JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تشير هذه المقالة إلى تثبيط CENP-E في الجسم الحي من خلال جراحة البطن وحقن الخصية GSK923295 ، وهو نموذج قيم لانقسام الانقسام الاختزالي للذكور. باستخدام التألق المناعي وقياس التدفق الخلوي ومقايسات المجهر الإلكتروني النافذ ، نظهر أن تثبيط CENP-E يؤدي إلى اختلال الكروموسوم وعدم استقرار الجينوم في الخلايا المنوية للفئران.

Abstract

في حقيقيات النوى، يعد الانقسام الميوزي ضروريا لاستقرار الجينوم والتنوع الجيني في التكاثر الجنسي. تعتبر التحليلات التجريبية للخلايا المنوية في الخصيتين حاسمة للتحقيقات في تجميع المغزل وفصل الكروموسومات في الانقسام الاختزالي الذكري. تعتبر الخلايا المنوية للفأر نموذجا مثاليا للدراسات الميكانيكية للانقسام الاختزالي ، ومع ذلك ، فإن الطرق الفعالة لتحليل الخلايا المنوية غير متوفرة. في هذه المقالة ، تم الإبلاغ عن طريقة عملية وفعالة لتثبيط kinesin-7 CENP-E في الخلايا المنوية للفئران. يتم تقديم إجراء مفصل لحقن الخصية لمثبط معين GSK923295 من خلال جراحة البطن في الفئران البالغة من العمر 3 أسابيع. علاوة على ذلك ، الموصوفة هنا هي سلسلة من البروتوكولات لجمع الأنسجة وتثبيتها ، وتلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين ، والتألق المناعي ، وقياس التدفق الخلوي ، والمجهر الإلكتروني النافذ. نقدم هنا نموذج تثبيط في الجسم الحي عن طريق جراحة البطن وحقن الخصية ، والتي يمكن أن تكون تقنية قوية لدراسة الانقسام الاختزالي عند الذكور. كما نوضح أن تثبيط CENP-E يؤدي إلى اختلال الكروموسوم وتوقف الطور الاستوائي في الخلايا المنوية الأولية أثناء الانقسام الاختزالي الأول. ستسهل طريقة التثبيط في الجسم الحي لدينا الدراسات الميكانيكية للانقسام الاختزالي ، وستكون بمثابة طريقة مفيدة للتعديلات الجينية لخطوط الجراثيم الذكرية ، وتلقي الضوء على التطبيقات السريرية المستقبلية.

Introduction

الانقسام الميوزي هو أحد أهم الأحداث التطورية المحفوظة في الكائنات حقيقية النواة ، وهو ضروري لتكوين الأمشاج ، والتكاثر الجنسي ، وسلامة الجينوم ، والتنوع الجيني1،2،3. في الثدييات، تخضع الخلايا الجرثومية لانقسامين خلويين متتاليين، الانقسام الميوزي الأول والثاني، بعد جولة واحدة من تضاعف الحمض النووي (DNA). على عكس الكروماتيدات الشقيقة في الانقسام الميتوزي، تتزاوج الكروموسومات المتماثلة المتضاعفة وتنفصل إلى خليتين بنويتين أثناء الانقسام الميوزيI 4، 5. في الانقسام الميوزي الثاني، تتفكك الكروماتيدات الشقيقة وتنفصل لتكوين جاميتات أحادية الصيغة الصبغية دون تضاعف الحمض النووي(DNA) 6. يمكن أن تؤدي الأخطاء في أي من القسمين الميوزيين ، بما في ذلك عيوب تجميع المغزل وفقدان الكروموسوم ، إلى فقدان الأمشاج أو العقم أو متلازمات اختلال الصيغة الصبغية7،8،9.

