JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המחקר הנוכחי מתווה שיטה הניתנת לשחזור ומתיחה גבוהה לחקר אירועי איתות Wnt פרקריניים לא-קנוניים במבחנה. פרוטוקול זה יושם כדי להעריך את ההשפעה של איתות Wnt5a של פרקרין בתאי הצמרת העצבית של מורין ובמיובלסטים.

Abstract

איתות Wnt לא-קנוני מווסת את ארגון חוטי האקטין התוך-תאיים ואת הנדידה המקוטבת של תאי אב במהלך העובר. תהליך זה דורש אינטראקציות פרקריניות מורכבות ומתואמות בין תאים השולחים אותות וקולטי אותות. בהתחשב בכך שאינטראקציות אלה יכולות להתרחש בין סוגים שונים של תאים משושלות שונות, הערכת in vivo של פגמים ספציפיים לתאים יכולה להיות מאתגרת. המחקר הנוכחי מתאר שיטה בעלת יכולת שחזור גבוהה להערכת איתות Wnt פרקריני לא-קנוני במבחנה. פרוטוקול זה תוכנן עם היכולת (1) לבצע הערכות פונקציונליות ומולקולריות של איתות Wnt לא-קנוני בין כל שני סוגי תאים בעלי עניין; (2) לנתח את התפקיד של מולקולות שולחות אותות לעומת מולקולות קולטות אותות במסלול האיתות הלא-קנוני של Wnt; ו-(3) לבצע ניסויי הצלה פנוטיפיים בגישות מולקולריות או פרמקולוגיות סטנדרטיות.

פרוטוקול זה שימש להערכת איתות Wnt לא-קנוני בתיווך תאי עצב (NCC) במיובלסטים. נוכחותם של NCCs קשורה למספר מוגבר של פילופודיה ציטופלסמית חיובית לפלואידין ולמליפודיה במיובלסטים ונדידת מיובלסטים משופרת בבדיקת ריפוי פצעים. ציר Wnt5a-ROR2 זוהה כמסלול איתות Wnt לא-קנוני חיוני בין NCC לבין אבות קרדיומיובלסטים בשדה הלב השני (SHF). לסיכום, זהו פרוטוקול נוח מאוד לחקר מנגנוני איתות Wnt פרקריניים לא-קנוניים במבחנה.

Introduction

איתות Wnt לא-קנוני הוא מסלול משומר אבולוציונית המווסת את ארגון החוטים התאיים ואת ההגירה הכיוונית. מסלול זה היה מעורב בתהליכים ביולוגיים מרובים, כולל מורפוגנזה של רקמה עוברית 1,2,3, אנגיוגנזה לימפטית וכלי דם 4,5,6,7, וצמיחת סרטן וגרורות 8,9,10 . ברמה התאית, איתות Wnt לא-קנוני מתבצע באמצעות אינטראקציות פרקריניות מתואמות בין תאים השולחים אותות וקולטי אותות. אינטראקציות אלה מתרחשות לעתים קרובות בין תאים של שושלות או סוגים שונים ומערבות רשת מולקולרית מגוונת הכוללת עד 19 ליגנדות וקולטנים מרובים, קולטנים משותפים ואפקטים של התמרת אותות במורד הזרם11. מה שמסבך עוד יותר את תהליך האיתות הזה, מחקרים קודמים הראו כי שילובי ליגנד-קולטן יכולים להשתנות באופן תלוי הקשר ורקמות 12,13, וכי אותן ליגנדות מקור המניעות איתות Wnt לא-קנוני בתאים קולטי אותות יכולות להיות מיוצרות על ידי מספר סוגי תאים השולחים אותות 14,15 . בהתחשב במורכבות התאית והמולקולרית הקשורה לאיתות Wnt לא-קנוני, היכולת לחקור מנגנונים אינדיבידואליים ורלוונטיים מבחינה קלינית in vivo הייתה מוגבלת.

נעשו ניסיונות לחקור איתות Wnt לא-קנוני באמצעות טכניקות של תרביות תאים במבחנה. לדוגמה, מבחני ריפוי פצעים שבוצעו במונולרים תאיים שימשו להערכה פונקציונלית של נדידה כיוונית תאית 4,16,17,18,19. טכניקות אימונוסטינינג שימשו לביצוע ניתוחים מרחביים של ביטוי חלבונים על פני השטח כדי להעריך שינויים שאינם נגרמים על ידי Wnt במורפולוגיה תאית 7,10, ארכיטקטורה וקיטוב אסימטרי18,19,20. אף על פי שגישות אלה סיפקו כלים חשובים לאפיון פנוטיפים הקשורים ל-Wnt בתאים קולטי אותות, היעדרם של רכיבים השולחים אותות בפרוטוקולים אלה מגביל את יכולתם ליצור מודלים מדויקים של מנגנוני איתות פראקריניים שנצפו in vivo. כתוצאה מכך, עדיין קיים צורך קריטי בפיתוח מערכות חוץ גופיות המאפשרות הערכה איתנה וניתנת לשחזור של אינטראקציות איתות פראקריניות בין תאים השולחים אותות וקולטים של מסלול Wnt הלא-קנוני, במיוחד אלה של סוגי תאים שונים.

