL di fattore di crescita basico dei fibroblasti (basic-FGF).
    2. Preparare i matraccio rivestiti di gelatina allo 0,1% come descritto nelle fasi da 1.3.2 a 1.3.3.
    3. Scongelare un flaconcino di cellule O9-1 a bagnomaria a 37 °C. Trasferire immediatamente le cellule scongelate in un tubo conico da 15 mL contenente 5 mL di terreno di coltura O9-1 appena preparato.
      NOTA: La linea cellulare O9-1 è l'unica linea cellulare della cresta neurale stabile e multipotente che è stata generata dal topo. Questa linea cellulare è comunemente usata negli esperimenti in vitro sulla cresta neurale.
    4. Mescolare delicatamente le cellule usando una pipetta sierologica. Aggiungere tutti i 6 ml di cellule in un matraccio da 75 cm2 ricoperto di gelatina.
    5. Aggiungere 6 mL di terreno di coltura O9-1 al matraccio per un volume totale di 12 mL. Collocare il matraccio nell'incubatore a 37 °C per consentire alle cellule di aderire. Lasciare che le cellule proliferano nell'incubatore fino a raggiungere ~ 60-70% di confluenza.
  7. Passaggio di cellule O9-1:
    1. Terreno di coltura caldo O9-1, 1x PBS e tripsina-EDTA allo 0,25% in bagnomaria a 37 °C.
    2. Risciacquare delicatamente la piastra contenente cellule O9-1 con 1x PBS caldo due volte come descritto al punto 1.2.2.1.
    3. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% nel matraccio e porlo nell'incubatore a 37 °C per 5 minuti.
    4. Dopo 5 minuti di incubazione, rimuovere il matraccio dall'incubatrice e picchiettare delicatamente il matraccio per staccare eventuali cellule aderenti.
    5. Aggiungere 9 mL di terreno di coltura O9-1 al matraccio per estinguere la tripsina. Raccogliere 10 mL della sospensione cellulare tripsinzzata e aggiungere 10 mL di questa sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL. Centrifugare il tubo a 100 × g per 5 minuti.
    6. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di terreno di coltura O9-1. Per un ulteriore passaggio, aggiungere 1 mL delle celle risospese in un matraccio da 75 cm2 . Aggiungere 11 mL di terreno di coltura O9-1 e porre il matraccio contenente le cellule in 12 mL di terreno nell'incubatore a 37 °C.