أظهرت الدراسات المتراكمة أن محركات عائلة كينيسين تلعب دورا مهما في تنظيم محاذاة الكروموسومات وفصلها ، وتجميع المغزل ، وتحريك الخلايا ، وتطور دورة الخلية في كل من الخلايا الانقسامية والانقسام الاختزالي10،11،12. Kinesin-7 CENP-E (بروتين Centromere E) هو محرك كينيتوكور موجه بشكل زائد مطلوب لكونغرس الكروموسوم ، ونقل الكروموسوم ومحاذاته ، وتنظيم نقطة تفتيش تجميع المغزل في الانقسامالفتيلي 13،14،15،16،17،18. أثناء الانقسام الاختزالي ، يؤدي تثبيط CENP-E بواسطة GSK923295 مثبط معين إلى توقف دورة الخلية ، واختلال محاذاة الكروموسوم ، وعدم تنظيم المغزل ، وعدم استقرار الجينوم في الخلايا المنوية19. تشير أنماط توطين وديناميكيات CENP-E عند السنتروميرات لتقسيم الخلايا المنوية إلى أن CENP-E يتفاعل مع بروتينات kinetochore للتجميع المتسلسل للسنتروميرات أثناء الانقسام الاختزالي I20,21. في البويضات ، يلزم CENP-E لمحاذاة الكروموسوم وإكمال الانقسام الاختزالي I13،22،23. ينتج عن الأجسام المضادة أو حقن المورفولينو ل CENP-E كروموسومات منحرفة ، واتجاه حركي غير طبيعي ، وتوقف الانقسام الاختزالي الأول في كل من بويضات الفئران وذبابة الفاكهة 23. بالمقارنة مع الأدوار الأساسية ل CENP-E في الانقسام الفتيلي ، لا تزال وظائف وآليات CENP-E في الانقسام الاختزالي غير معروفة إلى حد كبير. لا يزال يتعين توضيح الآليات التفصيلية ل CENP-E في تكوين الكروموسومات واستقرار الجينوم في الخلايا الاختزالية الذكرية.

تكوين الحيوانات المنوية هو عملية فسيولوجية معقدة وطويلة الأمد ، تتضمن تكاثر أمهات المني المتسلسل ، الانقسام الاختزالي وتكوين الحيوانات المنوية. لذلك ، من الصعب للغاية إعادة إنتاج العملية برمتها في المختبر في الثدييات والأنواع الأخرى24,25. من المستحيل إحداث تمايز الخلايا المنوية بعد مرحلة الباكيتين في المختبر. اقتصرت الدراسات على الانقسامات الاختزالية للذكور بشكل عام على التحليلات التجريبية للطور الاختزالي المبكر25،26. على الرغم من العديد من المساعي التكنولوجية ، بما في ذلك الثقافة قصيرة المدى للخلايا المنوية 27،28 وطرق زراعة الأعضاء25 ، هناك عدد قليل من الطرق الفعالة لدراسة الانقسام الاختزالي الذكري. علاوة على ذلك ، عادة ما يؤدي الحذف الجيني للجينات الأساسية إلى توقف النمو والفتك الجنيني. على سبيل المثال ، تفشل أجنة الفئران التي تفتقر إلى CENP-E في الزرع ولا يمكنها تطوير عملية زرع سابقة29 ، وهو ما يمثل عقبة في الدراسات الميكانيكية ل CENP-E في الانقسام الاختزالي. مجتمعة ، يمكن أن يؤدي إنشاء نظام عملي وممكن لدراسة الانقسام الاختزالي للذكور إلى تعزيز مجال البحث في الانقسام الاختزالي بشكل كبير.

المثبط الصغير المنفذ للخلايا هو أداة قوية لدراسة محركات كينيسين في انقسام الخلايا وعمليات النمو. GSK923295 ، يرتبط مثبط الخيفي على وجه التحديد بالمجال الحركي CENP-E ، ويمنع إطلاق ADP (أدينوسين ثنائي الفوسفات) ، وأخيرا يستقر التفاعلات بين CENP-E والأنابيب الدقيقة30. في هذه الدراسة ، يتم تقديم نموذج فأر تثبيط في الجسم الحي من خلال جراحة البطن وحقن الخصية من GSK923295. يؤدي تثبيط CENP-E إلى اختلال الكروموسوم في الطور الأول من الخلايا المنوية الأولية. علاوة على ذلك ، يؤدي تثبيط CENP-E إلى توقف الانقسام الاختزالي للخلايا المنوية وتعطيل تكوين الحيوانات المنوية. تم وصف سلسلة من البروتوكولات لتحليل الخلايا المنوية ويمكن تطبيقها لمراقبة الأنابيب الدقيقة المغزلية الاختزالية والكروموسومات المتماثلة والعضيات تحت الخلوية في الخلايا المنوية. طريقة تثبيط الجسم الحي لدينا هي طريقة فعالة لدراسات الانقسام الاختزالي وتكوين الحيوانات المنوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت مراجعة جميع التجارب على الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في جامعة فوجيان الطبية (رقم البروتوكول SYXK 2016-0007). تم إجراء جميع تجارب الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة لرعاية واستخدام المختبر التابعة للمعاهد الوطنية للصحة (منشورات المعاهد الوطنية للصحة رقم 8023 ، المنقحة عام 1978).