לשם כך, המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה ליצור פרוטוקול למודל אינטראקציות איתות Wnt לא-קנוניות במבחנה. פיתחנו מערכת קולקולטורה ללא מגע המשחזרת רכיבים של שליחת אותות וקבלת אותות של אינטראקציות אלה ומאפשרת שימוש בגישות מולקולריות, גנטיות או פרמקולוגיות סטנדרטיות כדי לחקור באופן עצמאי מנגנוני קולטני ליגנד ספציפיים במסלול Wnt הלא-קנוני. מנגנונים של איתות Wnt בתיווך NCC נבדקו במיובלסטים באמצעות קווי תאי מורין מבוססים. כהוכחה עקרונית, מודל זה שימש כדי לאשש ממצאים של מחקרי in vivo קודמים בעכברים המרמזים על ציר Wnt5a-ROR2 כמסלול איתות Wnt לא-קנוני רלוונטי בין NCCs 21 לבין אבות קרדיומיובלסטים SHF 3,22,23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. התפשטות קדם-ניסויית ומעבר של תאים

  1. תרבית תאים C2C12:
    1. הכינו 500 מ"ל של מדיום תרבית C2C12 על ידי שילוב מדיום הנשר המתוקן (DMEM) של דולבקו עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    2. להפשיר בקבוקון של C2C12 תאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. בזמן שתאי C2C12 מופשירים, יש להוסיף 5 מ"ל של מדיום C2C12 לצינור חרוטי של 15 מ"ל. מיד להעביר את התאים מופשרים לצינור 15 מ"ל באמצעות פיפטה P1000.
      הערה: תאי C2C12 הם תאי מורין מיובלסט ששימשו בעבר ואומתו כקו תאים ראשוני למידול אבות קרדיומיובלסט.
    3. מערבבים בעדינות תאי C2C12 בצינור החרוטי באמצעות פיפטה סרולוגית. לאחר מכן, הוסף את כל נפח התאים המופשרים במדיום C2C12 (6 מ"ל) לבקבוקבגודל 75 ס"מ 2.
    4. הוסיפו 6 מ"ל של C2C12 בינוני טרי לבקבוקון לקבלת נפח כולל של 12 מ"ל. סובבו בעדינות את הבקבוקון כך שתמיסת התא והמדיה תכסה את כל החלק התחתון של הצלוחית. מניחים את הבקבוקון באינקובטור של תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) כדי לאפשר לתאים להידבק.
    5. אפשרו לתאים להתרחב באינקובטור עד שיגיעו למפגש של ~60%.
      הערה: ניתן לקבוע זאת על ידי הסרה תקופתית של התאים מהאינקובטור ובדיקה מהירה של המפגש שלהם תחת מיקרוסקופ. הקפד למזער את הזמן שבו תאים מוסרים מן האינקובטור.
  2. העברת תאי C2C12:
    1. חמם את C2C12 בינוני, 500 מ"ל של 1x PBS, ו 0.25% טריפסין-EDTA באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר חימום הריאגנטים, מעבירים את כל הריאגנטים למכסה המנוע של תרבית התאים.
    2. הביאו את הבקבוקון המכיל את תאי C2C12 לתוך מכסה המנוע של תרבית התאים. יש לשטוף בעדינות את הבקבוקון המכיל את תאי C2C12 עם PBS חם 1x פעמיים.
      1. הטה את הבקבוקון בזווית של 45° ושאף את המדיום C2C12 באמצעות פיפטה מזכוכית המחוברת לשאיבה בוואקום. תוך שמירה על זווית של 45°, הוסיפו בזהירות 10 מ"ל של PBS חם 1x לפינת הבקבוקון באמצעות פיפטה סרולוגית. הניחו את הבקבוקון שטוח על פני השטח והזיזו בעדינות את הבקבוקון בתנועות מעגליות כדי להבטיח שה-PBS 1x ישטוף את כל ה-monolayer של התאים.
        הערה: היזהר שלא לשבש את ה-C2C12 החד-שכבתי בעת שאיפת המדיום.
    3. יש להסיר את ה-PBS 1x לאחר השטיפה השנייה. הוסיפו 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לבקבוקון, הזיזו בעדינות את הבקבוקון כפי שתואר לעיל כדי לאפשר לתמיסת הטריפסין-EDTA להתפשט על פני כמה שיותר מהמונולאייר והניחו את הבקבוקון באינקובטור למשך 2 דקות.
    4. לאחר דגירה של 2 דקות, הסר את הבקבוקון מהאינקובטור והקש עליו בעדינות כדי לנתק את כל התאים הנותרים.
    5. הוסיפו 9 מ"ל של מדיום C2C12 לבקבוקון עם פיפטה סרולוגית כדי להרוות את הטריפסין. באמצעות פיפטה סרולוגית, בעדינות לשטוף את התאים עם המדיום ולאסוף את 10 מ"ל של השעיית תאים טריפסיניזציה. הוסף 10 מ"ל של מתלה התא לצינור חרוטי טרי של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 100 × גרם למשך 5 דקות.