2. Placcatura delle cellule in un sistema di cocoltura

  1. Placcatura C2C12 camere a cella:
    1. Dopo tripsinizzazione (come descritto al punto 1.2), risospendere il pellet cellulare C2C12 in 10 mL di terreno C2C12. Diluire le cellule in un rapporto 1:20 in mezzo C2C12 rimuovendo 0,5 mL delle cellule C2C12 risospese e aggiungendole a un nuovo tubo conico da 15 mL contenente 9,5 mL di terreno C2C12 fresco. Mescolare delicatamente la sospensione con una pipetta sierologica.
    2. Aggiungere 1 mL delle celle C2C12 diluite 1:20 a ciascun pozzetto di un nuovo pozzetto a 4 camere utilizzando una pipetta P1000 e posizionare il pozzetto a 4 camere nell'incubatore.
  2. Placcatura O9-1 inserti cellula:
    1. Dopo tripsinizzazione, risospendere il pellet cellulare O9-1 in 10 mL di terreno di coltura O9-1. Diluire le cellule in un rapporto 1:20 nel mezzo di crescita O9-1 rimuovendo 0,5 mL delle cellule C2C12 risospese e aggiungendole a un nuovo tubo conico da 15 mL contenente 9,5 mL di terreno di crescita O9-1 fresco. Mescolare delicatamente la sospensione con una pipetta sierologica.
    2. Posizionare un singolo inserto permeabile (vedere la tabella dei materiali) all'interno di ciascun pozzetto di un nuovo pozzetto a 4 camere riempito con 1 ml di terreno di coltura O9-1.
      NOTA: Questo pozzo a 4 camere dovrebbe essere diverso da quello contenente le celle C2C12 del punto 2.1.3.
    3. Aggiungere 300 μL della sospensione della cella O9-1 diluita a ciascun inserto utilizzando una pipetta P1000. Assicurarsi che il fondo di ciascun inserto sia immerso all'interno del pozzetto riempito con 1,3 ml di terreno di coltura O9-1. Posizionare il pozzetto nell'incubatore a 37 °C.
  3. (Facoltativo). Eseguire il knockdown del siRNA nelle cellule O9-1 o nelle cellule C2C12.
    1. Eseguire il knockdown genico mediante siRNA 18-24 ore dopo aver placcato gli inserti delle cellule O9-1 o i pozzetti della camera cellulare C2C12.
      1. Diluire il siRNA e il reagente di trasfezione in mezzo a siero ridotto (vedere la Tabella dei Materiali) secondo le raccomandazioni dei produttori e le concentrazioni desiderate per l'esperimento. Mescolare delicatamente il siRNA diluito e il reagente di trasfezione (1:1) e incubare la miscela a temperatura ambiente per 7 minuti.
        NOTA: In questo protocollo, sono state utilizzate concentrazioni di 50 nM poiché questa concentrazione di siRNA è stata determinata per determinare un knockdown sufficiente dell'espressione genica bersaglio.
      2. Aggiungere i complessi siRNA-lipidi agli inserti cellulari O9-1 o ai pozzetti della camera cellulare C2C12 come determinato dal disegno sperimentale e incubare le cellule con i complessi siRNA-lipidi per ~36-48 ore.