1. بناء نماذج ماوس تثبيط CENP-E بوساطة GSK923295

  1. تعقيم الأدوات الجراحية على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بإشعاع طاولة العمل الجراحية فائقة النظافة بالأشعة فوق البنفسجية C (UVC) لمدة 2 ساعة. وزن ذكور الفئران ICR (معهد أبحاث السرطان) البالغة من العمر 3 أسابيع المستخدمة في التجارب وحساب جرعات التخدير المطلوبة.
  2. تخدير الفئران عن طريق إعطاء مزيج من الكيتامين (100 ملغم / كغم) والزيلازين (10 ملغم / كغم) عن طريق الحقن داخل الصفاق. تحقق من عمق تخدير الفئران من خلال مزيج من منعكس القرنية للفأر ، منعكس مسبب للألم ، التنفس ، وكذلك قوة العضلات. تأكد من تخدير الفئران بعمق.
    ملاحظة: ضع الحيوان على وسادة تدفئة لتوفير الدعم الحراري أثناء الجراحة.
  3. اربط أطراف الماوس وثبتها على صينية الشمع. ضع قطرة من مرهم الطبيب البيطري على عيون الفأر لمنع الجفاف أثناء التخدير. حلق شعر البطن للفأر من أسفل البطن إلى كيس الصفن باستخدام ماكينة حلاقة للحيوانات التجريبية. تأمين المنطقة الجراحية مع ستارة معقمة.
  4. تطهير البطن البطني مع فرك Betadine تليها 75٪ من الإيثانول ثلاث مرات. افتح تجويف البطن باستخدام مشرط معقم وقم بعمل فتحة <5 مم.
  5. قم بتثبيت الجلد بمشابك جراحية معقمة واسحب وسادة الدهون البربخية باستخدام ملقط تشريح معقم لتحديد موقع الخصيتين باستخدام ملاقط معقمة. ثبت الخصية بالملقط المعقم تحت منظار مجسم ، وقم بحقن 10 ميكرولتر من GSK923295 ببطء في الأنابيب المنوية بتركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر باستخدام 10 ميكرولتر من ريودين30. لبناء المجموعة الضابطة ، قم بحقن 10 ميكرولتر من محلول DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) / PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات).
    ملاحظة: قم بتخزين محلول GSK923295 بتركيز 10 مللي مول عند -80 درجة مئوية. قم بإذابة 0.1 ميكرولتر من 10 مللي مول GSK923295 في 100 ميكرولتر من محلول PBS لتحضير 10 ميكرومتر من محلول GSK923295.
  6. ادفع الخصية برفق إلى تجويف البطن باستخدام ملقط جراحي معقم. خياطة الصفاق والجلد بشكل منفصل مع اثنين إلى أربعة غرز باستخدام خط خياطة بقطر 0.1 ملم.
  7. قم بتسمية مكان 3 × 3 مم على ظهر الحيوان بعلامة دائمة بعد جراحة البطن ، وأعد الماوس إلى قفص التغذية وتأكد من بيئة نظيفة وخالية من مسببات الأمراض مع ما يكفي من الطعام والماء.
  8. حافظ على البيئة في حالة معقمة من خلال الهواء المصفى والطعام والماء المعقمين. اعتني بالحيوان حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. في حالة التسكين بعد الجراحة، يتم تطبيق جرعة من البوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ) تحت الجلد كل 12 ساعة لمدة 3 أيام. تأكد من عدم إعادة الفأر إلى صحبة الحيوانات الأخرى حتى يتعافى تماما.
    ملاحظة: يتم إعطاء الفئران رعاية ما بعد الجراحة ، وإعطاء الجرح تخديرا موضعيا بشكل مناسب باستخدام 0.5٪ يدوكائين لتقليل آلام ما بعد الجراحة عند الضرورة.

2. تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (HE) وعلم أمراض الأنسجة

  1. بعد أربعة أيام من جراحة البطن ، القتل الرحيم للفئران باستخدام CO 2 بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة في غرفة CO2. تأكيد الوفاة عن طريق خلع عنق الرحم كوسيلة تأكيدية للقتل الرحيم. استخدم المقص الجراحي لفتح كيس الصفن وإزالة الخصيتين بالملقط. جمع خصيتي الماوس بعد 4 أيام من الحقن GSK923295 وإصلاحها في 30 مل من محلول الفورمالديهايد 10 ٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة.
  2. للتجفيف المتدرج ، احتضان العينة بالتتابع في 40 مل من الإيثانول 70٪ لمدة 1 ساعة ، في 40 مل من الإيثانول 85٪ لمدة 1 ساعة ، في 40 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ لمدة 1 ساعة ، وفي 40 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 ساعة.
  3. احتضان العينة في 40 مل من الزيلين لمدة 40 دقيقة ، ثم في 40 مل من البارافين لمدة 1 ساعة عند 65 درجة مئوية. ضع المناديل في الجزء السفلي من صندوق التضمين. أضف البارافين المذاب إلى صندوق التضمين. تبريد الأنسجة للتصلب الكامل عند 4 درجات مئوية لمدة 6 ساعات.
  4. ثبت العينات على حامل ultramicrotome ، وحافظ على الزاوية بين العينات وسطح السكين عند 5-10 درجة ، واضبط سمك الشريحة على 5 ميكرومتر. قم بإعداد المقاطع التي يبلغ سمكها 5 ميكرومتر باستخدام microtome ultra ، وانشر الشرائح في حمام مائي عند 40 درجة مئوية ، وجفف الأقسام في مجفف منزلق لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  5. احتضان الشرائح في 200 مل من الزيلين لمدة 40 دقيقة ، في 200 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 6 دقائق ، في 200 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ لمدة دقيقتين ، في 200 مل من الإيثانول بنسبة 90٪ لمدة دقيقتين ، في 200 مل من الإيثانول بنسبة 80٪ لمدة دقيقتين ، وفي 200 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة دقيقتين ، على التوالي.
  6. شطف الشرائح في الماء المقطر لمدة 5 دقائق وصمة عار مع محلول ماير الهيماتوكسيلين لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: محلول ماير للهيماتوكسيلين: 0.011 مول / لتر هيماتوكسيلين ، 6.7٪ إيثانول لا مائي ، 0.646 مول / لتر كبريتات البوتاسيوم الألومنيوم ، و 0.003 مول / لتر يودات الصوديوم.
  7. شطف الشرائح في الماء الجاري لمدة 5 دقائق واحتضان بالماء المقطر لمدة 2 دقيقة.
  8. احتضان الشرائح في 1 ٪ هيدروكلوريد الإيثانول لمدة 3 ثوان ، ثم شطفها في الماء الجاري لمدة 2 دقيقة.
  9. قم بتلطيخ العينة بنسبة 1٪ eosin لمدة 15 ثانية ، ثم احتضانها بنسبة 95٪ إيثانول لمدة 5 ثوان ، مع 100٪ إيثانول لمدة 2 دقيقة ، وفي الزيلين لمدة 40 دقيقة.
  10. أغلق الشرائح باستخدام 15 ميكرولتر من الصمغ المحايد وغطاء 24 × 50 مم.

