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  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Cet article rapporte une inhibition in vivo de la CENP-E par chirurgie abdominale et injection testiculaire de GSK923295, un modèle précieux pour la division méiotique masculine. En utilisant les tests d’immunofluorescence, de cytométrie en flux et de microscopie électronique à transmission, nous montrons que l’inhibition de la CENP-E entraîne un désalignement chromosomique et une instabilité du génome dans les spermatocytes de souris.

Résumé

Chez les eucaryotes, la méiose est essentielle à la stabilité du génome et à la diversité génétique dans la reproduction sexuée. Les analyses expérimentales des spermatocytes dans les testicules sont essentielles pour les recherches sur l’assemblage du fuseau et la ségrégation chromosomique dans la division méiotique masculine. Le spermatocyte de souris est un modèle idéal pour les études mécanistes de la méiose, cependant, les méthodes efficaces pour les analyses des spermatocytes font défaut. Dans cet article, une méthode pratique et efficace pour l’inhibition in vivo de la kinésine-7 CENP-E dans les spermatocytes de souris est décrite. Une procédure détaillée pour l’injection testiculaire d’un inhibiteur spécifique GSK923295 par chirurgie abdominale chez des souris âgées de 3 semaines est présentée. En outre, une série de protocoles pour la collecte et la fixation des tissus, la coloration à l’hématoxyline-éosine, l’immunofluorescence, la cytométrie en flux et la microscopie électronique à transmission sont décrites ici. Nous présentons ici un modèle d’inhibition in vivo via la chirurgie abdominale et l’injection testiculaire, qui pourrait être une technique puissante pour étudier la méiose masculine. Nous démontrons également que l’inhibition de la CENP-E entraîne un désalignement chromosomique et un arrêt de métaphase dans les spermatocytes primaires au cours de la méiose I. Notre méthode d’inhibition in vivo facilitera les études mécanistes de la méiose, servira de méthode utile pour les modifications génétiques des lignées germinales mâles et mettra en lumière de futures applications cliniques.

Introduction

La méiose est l’un des événements les plus importants, les plus rigides et les plus conservés de l’évolution dans les organismes eucaryotes, et elle est essentielle à la gamétogenèse, à la reproduction sexuée, à l’intégrité du génome et à la diversité génétique 1,2,3. Chez les mammifères, les cellules germinales subissent deux divisions cellulaires successives, la méiose I et II, après un seul cycle de réplication de l’ADN. Contrairement aux chromatides sœurs en mitose, les chromosomes homologues dupliqués s’apparient et se séparent en deux cellules filles au cours de la méiose I 4,5. Dans la méiose II, les chromatides sœurs se séparent et se séparent pour former des gamètes haploïdes sans réplication de l’ADN6. Des erreurs dans l’une ou l’autre des deux divisions méiotiques, y compris les défauts d’assemblage du fuseau et la déségrégation chromosomique, peuvent entraîner la perte de gamètes, des syndromes de stérilité ou d’aneuploïdie 7,8,9.

Des études de plus en plus nombreuses ont montré que les moteurs de la famille des kinésines jouent un rôle crucial dans la régulation de l’alignement et de la ségrégation chromosomiques, de l’assemblage du fuseau, de la cytocinèse et de la progression du cycle cellulaire dans les cellules mitotiques et méiotiques10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (protéine Centromère E) est un moteur kinétochore dirigé vers une extrémité plus nécessaire à la congression des chromosomes, au transport et à l’alignement des chromosomes, et à la régulation du point de contrôle de l’assemblage du fuseau dans la mitose 13,14,15,16,17,18. Au cours de la méiose, l’inhibition de la CENP-E par l’inhibiteur spécifique GSK923295 entraîne l’arrêt du cycle cellulaire, le désalignement chromosomique, la désorganisation du fuseau et l’instabilité du génome dans les cellules spermatogènes19. Les schémas de localisation et la dynamique de la CENP-E aux centromères des spermatocytes en division indiquent que la CENP-E interagit avec les protéines kinétochores pour l’assemblage séquentiel des centromères au cours de la méiose I20,21. Dans les ovocytes, CENP-E est nécessaire pour l’alignement chromosomique et l’achèvement de la méiose I13,22,23. L’injection d’anticorps ou de morpholino de CENP-E entraîne un désalignement des chromosomes, une orientation anormale des kinétochores et un arrêt de la méiose I dans les ovocytes de souris et de drosophile 23. Par rapport aux rôles essentiels de la CENP-E dans la mitose, les fonctions et les mécanismes de la CENP-E dans la méiose restent largement inconnus. Les mécanismes détaillés de la CENP-E dans la conférence chromosomique et la stabilité du génome dans les cellules méiotiques mâles restent à clarifier.

La spermatogenèse est un processus physiologique complexe et de longue durée, impliquant la prolifération séquentielle de la spermatogonie, la méiose et la spermiogenèse. Par conséquent, l’ensemble du processus est extraordinairement difficile à reproduire in vitro chez les mammifères et d’autres espèces24,25. Il est impossible d’induire la différenciation des spermatocytes après le stade pachytène in vitro. Les études sur les divisions méiotiques masculines ont généralement été limitées à des analyses expérimentales de la prophase méiotique précoce25,26. Malgré de nombreux efforts technologiques, y compris la culture à court terme des spermatocytes27,28 et les méthodes de culture d’organes25, il existe peu de méthodes efficaces pour étudier la division méiotique masculine. De plus, la délétion génétique de gènes essentiels entraîne généralement un arrêt du développement et une létalité embryonnaire. Par exemple, les embryons de souris dépourvus de CENP-E ne parviennent pas à s’implanter et ne peuvent pas développer une implantation passée29, ce qui constitue un obstacle dans les études mécanistes de la CENP-E dans la méiose. Pris ensemble, l’établissement d’un système pratique et réalisable pour étudier la division méiotique masculine peut grandement promouvoir le domaine de recherche de la méiose.

L’inhibiteur perméable aux petites cellules est un outil puissant pour étudier les moteurs de kinésine dans la division cellulaire et les processus de développement. L’inhibiteur allostérique, GSK923295, se lie spécifiquement au domaine moteur CENP-E, bloque la libération d’ADP (adénosine diphosphate), et stabilise finalement les interactions entre CENP-E et les microtubules30. Dans cette étude, un modèle murin d’inhibition in vivo est présenté par chirurgie abdominale et injection testiculaire de GSK923295. L’inhibition de la CENP-E entraîne un désalignement chromosomique dans la métaphase I des spermatocytes primaires. De plus, l’inhibition de la CENP-E entraîne l’arrêt méiotique des spermatocytes et la perturbation de la spermatogenèse. Une série de protocoles sont décrits pour les analyses des spermatocytes et peuvent être appliqués pour observer les microtubules du fuseau méiotique, les chromosomes homologues et les organites subcellulaires dans les spermatocytes. Notre méthode d’inhibition in vivo est une méthode efficace pour les études de la division méiotique et de la spermatogenèse.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été examinées et approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université médicale du Fujian (numéro de protocole SYXK 2016-0007). Toutes les expériences sur les souris ont été effectuées conformément aux directives pertinentes du Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health (NIH publications numéro 8023, révisé en 1978).