3. Esecuzione del saggio della ferita e valutazione quantitativa della migrazione dei mioblasti

  1. Saggio della ferita:
    1. Lasciare che gli inserti delle cellule O9-1 e i pozzetti della camera cellulare C2C12 aderiscano e proliferano nell'incubatore fino a quando entrambe le cellule sono a ~ 70-80% di confluenza prima di procedere con questa porzione del protocollo. Se le cellule crescono confluenti del >90%, non procedere con il test del graffio, poiché le cellule si staccheranno semplicemente dal pozzo.
    2. Riscaldare 1x PBS e C2C12 mezzo mettendoli a bagnomaria a 37 °C.
    3. Rimuovere bene il mezzo surnatante dalla camera C2C12 e lavare le celle una volta con 1x PBS. Rimuovere 1x PBS e grattare immediatamente le cellule con una punta sterile per pipetta P10.
      1. Passare saldamente la punta della pipetta sterile P10 in un'unica direzione per coprire l'intera lunghezza o larghezza del monostrato cellulare (ad esempio, da destra a sinistra, dall'alto verso il basso). Assicurati di grattare ogni pozzetto contenente le cellule solo una volta.
        NOTA: Per ottimizzare i risultati di graffiatura, grattare pozzetti di diverse condizioni sperimentali a un livello simile di confluenza. Per fare ciò, assicurarsi che ogni pozzo a 4 camere abbia celle per ogni condizione sperimentale richiesta (ad esempio, ben #1 controllo negativo, ben #2 controllo positivo). Inoltre, utilizzare una nuova pipetta sterile P10 per ogni graffio e applicare ogni volta una forza simile alla pipetta. Non tentare di creare più di un graffio in ogni pozzetto.
      2. Dopo aver graffiato, aggiungere rapidamente 1 mL di 1x PBS nel pozzetto utilizzando una punta per pipetta P1000. Ripeti questo processo per ogni pozzetto che verrà graffiato.
        NOTA: Data la variabilità associata a ciascun graffio, si raccomanda di utilizzare più pozzetti (n = 3) per la creazione della ferita in ogni condizione sperimentale. Lavorare rapidamente in quanto è fondamentale ridurre al minimo la durata per la quale le celle sono senza 1x PBS durante questi passaggi. Dopo aver rimosso 1x PBS da ciascun pozzetto, non si dovrebbero prendere più di 5 s per generare una ferita in ciascun pozzetto.
    4. Dopo aver generato una ferita e aggiunto 1x PBS in ciascun pozzetto, visualizzare il graffio utilizzando un microscopio invertito a campo chiaro e utilizzare questa immagine come dimensione della ferita di base (tempo 0). Per acquisire immagini, attenersi alla seguente procedura:
      1. Accendere il computer e il microscopio (vedere la tabella dei materiali) premendo il pulsante di accensione. Posizionare la slitta della camera sul palco e ruotare la manopola dell'obiettivo fino all'ingrandimento 5x.
      2. Aprire il software di imaging (vedere la tabella dei materiali) facendo doppio clic sull'icona del software sul desktop del computer. Fare clic sulla scheda Fotocamera nella schermata iniziale del software. Fare clic sul pulsante Live per visualizzare le celle nella scheda AxioCam IC .
      3. Assicurarsi che il filtro luce sia tirato fino in fondo per consentire alla luce di passare alla fotocamera e allo schermo del computer. Spostare e/o ruotare manualmente la slitta della camera per posizionare l'area della ferita al centro dell'immagine live nella scheda IC di AxioCam .
      4. Per scattare immagini, fare clic su Snap per aprire una nuova scheda accanto alla scheda AxioCam IC che contiene l'immagine.
      5. Per salvare questa immagine fissa, fare clic su file nella parte superiore sinistra della home page del software | salvare con nome | immettere il nome del file nella casella Nome file. Salvare la figura in formato immagine Carl Zeiss (*.czi) (impostazione predefinita) e selezionare desktop sulla barra a sinistra per salvare il file sul desktop come file .czi, che può essere aperto solo nel programma software Zen lite 2012.
      6. Per salvare l'immagine come .tiff, fare clic su file | Salva con nome | immettere il nome del file nella casella Nome file. Salvare la figura come file immagine con tag (*.tiff) facendo clic sul pulsante Salva come tipo e selezionando *.tiff dal menu a discesa.
        NOTA: il formato .tiff può essere aperto in qualsiasi software di elaborazione delle immagini.
      7. Riposizionare manualmente il vetrino della camera per scattare altre 2-3 immagini in altri punti della ferita nello stesso pozzetto.
        NOTA: In totale, ciò si tradurrà in 3-4 immagini non sovrapposte e ad alto ingrandimento della ferita in ciascun pozzetto.
    5. Rimuovere 1x PBS da ciascun pozzetto e aggiungere 1 mL di terreno C2C12.
      NOTA: Fare attenzione a non pipettare in modo troppo aggressivo quando si rimuovono o si aggiungono soluzioni al pozzetto della camera dopo la generazione della ferita, poiché ciò potrebbe causare il distacco delle cellule dal pozzetto della camera. Inoltre, inclinare bene la camera in modo che l'aspirazione e la reintroduzione delle soluzioni possano essere eseguite agli angoli di ciascun pozzetto per ridurre al minimo la rottura del monostrato cellulare.
    6. Assemblare il sistema di cocoltura degli inserti del pozzo posizionando manualmente gli inserti contenenti le celle O9-1 in ciascun pozzetto del pozzetto della camera. Spingere delicatamente gli inserti verso il basso nel pozzetto in modo tale che il fondo dell'inserto si trovi appena sopra le celle C2C12 sottostanti. Riportare i costrutti dell'inserto del pozzetto nell'incubatore.
      NOTA: non lasciare che la parte inferiore dell'inserto tocchi fisicamente e interrompa meccanicamente le celle C2C12 sottostanti.
    7. Lasciare che le cellule migrino per un totale di 9-12 ore. Per determinare il tempo di migrazione ottimale, controllare le cellule a 6 ore dopo la creazione della ferita, quindi ogni 2-3 ore in seguito. Termina l'esperimento quando le cellule in condizioni di controllo o di controllo positivo iniziano a coprire completamente la ferita.
      NOTA: data la natura senza contatto del costrutto, l'inserto sovrastante non deve essere rimosso dai pozzetti quando si controlla la progressione della migrazione dell'intervallo. La variabilità migratoria sarà osservata in base a fattori quali i tipi di cellule utilizzati in questo test, la densità cellulare al momento della generazione della ferita, l'ampiezza della ferita creata e le condizioni sperimentali delle cellule manipolate (ad esempio, knockdown genico, aggiunta di proteine ricombinanti). Le concentrazioni di questi reagenti devono essere determinate sperimentalmente con le indicazioni delle raccomandazioni del produttore.