3. التألق المناعي والمجهر متحد البؤر

  1. جمع أقسام البارافين بسمك 5 ميكرومتر من خصيتي الفئران من أجل التألق المناعي. احتضان الشرائح في الزيلين لمدة 40 دقيقة ، في 100 ٪ من الإيثانول لمدة 6 دقائق ، في 95 ٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة ، في 90 ٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة ، في 80 ٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة ، وفي 70 ٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة. شطف الشرائح في الماء المقطر لمدة 5 دقائق ، وشطف الشرائح مع 0.01 M PBS لمدة 5 دقائق.
  2. ضع الشرائح في محلول استرجاع المستضد (0.01 M سيترات عازلة) واغليها تحت ضغط عال باستخدام قدر ضغط لمدة 4 دقائق لاسترجاع المستضد. تبريد الشرائح بشكل طبيعي إلى درجة حرارة الغرفة. شطف بالماء المقطر لمدة 5 دقائق مرتين ، ومع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: 0.01 م عازلة سيترات (درجة الحموضة 6.0): 2.1 مليمول / لتر حامض الستريك ، 11.6 مليمول / لتر ثنائي هيدرات سترات الصوديوم.
  3. تتخلل الخلايا عن طريق احتضان الشرائح في 500 ميكرولتر من 0.25٪ TritonX-100 / PBS لمدة 10 دقائق. شطف الشرائح مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ثلاث مرات.
  4. لحجب المستضد ، احتضان العينات ب 300 ميكرولتر من 3٪ ألبومين مصل البقر (BSA) / PBST (0.1٪ Tween-20 في PBS) لمدة 1 ساعة. احتضان العينات بالأجسام المضادة الأولية في 3٪ BSA / PBST لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية. ضع الشرائح في صندوق مرطب لمنع الأنسجة من الجفاف. أعد تسخين الشرائح بشكل طبيعي إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  5. تخلص من الجسم المضاد الأساسي ، ثم اشطف الشرائح في PBST لمدة 5 دقائق ثلاث مرات. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في 3٪ BSA / PBST. احتضان العينات بأجسام مضادة ثانوية لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية. شطف العينات في PBST لمدة 5 دقائق خمس مرات.
  6. قم بتلطيخ النوى ب 50 ميكرولتر من 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتركيب غطاء الغطاء باستخدام وسيط التثبيت المضاد للتلاشي ، وقم بإغلاق غطاء الغطاء بطلاء الأظافر.
  7. مراقبة وتسجيل إشارات الفلورسنت في الشرائح باستخدام مجهر الفلورسنت المجهز بهدف NA 40x / 0.75.

4. قياس التدفق الخلوي

  1. جمع الخصيتين الماوس في أطباق بتري 6 سم وقطع الخصيتين إلى 1 مم3 قطع باستخدام مقص جراحي.
  2. هضم الخصيتين باستخدام 1 مل من كولاجيناز 1٪ في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، ثم طرد العينات عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق لترسيب الخلايا المنوية.
  3. تخلص من المادة الطافية ، ثم أضف 1 مل من محلول 0.25٪ trypsin-EDTA (حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ثم قم بطرد العينات عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق.
  4. تخلص من المادة الطافية ، ثم احتضن الخلايا المترسبة ب 1 مل من الإيثانول البارد بنسبة 70٪ لأكثر من 8 ساعات عند 4 درجات مئوية.
  5. أجهزة الطرد المركزي العينات في 1000 × غرام لمدة 5 دقائق ، ثم جمع رواسب الخلية. قم بتلطيخ الخلايا المنوية بمحلول تلطيخ 500 ميكرولتر من بروبيديوم يوديد (PI) (50 ميكروغرام / مل PI ، 100 ميكروغرام / مل RNase A و 0.2٪ Triton X-100 في PBS) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: هز أنبوب الطرد المركزي برفق كل 5 دقائق لتجنب تجمعات الخلايا.
  6. تصفية العينات باستخدام شاشة شبكية 300 للتخلص من حطام الخلايا ؛ اجمع الخلايا في أنبوب تدفق وخزنها عند 4 درجات مئوية.
  7. كشف إشارات التألق وتشتت الضوء عند الطول الموجي للإثارة البالغ 488 نانومتر باستخدام مقياس التدفق الخلوي. تحليل محتوى الحمض النووي وتشتت الضوء باستخدام برنامج Modfit MFLT32.