1. Construction de modèles murins d’inhibition CENP-E médiés par GSK923295

  1. Stériliser les instruments chirurgicaux à 121 °C pendant 30 min. Irradier l’établi chirurgical ultra-propre avec des ultraviolets-C (UVC) pendant 2 h. Pesez les souris mâles de 3 semaines ICR (Institute of Cancer Research) utilisées pour les expériences et calculez les doses d’anesthésique nécessaires.
  2. Anesthésier les souris en administrant une combinaison de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) par injection intrapéritonéale. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie des souris grâce à une combinaison de réflexe cornéen de souris, de réflexe nociceptif, de respiration et de tonus musculaire. Confirmez que les souris sont profondément anesthésiées.
    REMARQUE : Placez l’animal sur un coussin chauffant pour fournir un soutien thermique pendant la chirurgie.
  3. Attachez les membres de la souris et fixez-les sur le plateau de cire. Placez une goutte de pommade vétérinaire sur les yeux de souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Rasez les poils abdominaux de la souris du bas-ventre au scrotum à l’aide d’un rasoir animal expérimental. Fixez la zone chirurgicale avec un champ stérile.
  4. Désinfectez l’abdomen ventral avec un gommage à la bétadine suivi de trois fois d’éthanol à 75%. Ouvrez la cavité abdominale à l’aide d’un scalpel stérile et faites une ouverture de <5 mm.
  5. Serrez la peau avec des pinces chirurgicales stériles et tirez le coussinet adipeux épididymaire avec une pince à dissection stérile pour localiser les testicules à l’aide d’une pince à épiler stérile. Fixez le testicule avec une pince stérile sous un stéréoscope et injectez lentement 10 μL de GSK923295 dans les tubules séminifères à une concentration finale de 10 μM en utilisant 10 μL de rhéodyne30. Pour la construction du groupe témoin, injecter 10 μL de solution de DMSO (diméthylsulfoxyde)/PBS (solution saline tamponnée au phosphate) à 1 %.
    NOTE: Conserver la solution GSK923295 à une concentration de 10 mM à -80 °C. Dissoudre 0,1 μL de 10 mM GSK923295 dans 100 μL de solution PBS pour préparer les 10 μM de GSK923295 solution.
  6. Repoussez doucement le testicule dans la cavité abdominale avec des pinces chirurgicales stériles. Suturer le péritoine et la peau séparément avec deux à quatre points de suture en utilisant la ligne de suture d’un diamètre de 0,1 mm.
  7. Étiquetez un endroit de 3 x 3 mm sur le dos de l’animal avec un marqueur permanent après une chirurgie abdominale, remettez la souris dans la cage d’alimentation et assurez-vous d’un environnement propre et exempt d’agents pathogènes avec suffisamment de nourriture et d’eau.
  8. Gardez l’environnement dans un état stérile grâce à l’air filtré, aux aliments stérilisés et à l’eau. Prenez soin de l’animal jusqu’à ce qu’il ait retrouvé suffisamment de conscience pour maintenir une position couchée sternale. Pour l’analgésie postopératoire, administrer une dose de buprénorphine (0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée toutes les 12 heures pendant 3 jours. Assurez-vous que la souris n’est pas retournée en compagnie d’autres animaux jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie.
    REMARQUE: Les souris reçoivent des soins postopératoires et administrent une anesthésie locale appropriée à la plaie en utilisant 0,5% de lidocaïne pour réduire la douleur postopératoire si nécessaire.

2. Coloration et histopathologie de l’hématoxyline-éosine (HE)

  1. Quatre jours après la chirurgie abdominale, euthanasier les souris avec du CO 2 à un débit de 2 L/min dans une chambre de CO2. Confirmer la mort par luxation cervicale comme méthode de confirmation de l’euthanasie. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir le scrotum et enlever les testicules avec une pince. Prélever les testicules de souris 4 jours après GSK923295 injection et les fixer dans 30 ml de solution de formaldéhyde à 10% à température ambiante pendant 12 h.
  2. Pour la déshydratation par gradient, incuber séquentiellement l’échantillon dans 40 mL d’éthanol à 70 % pendant 1 h, dans 40 mL d’éthanol à 85 % pendant 1 h, dans 40 mL d’éthanol à 95 % pendant 1 h et dans 40 mL d’éthanol à 100 % pendant 1 h.
  3. Incuber l’échantillon dans 40 mL de xylène pendant 40 min, puis dans 40 mL de paraffine pendant 1 h à 65 °C. Placez les mouchoirs au fond de la boîte d’intégration. Ajouter la paraffine fondue dans la boîte d’intégration. Refroidir les tissus pour une solidification complète à 4 °C pendant 6 h.
  4. Fixez les échantillons sur le support de l’ultramicrotome, maintenez l’angle entre les échantillons et la surface du couteau à 5-10° et ajustez l’épaisseur de la tranche à 5 μm. Préparer les profilés de 5 μm d’épaisseur à l’aide d’un ultramicrotome, étaler les lames dans un bain-marie à 40 °C et sécher les profilés dans un séchoir à lames pendant 12 h à 37 °C.
  5. Incuber les lames dans 200 mL de xylène pendant 40 min, dans 200 mL d’éthanol à 100% pendant 6 min, dans 200 mL d’éthanol à 95% pendant 2 min, dans 200 mL d’éthanol à 90% pendant 2 min, dans 200 mL d’éthanol à 80% pendant 2 min, et dans 200 mL d’éthanol à 70% pendant 2 min, respectivement.
  6. Rincer les lames à l’eau distillée pendant 5 min et les colorer avec la solution d’hématoxyline de Mayer pendant 6 min à température ambiante.
    REMARQUE : Solution d’hématoxyline de Mayer : 0,011 mol/L d’hématoxyline, 6,7 % d’éthanol anhydre, 0,646 mol/L de sulfate d’aluminium et de potassium et 0,003 mol/L d’iodate de sodium.
  7. Rincer les lames à l’eau courante pendant 5 min et incuber avec de l’eau distillée pendant 2 min.
  8. Incuber les lames dans du chlorhydrate d’éthanol à 1% pendant 3 s, puis les rincer à l’eau courante pendant 2 min.
  9. Colorer l’échantillon avec 1% d’éosine pendant 15 s, puis les incuber avec de l’éthanol à 95% pendant 5 s, avec 100% d’éthanol pendant 2 min et dans du xylène pendant 40 min.
  10. Scellez les lames à l’aide de 15 μL de gomme neutre et de la glissière de couverture de 24 x 50 mm.

3. Immunofluorescence et microscopie confocale

  1. Recueillir les sections de paraffine de 5 μm d’épaisseur des testicules de souris pour l’immunofluorescence. Incuber les lames dans du xylène pendant 40 min, dans de l’éthanol à 100% pendant 6 min, dans de l’éthanol à 95% pendant 2 min, dans de l’éthanol à 90% pendant 2 min, dans de l’éthanol à 80% pendant 2 min, et dans de l’éthanol à 70% pendant 2 min. Rincer les lames à l’eau distillée pendant 5 min et rincer les lames avec 0,01 M PBS pendant 5 min.
  2. Placer les lames dans la solution de récupération de l’antigène (tampon de citrate 0,01 M) et faire bouillir sous haute pression à l’aide d’un autocuiseur pendant 4 minutes pour le prélèvement de l’antigène. Refroidir les lames naturellement à température ambiante. Rincer deux fois à l’eau distillée pendant 5 min et au PBS pendant 5 min.
    NOTE: 0,01 M tampon de citrate (pH 6,0): 2,1 mmol / L d’acide citrique, 11,6 mmol / L de citrate trisodique dihydraté.
  3. Perméabiliser les cellules en incubant les lames dans 500 μL de TritonX-100/PBS à 0,25% pendant 10 min. Rincer les lames avec du PBS pendant 5 min trois fois.
  4. Pour le blocage de l’antigène, incuber les échantillons avec 300 μL d’albumine sérique bovine (BSA)/PBST à 3 % (0,1 % de Tween-20 dans le PBS) pendant 1 h. Incuber les échantillons avec les anticorps primaires dans 3% BSA/PBST pendant 16 h à 4 °C. Mettez les lames dans une boîte humidifiée pour éviter que les tissus ne se dessèchent. Réchauffer les lames naturellement à température ambiante pendant 30 min.
  5. Jetez l’anticorps primaire, puis rincez les lames dans PBST pendant 5 minutes trois fois. Diluer les anticorps secondaires dans 3% BSA/PBST. Incuber les échantillons avec des anticorps secondaires pendant 1-2 h à 37 °C. Rincer les échantillons dans PBST pendant 5 min cinq fois.
  6. Colorer les noyaux avec 50 μL de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 min à température ambiante. Montez le couvercle avec le support de montage anti-décoloration et scellez le couvercle avec du vernis à ongles.
  7. Observez et enregistrez les signaux fluorescents dans les lames à l’aide d’un microscope fluorescent équipé d’un objectif NA 40x/ 0.75.