4. Colorazione con immunofluorescenza e imaging dei mioblasti migratori

  1. Terminare il saggio di migrazione e decostruire il sistema di inserimento del pozzo:
    1. Rimuovere gli inserti cellulari O9-1 dopo un periodo di migrazione di 9-12 ore (o un tempo alternativo designato dalle condizioni sperimentali). Aspirare con cautela il mezzo C2C12 utilizzando una pipetta P1000. Aggiungere 0,5 ml di 1x PBS ai pozzetti della camera e scattare immagini finali delle cellule dopo la migrazione.
    2. Aspirare con attenzione tutti gli 0,5 ml di 1x PBS miscelati con il mezzo e rimuovere le camere di plastica dai pozzetti della camera utilizzando le istruzioni del kit, lasciando il vetrino sottostante contenente le celle C2C12.
      NOTA: Fare attenzione a non disturbare le cellule C2C12 aderenti al vetrino quando si rimuovono i pozzetti della camera.
  2. Esecuzione di immunocolorazione:
    1. Posizionare immediatamente il vetrino in un portavetrino contenente il 4% di paraformaldeide (PFA) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Versare il 4% di PFA e aggiungere 1x PBS contenente Triton X-100 allo 0,1% (1x PBST) al supporto del vetrino per lavare il vetrino per 15 minuti a temperatura ambiente. Versare 1x PBST e aggiungere 1x PBS al portavetrino per lavare il vetrino per 10 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio ancora una volta per un totale di due lavaggi PBS 1x.
    2. Rimuovere la diapositiva dal portavetrina. Tracciare i bordi esterni del vetrino con una penna idrofobica per creare un bordo idrofobico attorno al vetrino per evitare che le soluzioni fuoriescano dalla diapositiva. Fare attenzione a non interrompere le cellule aderenti.
    3. Aggiungere una soluzione bloccante dell'albumina sierica bovina (BSA) all'1% (diluita in 1x PBS) al vetrino (~0,5 mL per vetrino). Assicurarsi che la soluzione sia contenuta all'interno del limite idrofobico creato al punto 4.2.4. Incubare il vetrino per 1 ora a temperatura ambiente in una camera di scorrimento umidificata.
      NOTA: Sebbene il blocco BSA non sia richiesto per l'immunocolorazione con falloidina, questo passaggio del protocollo consente l'accoppiamento con la colorazione anticorpale a fluorescenza.
    4. Dopo aver bloccato per 1 ora, versare la soluzione bloccante dal vetrino, aggiungere l'anticorpo falloidina (diluito a 1:200 in soluzione bloccante BSA all'1% aggiungendo 5 μL di anticorpo a 995 μL di soluzione di BSA) al vetrino e incubare a 4 °C per una notte. Anche in questo caso, assicurarsi che la soluzione sia contenuta all'interno del limite idrofobico creato al punto 4.2.4. Dato che l'anticorpo falloidina è coniugato al colorante Alexa Fluor-488, ridurre al minimo l'esposizione alla luce del reagente anticorpale prima e dopo l'aggiunta al vetrino.
    5. Il giorno seguente, posizionare il vetrino in un portavetrini protetto dall'esposizione alla luce (ad esempio, avvolgere il portavetrino in un foglio o utilizzare un portavetrini non trasparente). Lavare le celle nel portavetrino con 1x PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Ripetere il lavaggio per un totale di tre lavaggi di 10 minuti.
    6. Aggiungere il supporto di montaggio contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e montare le guide con vetrini di vetro. Immagine delle cellule che sono migrate utilizzando un microscopio a fluorescenza standard.

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Risultati

Effetti dei NCC sulla capacità migratoria dei mioblasti murini
Questo test è stato applicato per la prima volta per valutare l'impatto delle NCC sulla capacità migratoria dei mioblasti. La Figura 1 illustra il modello schematico del test. Per testare questo impatto, sono stati eseguiti saggi di scratch con mioblasti che sono stati coltivati in isolamento (senza inserti NCC) rispetto a quelli cresciuti in presenza di inserti. Come controllo positivo, 500 ng/mL di Wnt5a ...

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Discussione

La via di segnalazione non canonica Wnt/polarità cellulare planare (PCP) è una via di segnalazione cellulare di importanza critica che è stata implicata nei processi di sviluppo multiplo 24,25 e malattia24,26. Durante lo sviluppo embrionale, la segnalazione Wnt non canonica coinvolge una vasta rete di segnali molecolari provenienti da cellule che inviano segnali che alla fine inducono cambiame...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato in parte dai premi NIH F30HL154324 a O.T. e K08HL121191 e R03HL154301 a S.R.K. Gli autori desiderano riconoscere che lo schema nella Figura 1 di questo manoscritto è stato creato con biorender.com.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma AldrichM-7522
Antifade mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200-10Stored at 4 °C
Bovine serum albuminSanta Cruz Biotechnologysc-2323Stored at 4 °C
C2C12 murine myoblast cell lineATCCCRL-1772
Cell culture flasks, 75 cm2ThermoFisher Scientific156499
Chamber Slide System, 4-wellThermoFisher Scientific154526
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM)Corning10-017-CVStored at 4 °C
Falcon conical centrifuge tubes, 15 mLFisher Scientific14-959-53A
Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membraneCorning353095
Fetal bovine serumFisher ScientificW3381EStored in 50 mL aliquots at -20 °C
Gelatin solution, 0.1%ATCCPCS-999-027Stored at 4 °C
Graduated and sterile pipette tips, 10 µLUSA Scientific1111-3810
Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mLMillipore SigmaESG1106
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100xGibco11140-050
Minimum essential medium (MEM)Corning10-022-CV
Mitomycin CRoche10107409001
Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mmSpringside ScientificHRTCG2455
O9-1 neural crest cell lineMillipore SigmaSCC049
Opti-MEM I, 1xGibco31985-070
Paraformaldehyde solution in PBS, 4%Santa Cruz Biotechnologysc-281692Stored at 4 °C
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin)Fisher ScientificW3470HStored in 10 mL aliquots at -20 °C
Phalloidin-iFluor 488Abcamab176753Stored at -20 °C, Keep out of light
Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4Corning21-040-CVStored at 4 °C
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)R&D Systems233-FB-025
Recombinant human/mouse Wnt5a proteinR&D Systems645-WN-010
Sodium pyruvate, 100 mMGibco11360-070
Square Petri dish with gridThomas Scientific1219C98
STO murine fibroblast feeder cellsATCCCRL-1503
Triton X-100 solutionSigma AldrichX100-100ML
Trypsin-EDTA, 0.25%Fisher ScientificW3513CStored at 4 °C
Zeiss Apotome.2 fluoresence microscopeCarl Zeiss AG
Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscopeCarl Zeiss AG
Zen lite 2012 microscopy softwareCarl Zeiss AGimaging software

Riferimenti

  1. Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
  2. Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093(2019).
  3. Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719(2019).
  4. Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).
  5. Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).
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  7. Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
  8. Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
  9. Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
  10. Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
  11. Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
  12. Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
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  25. Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).
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  32. Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).
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