5. المجهر الإلكتروني النافذ

  1. قطع الخصيتين إلى 1 مم3 قطع باستخدام مشرط حاد ، واحتضان العينات بسرعة مع 3٪ غلوتارالدهيد -1.5٪ محلول بارافورمالدهيد في 0.1 M PBS (درجة الحموضة 7.2) لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية لتجنب تغييرات البنية الفائقة. شطف العينات مع 0.1 M PBS لمدة 5 دقائق ثلاث مرات.
    ملاحظة: يجب أن يكون المشرط والمقص حادين ، ومحاولة تجنب الضغط والسحب الاصطناعي. يجب أن تتم معالجة العينات في سائل التثبيت.
  2. ثبت العينات في محلول حمض الأوسميك 1٪ - 1.5٪ فيروسيانيد البوتاسيوم عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة. جفف الماء بورق الترشيح واشطف العينات ب 0.1 متر PBS لمدة 5 دقائق ثلاث مرات.
  3. جفف العينات في 40 مل من الإيثانول بنسبة 50٪ لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. احتضان العينات في 40 مل من صبغة أسيتات اليورانيوم المشبع بالإيثانول بنسبة 70٪ عند 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة ، في 40 مل من الإيثانول بنسبة 90٪ لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، في 40 مل من 90٪ إيثانول أسيتون لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وفي 40 مل من الأسيتون اللامائي لمدة 10 دقائق ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة.
  4. احتضان العينات في مادة راتنجات الأسيتون والإيبوكسي اللامائية 618 (v / v = 1: 1) خليط لمدة 1.5 ساعة ، ثم تضمين العينات في عوامل تضمين راتنجات الايبوكسي 618 عند 35 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
  5. لبلمرة الراتنج، احتضان العينات في راتنجات الايبوكسي 618 عوامل التضمين عند 35 درجة مئوية لمدة 12 ساعة، عند 45 درجة مئوية لمدة 12 ساعة، ثم عند 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  6. قم بتثبيت العينات والسكين الزجاجي ، ثم اضبط المسافات بين العينات والسكين. قم بإعداد المقاطع الرقيقة جدا بسمك 90 نانومتر باستخدام ميكروتوم رفيع للغاية. قم بتقطيع العينات بسرعة ثابتة ، ثم ضع الشرائح على شبكة من النيكل. ضع الشرائح في طبق بتري في درجة حرارة الغرفة.
  7. قم بتلطيخ الشرائح بأسيتات يورانيل 2٪ لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتلطيخ العينات باستخدام سترات الرصاص 2٪ لمدة 10 دقائق. شطف الشرائح بالماء المقطر. تجفيف الشرائح لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  8. راقب الشرائح وسجل صور الإلكترون عند 70-100 كيلو فولت باستخدام مجهر إلكتروني انتقالي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لقد نجحنا في بناء نموذج تثبيط CENP-E في الجسم الحي لخصيتي الفئران من خلال جراحة البطن وحقن الخصية في19 GSK923295. تم عرض الخطوات الفنية الرئيسية لهذه الطريقة في الشكل 1. بعد حقن الخصية من GSK923295 لمدة 4 أيام ، تم حصاد الخصيتين لمزيد من التحليلات. في المجموعة الضابطة ، ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه الدراسة ، أنشأنا نموذج تثبيط CENP-E في الجسم الحي لخصيتي الفئران باستخدام جراحة البطن والحقن المجهري GSK923295. تتميز طريقة جراحة البطن وحقن الخصية المستخدمة في هذه الدراسة بالمزايا التالية. أولا ، لا يقتصر على عمر الفئران. يمكن للمجربين إجراء حقن الخصية في مرحلة مبكرة ، على سبيل المث...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر جميع أعضاء مختبر الهيكل الخلوي في جامعة فوجيان الطبية على المناقشات المفيدة. نشكر جون جين لين في مركز خدمات التكنولوجيا العامة ، جامعة فوجيان الطبية على المساعدة الفنية في قياس التدفق الخلوي. نشكر Ming-Xia Wu و Lin-Ying Zhou في مختبر المجهر الإلكتروني التابع لمركز خدمة التكنولوجيا العامة ، جامعة فوجيان الطبية للمساعدة الفنية في الفحص المجهري الإلكتروني. نشكر Si-Yi Zheng و Ying Lin و Qi Ke و Jun Song في مركز التدريس التجريبي للعلوم الطبية الأساسية في جامعة فوجيان الطبية على دعمهم. تم دعم هذه الدراسة من خلال المنح التالية: المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة 82001608) ، مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة فوجيان ، الصين (رقم المنحة 2019J05071) ، مشروع التكنولوجيا الصحية بمقاطعة فوجيان (رقم المنحة 2018-1-69) ، صندوق بدء البحث العلمي ، جامعة فوجيان الطبية (رقم المنحة 2017XQ1001) ، مشروع تمويل بدء البحث العلمي للمواهب عالية المستوى بجامعة فوجيان الطبية (رقم المنحة XRCZX2017025) ومشروع البحث التعليم عبر الإنترنت وتدريس طلاب الدراسات العليا في الطب الصيني (رقم المنحة B-YXC20200202-06).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200056
1 ml SyringeSeveral commercial brands availableSterile.
1.5 mL Centrifuge tubeAxygenMCT-150-C
50 mL Centrifuge TubeCorning430828
6 cm Petri dishCorning430166
95% EthanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009164
tubulin rabbit polyclonal antibodyBeyotimeAF0001For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibodyAbcamab267372For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibodySangon BiotechD110022For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibodyAbcamab175191For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slidesCITOTEST188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibodyBeyotimeA0423Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10001060
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd100092690
Anti-fade mounting mediumBeyotimeP0131Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto IIBD BiosciencesFACS Canto II
Bovine Serum AlbuminSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd69003435
CentrifugeEppendorf5424BK745380
