Функциональная оценка кинезина-7 CENP-E в сперматоцитах с использованием ингибирования, иммунофлюоресценции и проточной цитометрии in vivo

Резюме

В этой статье сообщается о ингибировании CENP-E in vivo с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек GSK923295, ценной модели для мужского мейотического деления. Используя анализы иммунофлуоресценции, проточной цитометрии и просвечивающей электронной микроскопии, мы показываем, что ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом и нестабильности генома в сперматоцитах мышей.

Аннотация

У эукариот мейоз необходим для стабильности генома и генетического разнообразия при половом размножении. Экспериментальный анализ сперматоцитов яичек имеет решающее значение для изучения сборки веретена и сегрегации хромосом при мейотическом делении самцов. Сперматоцит мыши является идеальной моделью для механистических исследований мейоза, однако эффективные методы анализа сперматоцитов отсутствуют. В данной статье сообщается о практическом и эффективном методе ингибирования in vivo кинезина-7 CENP-E в сперматоцитах мышей. Представлена подробная процедура инъекции специфического ингибитора в яички GSK923295 с помощью абдоминальной хирургии у 3-недельных мышей. Кроме того, здесь описан ряд протоколов для сбора и фиксации тканей, окрашивания гематоксилин-эозином, иммунофлуоресценции, проточной цитометрии и просвечивающей электронной микроскопии. Здесь мы представляем модель торможения in vivo с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек, которая может стать мощным методом изучения мужского мейоза. Мы также демонстрируем, что ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом и остановке метафазы в первичных сперматоцитах во время мейоза I. Наш метод ингибирования in vivo облегчит механистические исследования мейоза, послужит полезным методом для генетических модификаций мужских половых линий и прольет свет на будущие клинические применения.

Введение

Мейоз является одним из наиболее важных, очень жестких, эволюционно консервативных событий у эукариотических организмов и необходим для гаметогенеза, полового размножения, целостности генома и генетического разнообразия ^1,2,3. У млекопитающих половые клетки подвергаются двум последовательным клеточным делениям, мейозу I и II, после одного раунда репликации ДНК. В отличие от сестринских хроматид при митозе, дублированные гомологичные хромосомы объединяются в пары и разделяются на две дочерние клетки во время мейоза I ^4,5

протокол

Все эксперименты на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Медицинском университете Фуцзянь (номер протокола SYXK 2016-0007). Все эксперименты на мышах проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами Ухода и использования лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения (публикации NIH No 8023, пересмотренные в 1978 году).

1. Построение GSK923295-опосредованных моделей мышей с ингибированием CENP-E

1. Стерилизуйте хирургические инструменты при температуре 121 °C в течение 30 минут. Облучайте хирургический ультрачистый верстак ультра....

Результаты

Мы успешно построили in vivo модель ингибирования CENP-E яичек мыши с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек GSK923295¹⁹. Основные технические этапы этого метода были показаны на рисунке 1. После инъекции яичек GSK923295 в течение 4 дней яички были собраны для.......

Обсуждение

В этом исследовании мы создали модель ингибирования CENP-E in vivo яичек мыши с использованием абдоминальной хирургии и микроинъекции GSK923295. Абдоминальная хирургия и метод инъекций яичек, используемые в этом исследовании, имеют следующие преимущества. Во-первых, он не ограничивается во.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1 ml Syringe	Several commercial brands available		Sterile.
1.5 mL Centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430828
6 cm Petri dish	Corning	430166
95% Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10009164
tubulin rabbit polyclonal antibody	Beyotime	AF0001	For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody	Abcam	ab267372	For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody	Sangon Biotech	D110022	For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab175191	For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slides	CITOTEST	188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody	Beyotime	A0423	Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10001060
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	100092690
Anti-fade mounting medium	Beyotime	P0131	Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto II	BD Biosciences	FACS Canto II
Bovine Serum Albumin	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	69003435
Centrifuge	Eppendorf	5424BK745380
Chloral hydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	80037516
Citric acid	Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd	122670
Collagenase	Sangon Biotech	A004194-0100
Coverslips	CITOTEST	10212020C	20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPI	Beyotime	C1006
Dye vat	Several commercial brands available	91347802
Eosin Y, alcohol soluble	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	71014460
Ether	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10009318
Formaldehyde - aqueous solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010018
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
Hematoxylin, anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	71020784
ICR mouse	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J software	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotome	Leica
Leica EM UC-7 ultramicrotome	Leica	EM UC7
Modfit MFLT32	Verity Software House		For analysis of flow cytometry results.
Nail polish	Several commercial brands available
Neutral gum	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10004160
Nikon Ti-S2 microscope	Nikon	Ti-S2
Picric acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	J60807
Rheodyne	Sangon Biotech	F519160-0001	10 μl rheodyne
Sliced paraffin	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	69019461
Sodium iodate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	80117214
Surgical instruments	Several commercial brands available		For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscope	FEI	Tecnai G2
Trisodium citrate dihydrate	Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd	173970
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	30188928	Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	30189328	Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	80096618
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10023418