4. Cytométrie de flux

  1. Recueillir les testicules de souris dans des boîtes de Petri de 6 cm et couper les testicules en morceaux de 1 mm3 à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
  2. Digérer les testicules à l’aide de 1 mL de collagénase à 1 % dans un tube à centrifuger de 1,5 mL pendant 10 min à 37 °C, puis centrifuger les échantillons à 1 000 x g pendant 5 min pour précipiter les cellules spermatogènes.
  3. Jeter le surnageant, puis ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA (acide éthylène diamine tétraacétique) à 0,25 % pendant 20 min à 37 °C, puis centrifuger les échantillons à 1 000 x g pendant 5 min.
  4. Jeter le surnageant, puis incuber les cellules précipitées avec 1 mL d’éthanol froid à 70 % pendant plus de 8 h à 4 °C.
  5. Centrifuger les échantillons à 1 000 x g pendant 5 min, puis recueillir les sédiments cellulaires. Colorer les cellules spermatogènes avec une solution de coloration à 500 μL d’iodure de propidium (PI) (50 μg/mL PI, 100 μg/mL de RNase A et 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS) à 37 °C pendant 30 min.
    REMARQUE: Secouez doucement le tube de centrifugation toutes les 5 minutes pour éviter les agrégations cellulaires.
  6. Filtrer les échantillons à l’aide d’un écran à 300 mailles pour éliminer les débris cellulaires; recueillir les cellules dans un tube d’écoulement et les stocker à 4 °C.
  7. Détecter les signaux de fluorescence et la diffusion de la lumière à la longueur d’onde d’excitation de 488 nm à l’aide d’un cytomètre en flux. Analysez le contenu de l’ADN et la diffusion de la lumière à l’aide du logiciel Modfit MFLT32.

5. Microscopie électronique à transmission

  1. Couper les testicules en morceaux de 1 mm3 à l’aide du scalpel tranchant, et incuber rapidement les échantillons avec une solution de glutaraldéhyde-1,5% de paraformaldéhyde dans 0,1 M PBS (pH 7,2) pendant 4 h à 4 °C pour éviter les changements d’ultrastructure. Rincer les échantillons avec 0,1 M PBS pendant 5 min trois fois.
    REMARQUE: Le scalpel et les ciseaux doivent être tranchants et essayer d’éviter la compression et la traction artificielles. Le traitement des échantillons doit être effectué dans le fluide de fixation.
  2. Fixer les échantillons dans une solution de ferrocyanure de potassium à 1 % d’acide osmique à 1,5 % à 4 °C pendant 1,5 h. Sécher l’eau avec du papier filtre et rincer les échantillons avec 0,1 M PBS pendant 5 min trois fois.
  3. Déshydrater les échantillons dans 40 mL d’éthanol à 50 % pendant 10 min à 4 °C. Incuber les échantillons dans 40 mL de colorant d’acétate d’uranium saturé à 70 % d’éthanol à 4 °C pendant 12 h, dans 40 mL d’éthanol à 90 % pendant 10 min à 4 °C, dans 40 mL d’éthanol-acétone à 90 % pendant 10 min à température ambiante et dans 40 mL d’acétone anhydre pendant 10 min trois fois à température ambiante.
  4. Incuber les échantillons dans un mélange d’agents d’enrobage acétone-époxy anhydre 618 (v / v = 1:1) pendant 1,5 h, puis incorporer les échantillons dans des agents d’enrobage de résine époxy 618 à 35 °C pendant 3 h.
  5. Pour la polymérisation de la résine, incuber les échantillons dans des agents d’enrobage de résine époxy 618 à 35 °C pendant 12 h, à 45 °C pendant 12 h, puis à 60 °C pendant 24 h.
  6. Installez les échantillons et le couteau en verre, puis ajustez les distances entre les échantillons et le couteau. Préparez les sections ultra-minces de 90 nm d’épaisseur à l’aide d’un microtome ultra-mince. Tranchez les échantillons à une vitesse constante, puis placez les lames sur un treillis de nickel. Placez les lames dans une boîte de Petri à température ambiante.
  7. Colorer les lames avec de l’acétate d’uranyle à 2% pendant 10 min, puis colorer les échantillons avec du citrate de plomb à 2% pendant 10 min. Rincer les lames à l’eau distillée. Sécher les lames pendant 24 h à température ambiante.
  8. Observez les lames et enregistrez des images électroniques à 70-100 kV à l’aide d’un microscope électronique à transmission.

Résultats

Nous avons construit avec succès un modèle in vivo d’inhibition du CENP-E de testicules de souris par chirurgie abdominale et injection testiculaire de GSK92329519. Les principales étapes techniques de cette méthode sont illustrées à la figure 1. Après injection testiculaire de GSK923295 pendant 4 jours, les testicules ont été prélevés pour d’autres analyses. Dans le groupe témoin, l’onde spermatogène dans les tubules séminifères était r...

Discussion

Dans cette étude, nous avons établi un modèle in vivo d’inhibition CENP-E de testicules de souris en utilisant la chirurgie abdominale et la micro-injection de GSK923295. La chirurgie abdominale et la méthode d’injection testiculaire utilisées dans cette étude présentent les avantages suivants. Tout d’abord, il ne se limite pas à l’âge des souris. Les expérimentateurs peuvent effectuer une injection testiculaire à un stade précoce, par exemple chez des souris âgées de 3 semaines ou moins. D...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions tous les membres du laboratoire de cytosquelette de l’Université médicale du Fujian pour leurs discussions utiles. Nous remercions Jun-Jin Lin du Public Technology Service Center de l’Université médicale du Fujian pour son assistance technique en cytométrie en flux. Nous remercions Ming-Xia Wu et Lin-Ying Zhou du laboratoire de microscopie électronique du Public Technology Service Center de l’Université médicale du Fujian pour leur assistance technique en microscopie électronique. Nous remercions Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke et Jun Song du Centre d’enseignement expérimental des sciences médicales fondamentales de l’Université médicale du Fujian pour leur soutien. Cette étude a été financée par les subventions suivantes: Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéro de subvention 82001608), Fondation des sciences naturelles de la province du Fujian, Chine (numéro de subvention 2019J05071), Projet provincial de technologie de la santé du Fujian (numéro de subvention 2018-1-69), Fonds de démarrage pour la recherche scientifique, Université médicale du Fujian (numéro de subvention 2017XQ1001), Projet de financement de démarrage de la recherche scientifique de talents de haut niveau de l’Université médicale du Fujian (numéro de subvention XRCZX2017025) et Projet de recherche de l’éducation et de l’enseignement en ligne des étudiants diplômés en médecine chinoise (numéro de subvention B-YXC20200202-06).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200056
1 ml SyringeSeveral commercial brands availableSterile.
1.5 mL Centrifuge tubeAxygenMCT-150-C
50 mL Centrifuge TubeCorning430828
6 cm Petri dishCorning430166
95% EthanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009164
tubulin rabbit polyclonal antibodyBeyotimeAF0001For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibodyAbcamab267372For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibodySangon BiotechD110022For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibodyAbcamab175191For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slidesCITOTEST188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibodyBeyotimeA0423Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10001060
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd100092690
Anti-fade mounting mediumBeyotimeP0131Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto IIBD BiosciencesFACS Canto II
Bovine Serum AlbuminSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd69003435
CentrifugeEppendorf5424BK745380
Chloral hydrateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80037516
Citric acidShanghai Experiment Reagent Co., Ltd122670
CollagenaseSangon BiotechA004194-0100
CoverslipsCITOTEST10212020C20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPIBeyotimeC1006
Dye vatSeveral commercial brands available91347802
Eosin Y, alcohol solubleSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd71014460
EtherSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009318
Formaldehyde - aqueous solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10010018
GSK923295MedChemExpressHY-10299
Hematoxylin, anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd71020784
ICR mouseShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J softwareNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotomeLeica
Leica EM UC-7 ultramicrotomeLeicaEM UC7
Modfit MFLT32Verity Software HouseFor analysis of flow cytometry results.
Nail polishSeveral commercial brands available
Neutral gumSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10004160
Nikon Ti-S2 microscopeNikonTi-S2
Picric acidSinopharm Chemical Reagent Co.,LtdJ60807
RheodyneSangon BiotechF519160-000110 μl rheodyne
Sliced paraffinSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd69019461
Sodium iodateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80117214
Surgical instrumentsSeveral commercial brands availableFor abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscopeFEITecnai G2
Trisodium citrate dihydrateShanghai Experiment Reagent Co., Ltd173970
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd30188928Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd30189328Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
ParaformaldehydeSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80096618
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10023418

Références

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