    6. החזירו את הצינור החרוטי למכסה המנוע של תרבית התאים והסירו את הסופר-נאטנט בעזרת פיפטה מזכוכית המחוברת לשאיבה בוואקום. בזמן שאיפת הסופר-נטנט, היזהרו לא להפריע לכדור התא בתחתית הצינור החרוטי. כדי לעשות זאת, להשאיר ~ 0.2 מ"ל של supernatant בצינור חרוטי. יש לתלות את התאים ב-10 מ"ל של מדיום C2C12 טרי.
    7. לקבלת מעבר נוסף, יש להוסיף 1 מ"ל מהתאים המחיים לתוך בקבוקבגודל 75 ס"מ 2. מוסיפים 11 מ"ל של C2C12 בינוני לבקבוקון עם פיפטה סרולוגית ומניחים את הבקבוקון באינקובטור.
  3. תרבית תאי STO:
    1. הכינו את תרבית STO בינונית על ידי ייצור 500 מ"ל של DMEM עם 7% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-2 ננומטר L-גלוטמין.
    2. הכינו 0.1% ג'לטין על ידי הוספת 0.5 גרם אבקת ג'לטין לבקבוק המכיל 500 מ"ל של מים ברמת רקמות או אוטוקלב. הוסף 7 מ"ל של תמיסת ג'לטין 0.1% לבקבוקבגודל 75 ס"מ 2. סובבו את הבקבוקון כך שתמיסת הג'לטין תכסה את כל תחתית הצלוחית. תנו לבקבוקון לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במכסה המנוע של תרבית התאים.
    3. לאחר דגירה של 30 דקות, יש להסיר את עודפי הג'לטין באמצעות פיפטה המחוברת לשאיבה בוואקום. תנו לצלוחיות להישאר באינקובטור עוד 30 דקות לפני השימוש.
    4. הפשרת בקבוקון של תאי STO באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. באמצעות פיפטה P1000, מעבירים מיד את התאים המופשרים לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום תרבית STO טרי.
      הערה: תאי STO הם פיברובלסטים עובריים של מורין המשמשים באופן שגרתי כתאי הזנה בפרוטוקולים של תרביות תאים.
    5. מערבבים בעדינות את התאים בצינור החרוטי באמצעות פיפטה סרולוגית. הוסף את כל נפח התאים (6 מ"ל) לבקבוקון מצופה ג'לטין בגודל75 ס"מ 2. סובב את הבקבוקון כדי לוודא שמתלה התא מופץ היטב לאורך החלק התחתון של הצלוחית.
    6. הוסיפו 6 מ"ל של STO בינוני טרי לבקבוקון לקבלת נפח כולל של 12 מ"ל. סובב את הבקבוקון כמתואר לעיל כדי להבטיח שהתאים והמדיום מפוזרים היטב לאורך החלק התחתון של הבקבוקון. מניחים את הבקבוקון באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים להידבק. אפשרו לתאים להתרבות באינקובטור עד שהם מגיעים למפגש של ~60-70%.
  4. מעבר תאי STO:
    1. מדיום תאי STO חם, 1xPBS ו-0.25% טריפסין-EDTA באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. יש לשטוף בעדינות את הבקבוקון המכיל תאי STO עם PBS חם פי 1 כמתואר בשלב 1.2.2.1.
    3. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לבקבוקון באמצעות פיפטה P1000. מניחים את הבקבוקון באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    4. לאחר 5 דקות דגירה, להסיר את הבקבוק מן החממה. הקישו בעדינות על הבקבוקון כדי לנתק את התאים הנדבקים.
    5. הוסף 9 מ"ל של מדיום STO לבקבוקון כדי להרוות את הטריפסין ולאסוף את 10 מ"ל של תרחיף תאים טריפסיני כמתואר לעיל. הוסף 10 מ"ל של מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 100 × גרם למשך 5 דקות.
    6. הסר את supernatant ו resuse את התאים ב 10 מ"ל של מדיום STO כפי שתואר לעיל. לקבלת מעבר נוסף, יש להוסיף 1 מ"ל מהתאים המחיים לתוך בקבוקבגודל 75 ס"מ 2. הוסף 11 מ"ל של מדיום STO, סובב את הבקבוקון כדי להבטיח חלוקה שווה של התאים והמדיום לאורך החלק התחתון של הבקבוקון, והנח את הבקבוקון באינקובטור.
  5. תרבית תאי STO לא פעילה ותכשיר מדיום בסיסי של תאי O9-1:
    1. הכן את תרבית הבסיס של תאי O9-1 על-ידי ערבוב של 500 מ"ל של DMEM עם 15% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2 ננומטר L-גלוטמין, 0.1 mM חומצות אמינו לא חיוניות מינימליות, נתרן פירובט 1 ננומטר ובטא-מרקפטואתנול של 55 מיקרומטר.
    2. הכינו תמיסת מיטומיצין C ב-1x PBS בריכוז של 0.5 מ"ג/מ"ל על ידי הוספת 4 מ"ל של 1x PBS ישירות לבקבוקון מיטומיצין C. פיפטה את התמיסה מספר פעמים עם פיפטה P1000. כדי להמיס עוד יותר את המיטומיצין C ב-PBS אחד, הניחו את הבקבוקון על מערבל מערבולות או נדנדת ספסל למשך 45 דקות עד שעה.
    3. השבת את תאי ה-STO על-ידי טיפול בלוחות ה-STO בריכוז סופי של 0.01 מ"ג/מ"ל מיטומיצין C שנוסף למדיום ה-STO הסטנדרטי. הניחו את לוחות ה-STO בתוך האינקובטור למשך שעתיים, תוך הקפדה על הגנה על הבקבוקון המכיל מיטומיצין C מפני אור על ידי מזעור זמן השהייה מחוץ לאינקובטור. לאחר טיפול מיטומיצין, יש לשטוף את התאים ב-PBS 1x פעמיים כפי שמתואר בשלב 1.2.2.1.
      הערה: מיטומיצין C מעכב את התפשטות תאי ה-STO, כך שניתן להשתמש בהם ליצירת מדיום מותנה במשך מספר ימים מבלי להפוך לתגובת יתר בבקבוקון.
    4. לאחר הסרת PBS 1x, הוסף 12 מ"ל של מדיום תרבית בסיסית O9-1 לתרביות תאי STO מומתים ודגרה אותם במשך 24 שעות. אסוף את מדיום התרבות הבסיסית STO + O9-1 המותנה והשהה אותו בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל עטופים בנייר כסף כדי להגן עליו מפני אור.
    5. הוסף 12 מ"ל של תרבית בסיסית O9-1 טרייה לתרביות תאי STO מומתים כמתואר לעיל. חזור על שלב זה על ידי הוספת מדיום תרבית בסיסית O9-1 טרי לאותם אגפים המכילים את תאי ה- STO המומתים כל 24 שעות.
      הערה: לאחר טיפול מיטומיצין C, תאי ה-STO המומתים אינם יכולים להתרבות; לפיכך, צלוחיות המכילות את תאי STO מומתים ניתן לעשות שימוש חוזר כדי ליצור מדיום מותנה.
    6. אחסנו את הצינורות החרוטיים עטופים בנייר כסף של 50 מ"ל המכילים מדיום תרבית בסיסית מותנה ולא פעילה של STO + O9-1 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לאיסוף כולל של 500 מ"ל מהמדיום.
  6. תרבית תאים O9-1:
    1. הכינו מדיום של תרבית גידול תאים O9-1 באמצעות 500 מ"ל של מדיום בסיסי מותנה STO + O9-1, והוסיפו 103 יחידות של גורם מעכב לוקמיה (LIF) ו-25 ng/mL גורם גדילה פיברובלסטי בסיסי (basic-FGF).
    2. הכינו צלוחיות מצופות ג'לטין 0.1% כמתואר בשלבים 1.3.2-1.3.3.
    3. הפשרת בקבוקון של תאי O9-1 באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מעבירים מיד את התאים המופשרים לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום גידול O9-1 טרי.
      הערה: קו התאים O9-1 הוא קו התאים העצבי היציב והרב-פוטנטי היחיד שנוצר מהעכבר. קו תאים זה משמש בדרך כלל בניסויים עצביים במבחנה .
    4. מערבבים בעדינות את התאים באמצעות פיפטה סרולוגית. מוסיפים את כל 6 מ"ל התאים לבקבוקון מצופה ג'לטין בגודל 75 ס"מ2 .
    5. הוסף 6 מ"ל של מדיום גידול O9-1 לבקבוקון עבור נפח כולל של 12 מ"ל. מניחים את הבקבוקון באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים להידבק. אפשרו לתאים להתרבות באינקובטור עד שהם מגיעים למפגש של ~60-70%.
  7. מעבר תאי O9-1:
    1. בינוני צמיחה חם O9-1, 1x PBS ו- 0.25% טריפסין-EDTA באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. יש לשטוף בעדינות את הצלחת המכילה תאי O9-1 עם PBS חם 1x פעמיים כמתואר בשלב 1.2.2.1.
    3. מוסיפים 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לבקבוקון ומניחים אותו באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    4. לאחר 5 דקות דגירה, הסר את הבקבוקון מהאינקובטור והקש על הבקבוקון בעדינות כדי לנתק את כל התאים הנדבקים.
    5. הוסף 9 מ"ל של מדיום צמיחה O9-1 לבקבוקון כדי להרוות את הטריפסין. לאסוף 10 מ"ל של השעיית התא טריפסיני ולהוסיף 10 מ"ל של השעיית תא זה צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה את הצינור ב 100 × גרם במשך 5 דקות.
    6. הסר את supernatant ו resuse את התאים ב 10 מ"ל של מדיום הצמיחה O9-1. לקבלת מעבר נוסף, יש להוסיף 1 מ"ל מהתאים המחודשים לבקבוקוןבגודל 75 ס"מ 2. הוסף 11 מ"ל של מדיום צמיחה O9-1 והנח את הבקבוקון המכיל את התאים ב 12 מ"ל של בינוני באינקובטור 37 מעלות צלזיוס.

2. ציפוי תאים במערכת קולקולטורה

  1. ציפוי תאי C2C12:
    1. לאחר טריפסיניזציה (כמתואר בשלב 1.2), יש לתלות מחדש את גלולת התא C2C12 ב-10 מ"ל של מדיום C2C12. דלל את התאים ביחס של 1:20 במדיום C2C12 על ידי הסרת 0.5 מ"ל מתאי C2C12 המחודשים והוספתם לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל המכיל 9.5 מ"ל של מדיום C2C12 טרי. מערבבים בעדינות את המתלה עם פיפטה סרולוגית.
    2. הוסף 1 מ"ל של תאי C2C12 מדולל 1:20 לכל באר של באר חדשה בת 4 תאים באמצעות פיפטה P1000 והנח את הבאר בעלת 4 התאים באינקובטור.
  2. ציפוי תא O9-1 מוסיף:
    1. לאחר טריפסינליזציה, יש לתלות מחדש את גלולת התא O9-1 ב-10 מ"ל של מדיום גדילה O9-1. דלל את התאים ביחס של 1:20 במדיום גדילה O9-1 על ידי הסרת 0.5 מ"ל מתאי C2C12 שעברו החייאה והוספתם לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל המכיל 9.5 מ"ל של מדיום גידול O9-1 טרי. מערבבים בעדינות את המתלה עם פיפטה סרולוגית.
    2. הנח תוסף חדיר יחיד (ראה טבלת החומרים) בתוך כל באר של באר חדשה בת 4 תאים מלאה במדיום גידול O9-1 של 1 מ"ל.
      הערה: באר זו בעלת 4 התאים צריכה להיות שונה מזו המכילה את תאי C2C12 משלב 2.1.3.
    3. הוסף 300 μL של תרחיף תא O9-1 מדולל לכל תוספת באמצעות פיפטה P1000. ודא שהחלק התחתון של כל תוספת שקוע בתוך הבאר המלאה ב-1.3 מ"ל של מדיום צמיחה O9-1. מניחים את הבאר באינקובטור 37 מעלות צלזיוס.
  3. (אופציונלי). בצע הפלת siRNA בתאי O9-1 או C2C12.
    1. בצע הפלת גנים על ידי siRNA 18-24 שעות לאחר ציפוי או תוספות תא O9-1 או בארות תא תא C2C12.
      1. יש לדלל את ה-siRNA ואת מגיב הטרנספקציה במדיום מופחת בסרום (ראו טבלת חומרים) בהתאם להמלצות היצרנים ולריכוזים הרצויים לניסוי. מערבבים בעדינות את ה-siRNA המדולל ואת מגיב הטרנספקציה (1:1) ודוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 7 דקות.
        הערה: בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בריכוזים של 50 ננומטר מכיוון שריכוז siRNA זה נקבע כדי לגרום לפגיעה מספקת בביטוי גני המטרה.
      2. הוסף את קומפלקסי ה-siRNA-ליפידים לתוספות התאים O9-1 או לבארות התא C2C12 כפי שנקבע על ידי התכנון הניסיוני ודגירה של התאים עם קומפלקסי siRNA-ליפידים במשך ~36-48 שעות.

3. ביצוע בדיקת פצעים והערכה כמותית של נדידת מיובלסט

  1. בדיקת הפצע:
    1. אפשר לתאי O9-1 ולבארות התאים C2C12 להידבק ולהתרבות באינקובטור עד ששני התאים יהיו במפגש של ~70-80% לפני שתמשיך עם חלק זה של הפרוטוקול. אם התאים גדלים ב->90% מפגש, אל תמשיכו בבדיקת השריטות, מכיוון שהתאים רק יתנתקו מהבאר.
    2. חם 1x PBS ו C2C12 בינוני על ידי הצבתם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    3. הסר היטב מדיום סופר-נאטנטי מתא C2C12 ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS אחד. הסר את 1x PBS ומיד לגרד את התאים עם קצה פיפטה P10 סטרילי.
      1. מעבירים את קצה הפיפטה הסטרילי P10 בחוזקה בכיוון אחד כדי להתפרס על כל האורך או הרוחב של המונולייר של התא (למשל, מימין לשמאל, מלמעלה למטה). הקפד לגרד כל באר המכילה תאים רק פעם אחת.
        הערה: כדי למטב את תוצאות הגירוד, יש לגרד בארות של תנאי ניסוי שונים ברמת מפגש דומה. כדי לעשות זאת, ודא שלכל באר בת 4 תאים יש תאים עבור כל תנאי ניסוי נדרש (למשל, ובכן #1 בקרה שלילית, ובכן #2 בקרה חיובית). בנוסף, השתמש פיפטה P10 סטרילית חדשה עבור כל שריטה והפעל כמות דומה של כוח על פיפטה בכל פעם. אל תנסה ליצור יותר משריטה אחת בכל באר.
      2. לאחר הגירוד, הוסיפו במהירות 1 מ"ל של PBS 1x בחזרה לבאר באמצעות קצה פיפטה P1000. חזור על תהליך זה עבור כל באר כי יהיה שרוט.
        הערה: בהתחשב בשונות הקשורה לכל שריטה, מומלץ להשתמש במספר בארות (n = 3) ליצירת פצעים בכל מצב ניסויי. עבוד במהירות מכיוון שחיוני למזער את משך הזמן שבו התאים נמצאים ללא PBS אחד במהלך שלבים אלה. לאחר הסרת 1x PBS מכל באר, אחד לא צריך לקחת יותר מ 5 s כדי ליצור פצע בכל באר.
    4. לאחר יצירת פצע והוספת PBS 1x בחזרה לכל באר, דמיין את השריטה באמצעות מיקרוסקופ הפוך של שדה בהיר והשתמש בתמונה זו כגודל הפצע הבסיסי (זמן 0). כדי לצלם תמונות, בצע את השלבים הבאים:
      1. הפעל את המחשב ואת המיקרוסקופ (עיין בטבלת החומרים) על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה. הנח את שקופית התא על הבמה וסובב את חוגת המטרה להגדלה של פי 5.
      2. פתח את תוכנת ההדמיה (עיין בטבלת החומרים) על-ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה בשולחן העבודה של המחשב. לחץ על הכרטיסייה מצלמה במסך הבית של התוכנה. לחץ על לחצן Live כדי להציג באופן חזותי את התאים בכרטיסייה AxioCam IC .
      3. ודא שמסנן האור נמשך כל הדרך החוצה כדי לאפשר לאור לעבור למצלמה ולמסך המחשב. הזז ו/או סובב ידנית את שקופית התא כדי למקם את אזור הפצע במרכז התמונה החיה בכרטיסיית AxioCam IC .
      4. כדי לצלם תמונות, לחץ על הצמד כדי לפתוח כרטיסייה חדשה לצד הכרטיסיה AxioCam IC המכילה את התמונה.
      5. כדי לשמור תמונת סטילס זו, לחץ על הקובץ בפינה הימנית העליונה של דף הבית של התוכנה | לשמור בשם | הזן את שם הקובץ בתיבה שם הקובץ. שמור את הדמות בתבנית Carl Zeiss image (*.czi) (הגדרת ברירת המחדל), ובחר שולחן עבודה בסרגל בצד שמאל כדי לשמור את הקובץ בשולחן העבודה כקובץ .czi, שניתן לפתוח רק בתוכנת Zen lite 2012.
      6. כדי לשמור את התמונה .tiff, לחץ על קובץ | לשמור בשם | הזן את שם הקובץ בתיבה שם הקובץ. שמור את האיור כקובץ תמונה מתויג (*.tiff) על ידי לחיצה על לחצן שמור כסוג ובחירה באפשרות *.tiff מהתפריט הנפתח.
        הערה: ניתן לפתוח את פורמט .tiff בכל תוכנת עיבוד תמונה.
      7. מקם מחדש באופן ידני את שקופית התא כדי לצלם 2-3 תמונות נוספות בנקודות אחרות של הפצע באותה באר.
        הערה: בסך הכל, התוצאה תהיה 3-4 תמונות לא חופפות, בהגדלה גבוהה של הפצע בכל באר.
    5. הסר את ה- PBS 1x מכל באר והוסף 1 מ"ל של מדיום C2C12.
      הערה: יש להיזהר שלא לבצע פיפטה אגרסיבית מדי בעת הסרה או הוספה של תמיסות לתא היטב לאחר יצירת פצעים, שכן הדבר עלול לגרום לתאים להתנתק מהתא היטב. בנוסף, הטה את התא היטב, כך שניתן יהיה לבצע שאיפה והצגה מחדש של פתרונות בפינות של כל באר כדי למזער את ההפרעה החד-שכבתית של התא.
    6. הרכיבו את מערכת הקידוח על ידי מיקום ידני של התוספות המכילות את תאי O9-1 בכל באר של החדר. דחפו בעדינות את התוספות כלפי מטה לתוך הבאר, כך שתחתית התוסף ממוקמת בדיוק מעל תאי C2C12 שמתחתיהם. החזירו את מבני הבאר לאינקובטור.
      הערה: אל תאפשר לחלק התחתון של התוסף לגעת פיזית ולשבש מכנית את תאי C2C12 שמתחתיהם.
    7. אפשר לתאים לנדוד למשך 9-12 שעות בסך הכל. כדי לקבוע את זמן הנדידה האופטימלי, בדוק את התאים בשעה 6 שעות לאחר יצירת הפצע, ולאחר מכן כל 2-3 שעות לאחר מכן. סיים את הניסוי כאשר התאים בשליטה או בתנאי בקרה חיוביים מתחילים לכסות לחלוטין את הפצע.
      הערה: בהתחשב באופי ללא מגע של המבנה, אין צורך להסיר את ההוספה העודפת מהבארות בעת בדיקת התקדמות ההעברה במרווחי זמן. שונות נודדת תיראה בהתאם לגורמים כגון סוגי התאים המשמשים בבדיקה זו, צפיפות התאים בזמן יצירת הפצע, רוחב הפצע שנוצר ותנאי ניסוי של תאים שעברו מניפולציה (למשל, נפילת גנים, תוספת חלבון רקומביננטי). ריכוזים של ריאגנטים אלה צריכים להיקבע באופן ניסיוני עם הדרכה מהמלצות היצרן.

4. צביעה אימונופלואורסצנטית והדמיה של מיובלסטים נודדים

  1. סיום בדיקת ההעברה ופירוק מערכת הכנסת הבאר:
    1. הסר את תוספות התא O9-1 לאחר תקופת העברה של 9-12 שעות (או זמן חלופי שנקבע על-ידי תנאי הניסוי). שאפו בזהירות את המדיום C2C12 באמצעות פיפטה P1000. הוסף 0.5 מ"ל של PBS 1x לבארות התא, וצלם תמונות סופיות של תאים לאחר נדידה.
    2. שאפו בזהירות את כל 0.5 מ"ל של 1x PBS מעורבב עם בינוני והסר את תאי הפלסטיק מבארות התא באמצעות הוראות ערכה, והשאיר את השקופית הבסיסית המכילה את תאי C2C12.
      הערה: היזהר שלא לשבש את תאי C2C12 הנדבקים לשקופית בעת הסרת בארות התא.
  2. ביצוע אימונוסטינינג:
    1. הניחו מיד את השקופית במחזיק שקופיות המכיל 4% פרפורמלדהיד (PFA) ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שפכו החוצה את ה-PFA של 4% והוסיפו 0.1% Triton X-100 המכיל 1x PBS (1x PBST) למחזיק השקופיות כדי לשטוף את המגלשה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שפכו את ה-PBST 1x והוסיפו PBS אחד למחזיק השקופיות כדי לשטוף את המגלשה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה פעם נוספת לקבלת סך של שתי כביסות PBS 1x.
    2. הסר את השקופית ממחזיק השקופית. עקבו אחר הקצוות החיצוניים של השקופית בעזרת עט הידרופובי כדי ליצור גבול הידרופובי סביב המגלשה כדי למנוע שפיכת תמיסות מהשקופית. היזהרו לא להפריע לתאים הנדבקים.
    3. הוסף תמיסת חסימה של אלבומין בסרום בקר (BSA) (מדולל ב-1x PBS) לשקופית (~0.5 מ"ל לכל שקופית). ודא שהתמיסה כלולה בגבול ההידרופובי שנוצר בשלב 4.2.4. יש לדגור על המגלשה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בתא שקופיות לח.
      הערה: למרות שחסימת BSA אינה נדרשת עבור חיסון של פלואידין, שלב זה בפרוטוקול מאפשר צימוד עם צביעת נוגדנים פלואורסצנטיים.
    4. לאחר חסימה במשך שעה אחת, שפכו את תמיסת החסימה מהשקופית, הוסיפו נוגדן פאלוידין (מדולל ל-1:200 בתמיסת חסימת BSA של 1% על ידי הוספת 5 μL של הנוגדן ל-995 μL של תמיסת BSA) למגלשה ודגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שוב, ודא שהפתרון כלול בגבול ההידרופובי שנוצר בשלב 4.2.4. בהתחשב בכך שנוגדן הפלואידין מצומד לצבע Alexa Fluor-488, יש למזער את החשיפה לאור של מגיב הנוגדן לפני ואחרי הוספה לשקופית.
    5. למחרת, מקם את השקופית במחזיק שקופיות המוגן מפני חשיפה לאור (לדוגמה, עטוף את מחזיק השקופיות בנייר כסף או השתמש במחזיק שקופיות שאינו שקוף). שטפו את התאים במחזיק השקופיות עם PBS אחד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזרו על הכביסה במשך שלוש כביסות של 10 דקות בסך הכל.
    6. הוסף מדיום הרכבה 4',6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI) והרכב את השקופיות עם כיסויי זכוכית. דמיינו את התאים שהיגרו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ההשפעות של NCCs על יכולת הנדידה של מיובלסטים של מורין
בדיקה זו יושמה לראשונה כדי להעריך את ההשפעה של NCCs על יכולת הנדידה של מיובלסטים. איור 1 מתאר את המודל הסכמטי של הבדיקה. כדי לבחון השפעה זו, בוצעו בדיקות שריטה עם מיובלסטים שגודלו בבידוד (ללא תוספות NCC) בהשוואה לאלה ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מסלול האיתות הלא-קנוני Wnt/קוטביות התא המישורי (PCP) הוא מסלול איתות תאי בעל חשיבות קריטית שהיה מעורב במספר תהליכים התפתחותיים 24,25 ומחלות 24,26. במהלך ההתפתחות העוברית, איתות Wnt לא-קנוני כולל רשת נרחבת של אותות מולקולריים מתאי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרסי NIH F30HL154324 ל- O.T. ו- K08HL121191 ו- R03HL154301 ל- S.R.K. המחברים רוצים להכיר בכך שהסכימה באיור 1 בכתב היד הזה נוצרה עם biorender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma AldrichM-7522
Antifade mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200-10Stored at 4 °C
Bovine serum albuminSanta Cruz Biotechnologysc-2323Stored at 4 °C
C2C12 murine myoblast cell lineATCCCRL-1772
Cell culture flasks, 75 cm2ThermoFisher Scientific156499
Chamber Slide System, 4-wellThermoFisher Scientific154526
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM)Corning10-017-CVStored at 4 °C