Chloral hydrateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80037516
Citric acidShanghai Experiment Reagent Co., Ltd122670
CollagenaseSangon BiotechA004194-0100
CoverslipsCITOTEST10212020C20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPIBeyotimeC1006
Dye vatSeveral commercial brands available91347802
Eosin Y, alcohol solubleSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd71014460
EtherSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009318
Formaldehyde - aqueous solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10010018
GSK923295MedChemExpressHY-10299
Hematoxylin, anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd71020784
ICR mouseShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J softwareNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotomeLeica
Leica EM UC-7 ultramicrotomeLeicaEM UC7
Modfit MFLT32Verity Software HouseFor analysis of flow cytometry results.
Nail polishSeveral commercial brands available
Neutral gumSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10004160
Nikon Ti-S2 microscopeNikonTi-S2
Picric acidSinopharm Chemical Reagent Co.,LtdJ60807
RheodyneSangon BiotechF519160-000110 μl rheodyne
Sliced paraffinSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd69019461
Sodium iodateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80117214
Surgical instrumentsSeveral commercial brands availableFor abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscopeFEITecnai G2
Trisodium citrate dihydrateShanghai Experiment Reagent Co., Ltd173970
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd30188928Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd30189328Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
ParaformaldehydeSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80096618
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10023418

References

  1. Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001(2016).
  2. Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
  3. Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
  4. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
  5. Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
  6. Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
  7. Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, Pt 16 2953-2965 (2001).
  8. Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
  9. Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
  10. Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
  11. Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
  12. Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
  13. Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
  14. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  15. Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
  16. Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
  17. Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  18. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  19. She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25(2020).
  20. Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417(2009).
  21. Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
  22. Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
  23. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  24. Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
  25. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  26. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
  27. Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
  28. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
  29. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  30. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  31. Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
  32. She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6(2020).
  33. She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636(2020).
  34. Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453(2018).
  35. Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
  36. Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
  37. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  38. Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson's Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
  39. Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431(2021).
  40. Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
  41. Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961(2020).
  42. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
  43. Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Developmental Biology. 205 (1), 49-64 (1999).
  44. Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
  45. Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
  46. Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
  47. Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
  48. Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
  49. Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 178 CENP E

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved