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要約

本研究では、パラクリンの非標準的なWntシグナル伝達イベントを in vitroで 研究するための再現性が高く扱いやすい方法を概説しています。このプロトコルは、マウス神経堤細胞および筋芽細胞におけるパラクリンWnt5aシグナル伝達の影響を評価するために適用されました。

要約

非標準的なWntシグナル伝達は、胚形成中の細胞内アクチンフィラメント組織および前駆細胞の分極した遊走を調節する。このプロセスには、シグナル伝達細胞とシグナル受信細胞の間の複雑で協調的なパラクリン相互作用が必要です。これらの相互作用が異なる系統のさまざまな種類の細胞間で発生する可能性があることを考えると、細胞特異的欠陥の in vivo 評価は困難な場合があります。本研究では、 in vitro でパラクリン非標準的なWntシグナル伝達を評価するための再現性の高い方法について説明します。このプロトコルは、(1)関心のある任意の2つの細胞型間で非標準的なWntシグナル伝達の機能的および分子的評価を実施する能力を備えて設計されました。(2)非標準的なWntシグナル伝達経路におけるシグナル伝達分子とシグナル受信分子の役割を分析する。(3)標準的な分子学的または薬理学的アプローチで表現型レスキュー実験を実施する。

このプロトコルは、筋芽細胞における神経堤細胞(NCC)を介した非標準的なWntシグナル伝達を評価するために使用されました。NCCの存在は、筋芽細胞におけるファロイジン陽性細胞質糸状足および層状突起の数の増加、ならびに創傷治癒アッセイにおける筋芽細胞遊走の改善と関連している。 Wnt5a-ROR2 軸は、NCCと第二心野(SHF)心筋芽細胞前駆細胞との間の重要な非標準的なWntシグナル伝達経路として同定されました。結論として、これはin vitroでパラクリン非標準的なWntシグナル伝達メカニズムを研究するための非常に扱いやすいプロトコルです。

概要

非標準的なWntシグナル伝達は、細胞フィラメントの構成と方向性の移動を調節する進化的に保存された経路です。この経路は、胚組織形態形成1,2,3、リンパおよび血管血管新生4,5,6,7、および癌の成長および転移8,9,10を含む複数の生物学的プロセスに関与しています。.細胞レベルでは、非標準的なWntシグナル伝達は、シグナル伝達細胞とシグナル受信細胞の間の協調的なパラクリン相互作用を介して行われます。これらの相互作用は、異なる系統またはタイプの細胞間で頻繁に起こり、最大19個のリガンドおよび複数の受容体、共受容体、および下流のシグナル伝達エフェクターを含む多様な分子ネットワークを含む11。このシグナル伝達プロセスをさらに複雑にしているのは、リガンドと受容体の組み合わせが状況依存的および組織依存的に変化する可能性があることが以前の研究で示されている12,13、およびシグナル受信細胞で非標準的なWntシグナル伝達を駆動する同じソースリガンドが複数のシグナル送信細胞タイプによって生成される可能性があることが示されています14,15。.非標準的なWntシグナル伝達に関連する細胞および分子の複雑さを考えると、in vivoで個々の臨床的に関連するメカニズムを研究する能力は限られています。

インビトロでの細胞培養技術を用いて非標準的なWntシグナル伝達を研究する試みがなされている。例えば、細胞単層で実施される創傷治癒アッセイは、細胞指向性移動を機能的に評価するために使用されてきた4、16、17、18、19。免疫染色技術は、細胞形態7,10、構造、および非対称分極における非標準的なWnt誘発変化を評価するために、表面タンパク質発現の空間解析を実行するために使用されています7,10,および非対称分極18,19,20。 これらのアプローチは、シグナル受信細胞におけるWnt関連の表現型を特徴付けるための重要なツールを提供してきましたが、これらのプロトコルにシグナル送信コンポーネントがないため、in vivoで観察されるパラクリンシグナル伝達メカニズムを正確にモデル化する能力が制限されています。その結果、非標準的なWnt経路のシグナル送信細胞と受信細胞、特に異なる細胞タイプの細胞間のパラクリンシグナル伝達相互作用の堅牢で再現性のある評価を可能にするin vitroシステムを開発することが依然として重要です。

この目的のために、この研究の主な目的は、in vitroでパラクリン非標準的なWntシグナル伝達相互作用をモデル化するためのプロトコルを確立することでした。私たちは、これらの相互作用のシグナル送信およびシグナル受信成分を再現し、標準的な分子、遺伝、または薬理学的アプローチを使用して、非標準的なWnt経路における特定のリガンド受容体メカニズムを独立して研究できる非接触共培養システムを開発しました。NCCを介したWntシグナル伝達のメカニズムを、確立されたマウス細胞株を用いて筋芽細胞で調べました。原理の証明として、このモデルは、NCCs21とSHF心筋芽細胞前駆細胞との間の関連する非標準的なWntシグナル伝達経路としてWnt5a-ROR2軸を関与させるマウスにおける以前のin vivo研究の所見を裏付けるために使用された3,22,23。

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プロトコル

1.実験前の細胞の増殖と継代

  1. C2C12細胞培養:
    1. ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを組み合わせて、500 mLのC2C12培地を調製します。
    2. C2C12細胞のバイアルを37°Cの水浴中で解凍する。C2C12細胞が解凍されている間に、5 mLのC2C12培地を15 mLのコニカルチューブに加えます。直ちにP1000ピペットを使用して、解凍した細胞を15 mLチューブに移します。
      注:C2C12細胞は、心筋芽細胞前駆細胞をモデル化するための初代細胞株として以前に使用および検証されているマウス筋芽細胞です。
    3. 血清学的ピペットを使用して、円錐管内のC2C12細胞を穏やかに混合します。次いで、融解した細胞の全量をC2C12培地(6mL)に75cm2 フラスコに加える。
    4. 6 mLの新しいC2C12培地をフラスコに加え、総容量12 mLにします。細胞と培地溶液がフラスコの底全体を覆うようにフラスコをゆっくりと回転させます。フラスコを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に入れて、細胞を接着させた。
    5. 細胞が~60%のコンフルエントに達するまでインキュベーター内で増殖させます。
      注:これは、インキュベーターから細胞を定期的に取り出し、顕微鏡下でそれらのコンフルエント性をすばやく確認することによって決定できます。細胞がインキュベーターから取り除かれる時間を最小限に抑えるようにしてください。
  2. 継代C2C12細胞:
    1. C2C12培地、500 mLの1x PBS、および0.25%トリプシン-EDTAを37°Cの水浴中で温めます。試薬を温めたら、すべての試薬を細胞培養フードに移します。
    2. C2C12細胞が入ったフラスコを細胞培養フードに入れます。C2C12細胞を含むフラスコを温かい1x PBSで2回静かにすすぎます。
      1. フラスコを45°の角度で傾け、真空吸引に接続されたガラスピペットでC2C12培地を吸引します。45°の角度を維持しながら、血清学的ピペットを使用してフラスコの角に10 mLの温かい1x PBSを慎重に加えます。フラスコを表面に平らに置き、フラスコを円を描くようにゆっくりと動かして、1x PBSが細胞の単層全体を洗浄するようにします。
        注意: 培地の吸引中にC2C12単層を破壊しないように注意してください。
    3. 2回目の洗浄後に1xPBSを取り外します。フラスコに1mLの0.25%トリプシン-EDTAを加え、上記のようにフラスコを静かに動かして、トリプシン-EDTA溶液をできるだけ多くの単層に広げ、フラスコをインキュベーターに2分間入れます。
    4. 2分間のインキュベーション後、フラスコをインキュベーターから取り出し、軽くたたいて残りの細胞を剥がします。
    5. 9 mLのC2C12培地を血清学的ピペットでフラスコに加え、トリプシンをクエンチします。血清学的ピペットを使用して、細胞を培地で穏やかにすすぎ、10 mLのトリプシン処理細胞懸濁液を回収します。10 mLの細胞懸濁液を新しい15 mLコニカルチューブに加え、100 × g で5分間遠心分離します。
    6. コニカルチューブを細胞培養フードに戻し、真空吸引に接続されたガラスピペットで上清を除去します。上清を吸引している間は、円錐管の底にある細胞ペレットを乱さないように注意してください。これを行うには、~0.2 mLの上清を円錐管に残します。細胞を10 mLの新しいC2C12培地に再懸濁します。
    7. 追加の継代のために、再懸濁した細胞1 mLを75 cm2 フラスコに加えます。血清学的ピペットでフラスコに11 mLのC2C12培地を加え、フラスコをインキュベーターに入れます。
  3. STO細胞培養:
    1. 7% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、および 2 nM L-グルタミンを含む 500 mL の DMEM を作製して、STO培地を調製します。
    2. 500 mLのティッシュグレードまたはオートクレーブ水を入れたボトルに0.5 gのゼラチンパウダーを加えて、0.1%ゼラチンを調製します。7 mLの0.1%ゼラチン溶液を75 cm2 フラスコに加えます。ゼラチン溶液がフラスコの底全体を覆うようにフラスコを回転させる。フラスコを細胞培養フード内で室温で30分間インキュベートします。
    3. 30分間のインキュベーション後、真空吸引に接続されたピペットを使用して余分なゼラチンを除去します。使用前にフラスコをさらに30分間インキュベーターに入れたままにします。
    4. STO細胞のバイアルを37°Cの水浴中で解凍する。P1000ピペットを使用して、解凍した細胞を、新たに調製したSTO培地5 mLを含む15 mLコニカルチューブに直ちに移します。
      注:STO細胞は、細胞培養プロトコルでフィーダー細胞として日常的に使用されるマウス胚性線維芽細胞です。
    5. 血清学的ピペットを使用して円錐管内の細胞を穏やかに混合する。細胞の全容量(6mL)をゼラチンコーティングされた75cm2 フラスコに加える。フラスコを回転させて、細胞懸濁液がフラスコの底に沿って良好に分布していることを確認します。
    6. 6 mLの新しいSTO培地をフラスコに加え、総容量12 mLにします。上記のようにフラスコを回転させて、細胞と培地がフラスコの底に沿って十分に分布していることを確認します。フラスコを37°Cのインキュベーターに入れ、細胞を接着させます。細胞が~60-70%のコンフルエントに達するまでインキュベーター内で増殖させます。
  4. STO細胞の継代:
    1. STO細胞培地、1xPBS、および0.25%トリプシン-EDTAを37°Cの水浴中で温めます。
    2. STO細胞を含むフラスコを、ステップ1.2.2.1の説明に従って、温かい1x PBSで2回静かにすすぎます。
    3. P1000ピペットを使用して、1 mLの0.25%トリプシン-EDTAをフラスコに加えます。フラスコを37°Cのインキュベーターに5分間入れます。
    4. 5分間のインキュベーション後、インキュベーターからフラスコを取り出します。フラスコを軽くたたいて、付着細胞を剥離します。
    5. フラスコに9 mLのSTO培地を加えてトリプシンをクエンチし、上記のようにトリプシン処理細胞懸濁液10 mLを回収します。10 mLの細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに加え、100 × g で5分間遠心分離します。
    6. 上清を除去し、上記のように10 mLのSTO培地に細胞を再懸濁します。追加の継代のために、再懸濁した細胞1 mLを75 cm2 フラスコに加えます。11 mLのSTO培地を加え、フラスコを回転させてフラスコの底に沿って細胞と培地が均一に分布するようにし、フラスコをインキュベーターに入れます。
  5. 不活性STO細胞培養およびO9-1細胞基礎培地調製:
    1. 500 mLのDMEMを15%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2 nM L-グルタミン、0.1 mMの最小非必須アミノ酸、1 nMピルビン酸ナトリウム、および55 μMβ-メルカプトエタノールと混合することにより、O9-1細胞基礎培地を調製します。
    2. マイトマイシンCバイアルに直接1 mLの1x PBSを加えて、0.5 mg/mLの濃度で1x PBS中のマイトマイシンC溶液を調製します。P1000ピペットで溶液を複数回ピペットします。マイトマイシンCを1x PBSにさらに溶解するには、バイアルをボルテックスミキサーまたはベンチトップロッカーに45分から1時間置きます。
    3. 標準STO培地に添加した最終濃度0.01 mg/mLのマイトマイシンCでSTOプレートを処理して、STO細胞を不活性化します。STOプレートをインキュベーター内に2時間置き、インキュベーターの外で過ごす時間を最小限に抑えることにより、マイトマイシンCを含むフラスコを光から保護するように注意します。マイトマイシン処理に続いて、ステップ1.2.2.1に記載されているように、1x PBSで細胞を2回洗浄します。
      注:マイトマイシンCはSTO細胞の増殖を阻害するため、フラスコ内で過剰にコンフルエントになることなく、数日間にわたってコンディショニング培地を生成するために使用できます。
    4. 1x PBSを除去した後、不活化STO細胞培養液に12 mLのO9-1基礎培養液を加え、24時間インキュベートします。コンディショニングされた不活化STO + O9-1基礎培地を収集し、光から保護するためにホイルで包まれた50 mLコニカルチューブに入れます。
    5. 上記のように、不活化STO細胞培養物に12 mLの新鮮なO9-1基礎培養液を追加します。不活化STO細胞を含む同じ側面に新しいO9-1基礎培養培地を24時間ごとに添加して、この手順を繰り返します。
      注:マイトマイシンC治療後、不活性化されたSTO細胞は増殖できません。したがって、不活性化STO細胞を含むフラスコは、馴化培地を生成するために再利用することができる。
    6. コンディショニングされた不活化STO+O9-1基礎培地を含むホイルで包まれた50 mLコニカルチューブを、合計500 mLの培地が回収されるまで4°Cで保管します。
  6. O9-1細胞培養:
    1. 500 mLのコンディショニングSTO+O9-1基礎培地を用いてO9-1細胞増殖培地を調製し、103 単位の白血病抑制因子(LIF)と25 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(塩基性FGF)を添加します。
    2. ステップ1.3.2〜1.3.3で説明されているように、0.1%ゼラチンコーティングフラスコを準備します。
    3. O9-1細胞のバイアルを37°Cの水浴中で解凍する。解凍した細胞を、新たに調製した5 mLのO9-1増殖培地を含む15 mLのコニカルチューブに直ちに移します。
      注:O9-1細胞株は、マウスから生成された唯一の安定した多能性神経堤細胞株です。この細胞株は、神経堤 のin vitro 実験で一般的に使用されます。
    4. 血清学的ピペットを使用して細胞を穏やかに混合します。6 mLの細胞全体をゼラチンコーティングした75 cm2 フラスコに加えます。
    5. 6 mLのO9-1増殖培地をフラスコに加え、総容量12 mLにします。フラスコを37°Cのインキュベーターに入れ、細胞を接着させます。細胞が~60-70%のコンフルエントに達するまでインキュベーター内で増殖させます。
  7. 継代O9-1細胞:
    1. O9-1増殖培地、1x PBS、および0.25%トリプシン-EDTAを37°Cの水浴中で温めます。
    2. O9-1細胞を含むプレートを、ステップ1.2.2.1の説明に従って、温かい1x PBSで2回静かにすすぎます。
    3. フラスコに0.25%トリプシン-EDTA1 mLを加え、37°Cのインキュベーターに5分間入れます。
    4. 5分間のインキュベーション後、フラスコをインキュベーターから取り出し、フラスコを軽くたたいて接着細胞を剥離します。
    5. 9 mLのO9-1増殖培地をフラスコに加え、トリプシンをクエンチします。10 mLのトリプシン処理細胞懸濁液を収集し、この細胞懸濁液10 mLを15 mLのコニカルチューブに加えます。チューブを100 × g で5分間遠心分離します。
    6. 上清を除去し、細胞を10 mLのO9-1増殖培地に再懸濁します。追加の継代のために、1 mLの再懸濁した細胞を75 cm2 フラスコに加えます。11 mLのO9-1増殖培地を加え、細胞を含むフラスコを12 mLの培地に入れて37°Cのインキュベーターに入れます。

2. 共培養系における細胞のプレーティング

  1. C2C12セルチャンバーのめっき:
    1. トリプシン処理後(ステップ1.2に記載)、C2C12細胞ペレットを10 mLのC2C12培地に再懸濁します。再懸濁したC2C12細胞0.5 mLを除去し、9.5 mLの新鮮なC2C12培地を含む新しい15 mLコニカルチューブに加えることにより、C2C12培地で細胞を1:20の比率で希釈します。懸濁液を血清学的ピペットで穏やかに混合する。
    2. P1000ピペットを使用して、1:20希釈したC2C12細胞を新しい4室ウェルの各ウェルに1 mL加え、4室ウェルをインキュベーターに入れます。
  2. O9-1セルインサートのめっき:
    1. トリプシン処理後、O9-1細胞ペレットを10 mLのO9-1増殖培地に再懸濁します。再懸濁したC2C12細胞0.5 mLを除去し、9.5 mLの新鮮なO9-1増殖培地を含む新しい15 mLコニカルチューブに加えることにより、O9-1増殖培地で細胞を1:20の比率で希釈します。懸濁液を血清学的ピペットで穏やかに混合する。
    2. 1 mLのO9-1増殖培地で満たされた新しい4チャンバーウェルの各ウェル内に単一の透過性インサート( 材料の表を参照)を配置します。
      注:この4チャンバーウェルは、ステップ2.1.3のC2C12セルを含むウェルとは異なる必要があります。
    3. P1000ピペットを使用して、希釈したO9-1細胞懸濁液を300 μLずつ各インサートに加えます。各インサートの底部が、1.3 mLのO9-1増殖培地で満たされたウェル内に沈んでいることを確認します。ウェルを37°Cのインキュベーターに入れます。
  3. (オプション)。O9-1細胞またはC2C12細胞でsiRNAノックダウンを実行します。
    1. O9-1細胞インサートまたはC2C12細胞チャンバーウェルのいずれかをプレーティングしてから18〜24時間後にsiRNAによる遺伝子ノックダウンを実行します。
      1. siRNAとトランスフェクション試薬を還元血清培地( 材料表を参照)で、メーカーの推奨および実験に必要な濃度に従って希釈します。希釈したsiRNAとトランスフェクション試薬(1:1)を穏やかに混合し、室温で7分間インキュベートします。
        注:このプロトコルでは、このsiRNA濃度が標的遺伝子発現の十分なノックダウンをもたらすと決定されたため、50 nM濃度を使用しました。
      2. 実験デザインで決定されたように、siRNA-脂質複合体をO9-1細胞インサートまたはC2C12細胞チャンバーウェルのいずれかに追加し、細胞をsiRNA-脂質複合体とともに~36-48時間インキュベートします。

3.創傷アッセイの実施と筋芽細胞遊走の定量的評価

  1. 創傷アッセイ:
    1. O9-1細胞インサートとC2C12細胞チャンバーウェルをインキュベーター内で接着および増殖させて、両方の細胞が~70-80%のコンフルエンシーになるまでしてから、プロトコルのこの部分に進みます。細胞が>90%コンフルエントに成長した場合、細胞は単にウェルから剥離するため、スクラッチアッセイを続行しないでください。
    2. 1x PBSおよびC2C12培地を37°Cの水浴に入れて温めます。
    3. C2C12チャンバーから上清培地をよく取り出し、1x PBSで細胞を1回洗浄します。1x PBSを取り外し、滅菌P10ピペットチップで細胞をすぐに引っ掻きます。
      1. 滅菌P10ピペットチップを一方向にしっかりと通して、細胞単層の全長または幅(右から左、上から下など)に渡します。細胞を含む各ウェルを一度だけ引っ掻いてください。
        注:スクラッチ結果を最適化するには、同様のレベルのコンフルエンシーで異なる実験条件のスクラッチウェルをスクラッチします。これを行うには、各4チャンバーウェルに必要な各実験条件(例えば、ウェル#1ネガティブコントロール、ウェル#2ポジティブコントロール)の細胞があることを確認します。さらに、傷ごとに新しい滅菌P10ピペットを使用し、毎回ピペットに同じ量の力を加えます。各ウェルに複数のスクラッチを作成しないでください。
      2. 引っかき傷の後、P1000ピペットチップを使用して、1 mLの1x PBSをウェルにすばやく戻します。傷がつくウェルごとにこのプロセスを繰り返します。
        注:各引っかき傷に関連するばらつきを考えると、各実験条件で創傷の作成に複数のウェル(n = 3)を使用することをお勧めします。これらのステップ中にセルが1x PBSなしでいる期間を最小限に抑えることが重要であるため、迅速に作業してください。各ウェルから1x PBSを除去した後、各ウェルに創傷を発生させるのに5秒以上かかるべきではありません。
    4. 創傷を生成し、各ウェルに1x PBSを追加した後、明視野倒立顕微鏡を使用して傷を画像化し、この画像をベースライン創傷サイズ(時間0)として使用します。イメージを撮影するには、次の手順を実行します。
      1. 電源ボタンを押して、コンピュータと顕微鏡の電源を入れます( 材料の表を参照)。チャンバースライドをステージに置き、対物レンズダイヤルを5倍の倍率に回転させます。
      2. コンピュータのデスクトップにあるソフトウェアアイコンをダブルクリックして、イメージングソフトウェア( 材料の表を参照)を開きます。ソフトウェアのホーム画面の[ カメラ ]タブをクリックします。 ライブ ボタンをクリックして、 AxioCam IC タブのセルを視覚化します。
      3. 光がカメラとコンピューターの画面に通過できるように、ライトフィルターが完全に引き出されていることを確認します。チャンバースライドを手動で移動および/または回転させて、 AxioCam IC タブのライブ画像の中央に創傷領域を配置します。
      4. 画像を撮影するには、[スナップ]をクリックして、画像を含むAxioCam ICタブの横に新しいタブを開きます。
      5. この静止画を保存するには、ソフトウェアのホームページの左上にある ファイル をクリックして 保存|| 、ファイル名ボックスに ファイル名 を入力します。図をカールツァイス画像(*.czi)形式(デフォルト設定)で保存し、左側のバーで [デスクトップ ]を選択して、ファイルをZen lite 2012ソフトウェアプログラムでのみ開くことができる .czi ファイルとしてデスクトップに保存します。
      6. 画像を.tiffとして保存するには、[ファイル] | [名前を付けて保存] をクリックし| [ファイル名] ボックスにファイル名を入力します。[タイプとして保存]ボタンをクリックし、ドロップダウンメニューから[*.tiff]を選択して、フィギュアをタグ付き画像ファイル(*.tiff)として保存します。
        注:.tiff形式は、任意の画像処理ソフトウェアで開くことができます。
      7. チャンバースライドを手動で再配置して、同じウェル内の創傷の他のポイントでさらに2〜3枚の画像を撮影します。
        注:合計で、これにより、各ウェルの創傷の3〜4個の重複しない高倍率画像が得られます。
    5. 各ウェルから1x PBSを取り出し、1 mLのC2C12培地を加えます。
      注意: 創傷発生後にチャンバーウェルに溶液を除去または追加するときは、細胞がチャンバーから十分に剥がれる可能性があるため、積極的にピペットをかけすぎないように注意してください。さらに、チャンバーをよく傾けて、各ウェルの角で溶液の吸引と再導入を行い、細胞の単層の破壊を最小限に抑えます。
    6. O9-1細胞を含むインサートをチャンバーウェルの各ウェルに手動で配置して、ウェルインサート共存システムを組み立てます。インサートの底部が下にあるC2C12セルのすぐ上になるように、インサートをウェルにゆっくりと押し込みます。ウェルインサートコンストラクトをインキュベーターに戻します。
      注意: インサートの底部が下にあるC2C12セルに物理的に触れたり、機械的に破壊したりしないようにしてください。
    7. セルが合計9〜12時間移動できるようにします。最適な移動時間を決定するには、創傷作成後6時間で細胞を確認し、その後2〜3時間ごとに細胞を確認します。対照または陽性対照条件の細胞が創傷を完全に覆い始めたら、実験を終了する。
      注:コンストラクトの非接触性を考えると、間隔の移動の進行をチェックするときに、上にあるインサートをウェルから取り外す必要はありません。遊走性の変動性は、このアッセイで使用される細胞の種類、創傷生成時の細胞密度、作成された創傷の幅、および操作された細胞の実験条件(遺伝子ノックダウン、組換えタンパク質添加など)などの要因に応じて観察されます。これらの試薬の濃度は、メーカーの推奨事項からのガイダンスに従って実験的に決定する必要があります。

4. 移動する筋芽細胞の免疫蛍光染色とイメージング

  1. 移行アッセイを終了し、ウェルインサートシステムを分解する:
    1. 9〜1時間の移行期間(または実験条件で指定された代替時間)の後にO9-1セルインサートを取り外します。P1000ピペットを使用してC2C12培地を注意深く吸引します。チャンバーウェルに0.5 mLの1x PBSを加え、遊走後の細胞の最終画像を撮影します。
    2. 培地と混合した0.5 mLの1x PBSをすべて注意深く吸引し、キットの指示に従ってチャンバーウェルからプラスチックチャンバーを取り出し、下にあるスライドにC2C12細胞を入れたままにします。
      注意: チャンバーウェルを取り外すときは、スライドに付着しているC2C12細胞を破壊しないように注意してください。
  2. 免疫染色の実施:
    1. すぐにスライドを4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含むスライドホルダーに入れ、室温で10分間インキュベートします。4%PFAを注ぎ、0.1%Triton X-100含有1x PBS(1x PBST)をスライドホルダーに加えて、室温で15分間スライドを洗浄します。1x PBSTを注ぎ、スライドホルダーに1x PBSを加えて、室温で10分間スライドを洗浄します。この手順をもう一度繰り返して、合計2回の1x PBS洗浄を行います。
    2. スライドホルダーからスライドを取り外します。スライドの外縁を疎水性ペンでなぞり、スライドの周囲に疎水性の境界を作成し、スライドから溶液がこぼれるのを防ぎます。接着細胞を破壊しないように注意してください。
    3. 1%ウシ血清アルブミン(BSA)ブロッキング溶液(1x PBSで希釈)をスライドに加えます(スライドあたり~0.5 mL)。溶液がステップ 4.2.4 で作成した疎水性境界内に含まれていることを確認します。加湿したスライドチャンバー内で室温で1時間スライドをインキュベートします。
      注:ファロイジン免疫染色にはBSAブロッキングは必要ありませんが、プロトコルのこのステップでは、蛍光抗体染色とのカップリングが可能です。
    4. 1時間ブロッキングした後、スライドからブロッキング溶液を注ぎ、ファロイジン抗体(995 μLのBSA溶液に5 μLの抗体を加えて1%BSAブロッキング溶液で1:200に希釈)をスライドに加え、4°Cで一晩インキュベートします。ここでも、ステップ 4.2.4 で作成した疎水性境界内に溶液が含まれていることを確認します。ファロイジン抗体がAlexa Fluor-488色素に結合していることを考えると、スライドに添加する前後の抗体試薬の光曝露を最小限に抑えます。
    5. 翌日、光にさらされないように保護されたスライドホルダーにスライドを置きます(スライドホルダーをホイルで包むか、不透明なスライドホルダーを使用するなど)。スライドホルダー内の細胞を1x PBSで室温で10分間洗浄します。洗浄を繰り返して、合計3回の10分間の洗浄を行います。
    6. 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)含有封入剤を加え、スライドをガラスカバースリップで取り付けます。標準的な蛍光顕微鏡を使用して遊走した細胞を画像化します。

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結果

マウス筋芽細胞の遊走能に及ぼすNCCの影響
このアッセイは、筋芽細胞の移動能力に対するNCCの影響を評価するために最初に適用されました。 図1 は、アッセイの概略モデルの概要を示す。この影響をテストするために、スクラッチアッセイは、インサートの存在下で増殖したものと比較して、分離して増殖した筋芽細胞(NCCインサートなし)で実施されま?...

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ディスカッション

非標準的なWnt/平面細胞極性(PCP)シグナル伝達経路は、複数の発生24,25および疾患プロセス24,26に関与している非常に重要な細胞シグナル伝達経路です。胚発生中、非標準的なWntシグナル伝達は、シグナル伝達細胞からの分子シグナルの広範なネットワークを含み、最終的にはシグナル受信細胞にお?...

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開示事項

著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。

謝辞

この研究の一部は、NIHがO.T.にF30HL154324を、S.R.K.にK08HL121191およびR03HL154301を授与したことによって支援されました。著者らは、この原稿の 図1 の回路図が biorender.com で作成されたことを認めたいと思います。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma AldrichM-7522
Antifade mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200-10Stored at 4 °C
Bovine serum albuminSanta Cruz Biotechnologysc-2323Stored at 4 °C
C2C12 murine myoblast cell lineATCCCRL-1772
Cell culture flasks, 75 cm2ThermoFisher Scientific156499
Chamber Slide System, 4-wellThermoFisher Scientific154526
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM)Corning10-017-CVStored at 4 °C
Falcon conical centrifuge tubes, 15 mLFisher Scientific14-959-53A
Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membraneCorning353095
Fetal bovine serumFisher ScientificW3381EStored in 50 mL aliquots at -20 °C
Gelatin solution, 0.1%ATCCPCS-999-027Stored at 4 °C
Graduated and sterile pipette tips, 10 µLUSA Scientific1111-3810
Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mLMillipore SigmaESG1106
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100xGibco11140-050
Minimum essential medium (MEM)Corning10-022-CV
Mitomycin CRoche10107409001
Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mmSpringside ScientificHRTCG2455
O9-1 neural crest cell lineMillipore SigmaSCC049
Opti-MEM I, 1xGibco31985-070
Paraformaldehyde solution in PBS, 4%Santa Cruz Biotechnologysc-281692Stored at 4 °C
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin)Fisher ScientificW3470HStored in 10 mL aliquots at -20 °C
Phalloidin-iFluor 488Abcamab176753Stored at -20 °C, Keep out of light
Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4Corning21-040-CVStored at 4 °C
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)R&D Systems233-FB-025
Recombinant human/mouse Wnt5a proteinR&D Systems645-WN-010
Sodium pyruvate, 100 mMGibco11360-070
Square Petri dish with gridThomas Scientific1219C98
STO murine fibroblast feeder cellsATCCCRL-1503
Triton X-100 solutionSigma AldrichX100-100ML
Trypsin-EDTA, 0.25%Fisher ScientificW3513CStored at 4 °C
Zeiss Apotome.2 fluoresence microscopeCarl Zeiss AG
Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscopeCarl Zeiss AG
Zen lite 2012 microscopy softwareCarl Zeiss AGimaging software

参考文献

  1. Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
  2. Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093(2019).
  3. Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719(2019).
  4. Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).
  5. Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).
  6. Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
  7. Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
  8. Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
  9. Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
  10. Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
  11. Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
  12. Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
  13. Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).
  14. Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
  15. Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305(2016).
  16. Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
  17. Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456(2010).
  18. Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
  19. Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).
  20. Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
  21. Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).
  22. Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
  23. Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
  24. Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
  25. Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).
  26. Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
  27. Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
  28. Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).
  29. Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
  30. Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
  31. Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).
  32. Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).
  33. Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).

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