Falcon conical centrifuge tubes, 15 mLFisher Scientific14-959-53A
Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membraneCorning353095
Fetal bovine serumFisher ScientificW3381EStored in 50 mL aliquots at -20 °C
Gelatin solution, 0.1%ATCCPCS-999-027Stored at 4 °C
Graduated and sterile pipette tips, 10 µLUSA Scientific1111-3810
Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mLMillipore SigmaESG1106
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100xGibco11140-050
Minimum essential medium (MEM)Corning10-022-CV
Mitomycin CRoche10107409001
Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mmSpringside ScientificHRTCG2455
O9-1 neural crest cell lineMillipore SigmaSCC049
Opti-MEM I, 1xGibco31985-070
Paraformaldehyde solution in PBS, 4%Santa Cruz Biotechnologysc-281692Stored at 4 °C
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin)Fisher ScientificW3470HStored in 10 mL aliquots at -20 °C
Phalloidin-iFluor 488Abcamab176753Stored at -20 °C, Keep out of light
Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4Corning21-040-CVStored at 4 °C
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)R&D Systems233-FB-025
Recombinant human/mouse Wnt5a proteinR&D Systems645-WN-010
Sodium pyruvate, 100 mMGibco11360-070
Square Petri dish with gridThomas Scientific1219C98
STO murine fibroblast feeder cellsATCCCRL-1503
Triton X-100 solutionSigma AldrichX100-100ML
Trypsin-EDTA, 0.25%Fisher ScientificW3513CStored at 4 °C
Zeiss Apotome.2 fluoresence microscopeCarl Zeiss AG
Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscopeCarl Zeiss AG
Zen lite 2012 microscopy softwareCarl Zeiss AGimaging software

References

  1. Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
  2. Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093(2019).
  3. Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719(2019).
  4. Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).
  5. Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).
  6. Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
  7. Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
  8. Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
  9. Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
  10. Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
  11. Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
  12. Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
  13. Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).
  14. Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
  15. Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305(2016).
  16. Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
  17. Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456(2010).
  18. Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
  19. Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).
  20. Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
  21. Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).
  22. Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
  23. Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
  24. Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
  25. Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).
  26. Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
  27. Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
  28. Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).
  29. Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
  30. Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
  31. Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).
  32. Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).
  33. Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved