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Resumo

Este artigo relata uma inibição in vivo do CENP-E através de cirurgia abdominal e injeção testicular de GSK923295, um modelo valioso para a divisão meiótica masculina. Usando os ensaios de imunofluorescência, citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão, mostramos que a inibição do CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico e instabilidade do genoma em espermatócitos de camundongos.

Resumo

Em eucariotos, a meiose é essencial para a estabilidade do genoma e diversidade genética na reprodução sexuada. Análises experimentais de espermatócitos em testículos são críticas para as investigações da montagem do fuso e segregação cromossômica na divisão meiótica masculina. O espermatócito de camundongo é um modelo ideal para estudos mecanísticos da meiose, no entanto, faltam métodos efetivos para a análise de espermatócitos. Neste artigo, um método prático e eficiente para a inibição in vivo da cinesina-7 CENP-E em espermatócitos de camundongos é relatado. Um procedimento detalhado para injeção testicular de um inibidor específico GSK923295 através de cirurgia abdominal em camundongos de 3 semanas de idade é apresentado. Além disso, é descrita uma série de protocolos para coleta e fixação de tecidos, coloração hematoxilina-eosina, imunofluorescência, citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão. Apresentamos aqui um modelo de inibição in vivo via cirurgia abdominal e injeção testicular, que poderia ser uma técnica poderosa para estudar a meiose masculina. Também demonstramos que a inibição do CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico e parada metafásica em espermatócitos primários durante a meiose I. Nosso método de inibição in vivo facilitará estudos mecanísticos da meiose, servirá como um método útil para modificações genéticas de linhagens germinativas masculinas e lançará uma luz sobre futuras aplicações clínicas.

Introdução

A meiose é um dos eventos evolutivos conservados mais importantes, altamente rígidos, em organismos eucarióticos, sendo essencial para a gametogênese, reprodução sexuada, integridade do genoma e diversidade genética 1,2,3. Em mamíferos, as células germinativas sofrem duas divisões celulares sucessivas, meiose I e II, após uma única rodada de replicação do DNA. Ao contrário das cromátides irmãs na mitose, cromossomos homólogos duplicados se emparelham e segregam em duas células filhas durante a meiose I 4,5. Na meiose II, cromátides irmãs se separam e segregam para formar gametas haploides sem replicação do DNA6. Erros em qualquer uma das duas divisões meióticas, incluindo defeitos na montagem do fuso e má segregação cromossômica, podem resultar em perda de gametas, esterilidade ou síndromes aneuploidias7,8,9.

Estudos acumulados têm demonstrado que os motores da família das cinesinas desempenham um papel crucial na regulação do alinhamento e segregação cromossômica, montagem do fuso, citocinese e progressão do ciclo celular em células mitóticas e meióticas10,11,12. A cinesina-7 CENP-E (proteína E do centrômero) é um motor de cinetócoro direcionado para a extremidade superior necessário para o congresso cromossômico, transporte e alinhamento cromossômico e regulação do ponto de verificação da montagem do fuso na mitose 13,14,15,16,17,18. Durante a meiose, a inibição do CENP-E pelo GSK923295 inibidor específico leva à parada do ciclo celular, desalinhamento cromossômico, desorganização do fuso e instabilidade do genoma das células espermatogênicas19. Os padrões de localização e a dinâmica do CENP-E nos centrômeros dos espermatócitos em divisão indicam que o CENP-E interage com proteínas cinetocoras para a montagem sequencial de centrômeros durante a meiose I20,21. Nos ovócitos, o CENP-E é necessário para o alinhamento cromossômico e a completação da meiose I13,22,23. A injeção de anticorpos ou morfolinos do CENP-E resulta em cromossomos desalinhados, orientação anormal do cinetócoro e parada da meiose I em ovócitos de camundongos e Drosophila 23. Em comparação com os papéis essenciais do CENP-E na mitose, as funções e mecanismos do CENP-E na meiose permanecem em grande parte desconhecidos. Mecanismos detalhados do CENP-E no congresso cromossômico e na estabilidade do genoma em células meióticas masculinas ainda precisam ser esclarecidos.

A espermatogênese é um processo fisiológico complexo e duradouro, envolvendo proliferação sequencial de espermatogônias, meiose e espermiogênese. Portanto, todo o processo é extraordinariamente difícil de ser reproduzido in vitro em mamíferos e outras espécies24,25. É impossível induzir a diferenciação dos espermatócitos após o estágio de paquiteno in vitro. Estudos sobre divisões meióticas masculinas têm sido geralmente limitados a análises experimentais de prófase meiótica inicial25,26. Apesar de muitos esforços tecnológicos, incluindo cultura de espermatócitos em curto prazo27,28 e métodos de cultura de órgãos25, existem poucos métodos eficazes para estudar a divisão meiótica masculina. Além disso, a deleção genética de genes essenciais geralmente resulta em parada do desenvolvimento e letalidade embrionária. Por exemplo, embriões de camundongos sem CENP-E não conseguem se implantar e não podem desenvolver implantação passada29, o que é um obstáculo nos estudos mecanísticos do CENP-E na meiose. Em conjunto, o estabelecimento de um sistema prático e viável para estudar a divisão meiótica masculina pode promover grandemente o campo de pesquisa da meiose.

O inibidor permeável a pequenas células é uma poderosa ferramenta para estudar motores de cinesina em processos de divisão celular e desenvolvimento. O inibidor alostérico, GSK923295, liga-se especificamente ao domínio motor do CENP-E, bloqueia a liberação de ADP (adenosina difosfato) e, finalmente, estabiliza as interações entre o CENP-E e os microtúbulos30. Neste estudo, um modelo de inibição in vivo em camundongos é apresentado através de cirurgia abdominal e injeção testicular de GSK923295. A inibição do CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico na metáfase I dos espermatócitos primários. Além disso, a inibição do CENP-E leva à parada meiótica dos espermatócitos e à interrupção da espermatogênese. Uma série de protocolos é descrita para a análise de espermatócitos e pode ser aplicada para observar microtúbulos fusiformes meióticos, cromossomos homólogos e organelas subcelulares em espermatócitos. Nosso método de inibição in vivo é um método eficaz para os estudos da divisão meiótica e espermatogênese.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Fujian Medical University (Protocolo número SYXK 2016-0007). Todos os experimentos com camundongos foram realizados de acordo com as diretrizes relevantes do Care and Use of Laboratory Animals do National Institutes of Health (NIH publications number 8023, revised 1978).

1. Construção de modelos de camundongos inibidores do CENP-E mediados por GSK923295

  1. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos a 121 °C por 30 min. Irradiar a bancada cirúrgica ultralimpa com C ultravioleta (UVC) por 2 h. Pesar os camundongos machos de 3 semanas de idade ICR (Institute of Cancer Research) usados para os experimentos e calcular as doses de anestésico necessárias.
  2. Anestesiar camundongos administrando uma combinação de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por injeção intraperitoneal. Verifique a profundidade da anestesia dos ratos através de uma combinação de reflexo corneano de camundongo, reflexo nociceptivo, respiração, bem como tônus muscular. Confirme se os ratos estão profundamente anestesiados.
    OBS: Coloque o animal em uma almofada de aquecimento para fornecer suporte térmico durante a cirurgia.
  3. Amarre os membros do rato e fixe-os na bandeja de cera. Coloque uma gota de pomada veterinária nos olhos do rato para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia. Faça a barba dos pelos abdominais do camundongo do abdome inferior até o escroto usando uma navalha animal experimental. Fixar a área cirúrgica com um campo estéril.
  4. Desinfetar o abdome ventral com uma esfoliação de Betadine seguida de etanol 75% três vezes. Abra a cavidade abdominal com bisturi estéril e faça uma abertura de <5 mm.
  5. Aperte a pele com pinças cirúrgicas estéreis e puxe o coxim adiposo epididimal com pinça dissecante estéril para localizar os testículos usando uma pinça estéril. Fixar o testículo com pinça estéril sob um estereoscópio e injetar lentamente 10 μL de GSK923295 nos túbulos seminíferos a uma concentração final de 10 μM usando 10 μL de reodyne30. Para a construção do grupo controle, injetar 10 μL de solução de DMSO (dimetil sulfóxido) a 1%/PBS (solução salina tamponada com fosfato).
    NOTA: Conservar a solução GSK923295 a uma concentração de 10 mM a -80 °C. Dissolver 0,1 μL de 10 mM GSK923295 em 100 μL de solução de PBS para preparar os 10 μM de GSK923295 solução.
  6. Empurre suavemente o testículo de volta para a cavidade abdominal com pinças cirúrgicas estéreis. Sutura separada do peritônio e da pele com dois a quatro pontos utilizando a linha de sutura com diâmetro de 0,1mm.
  7. Rotule um lugar de 3 x 3 mm no dorso do animal com um marcador permanente após a cirurgia abdominal, coloque o rato de volta à gaiola de alimentação e garanta um ambiente limpo e livre de patógenos com comida e água suficientes.
  8. Mantenha o ambiente em estado estéril através do ar filtrado, dos alimentos esterilizados e da água. Cuide do animal até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Para analgesia pós-operatória, administrar uma dose de buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea a cada 12 h por 3 dias. Certifique-se de que o rato não é devolvido à companhia de outros animais até estar totalmente recuperado.
    NOTA: Os camundongos recebem cuidados pós-operatórios e administram adequadamente a anestesia local da ferida usando lidocaína a 0,5% para reduzir a dor pós-operatória quando necessário.

2. Coloração hematoxilina-eosina (HE) e histopatologia

  1. Quatro dias após a cirurgia abdominal, eutanasiar os camundongos com CO 2 a uma taxa de fluxo de 2 L/min em uma câmara de CO2. Confirmar morte por luxação cervical como método confirmatório de eutanásia. Use tesoura cirúrgica para abrir o escroto e remover os testículos com pinças. Recolher testículos de ratinhos 4 dias após GSK923295 injeção e fixá-los em 30 ml de solução de formaldeído a 10% à temperatura ambiente durante 12 horas.
  2. Para desidratação do gradiente, incubar sequencialmente a amostra em 40 mL de etanol 70% por 1 h, em 40 mL de etanol 85% por 1 h, em 40 mL de etanol 95% por 1 h e em 40 mL de etanol 100% por 1 h.
  3. Incubar a amostra em 40 mL de xileno por 40 min e, em seguida, em 40 mL de parafina por 1 h a 65 °C. Coloque os lenços na parte inferior da caixa de incorporação. Adicione a parafina derretida na caixa de incorporação. Arrefecer os tecidos para solidificação completa a 4 °C durante 6 h.
  4. Fixar as amostras no suporte do ultramicrótomo, manter o ângulo entre as amostras e a superfície da faca em 5-10° e ajustar a espessura do corte para 5 μm. Preparar as secções de 5 μm de espessura utilizando um ultramicrótomo, espalhar as lâminas em banho-maria a 40 °C e secar as secções num secador de lâminas durante 12 h a 37 °C.
  5. Incubar as lâminas em 200 mL de xileno por 40 min, em 200 mL de etanol 100% por 6 min, em 200 mL de etanol 95% por 2 min, em 200 mL de etanol 90% por 2 min, em 200 mL de etanol 80% por 2 min e em 200 mL de etanol 70% por 2 min, respectivamente.
  6. Enxaguar as lâminas em água destilada por 5 min e corá-las com a solução de hematoxilina de Mayer por 6 min à temperatura ambiente.
    OBS: Solução de hematoxilina de Mayer: hematoxilina 0,011 mol/L, etanol anidro a 6,7%, sulfato de alumínio e potássio a 0,646 mol/L e iodato de sódio a 0,003 mol/L.
  7. Enxaguar as lâminas em água corrente por 5 min e incubar com água destilada por 2 min.
  8. Incubar as lâminas em cloridrato de etanol a 1% por 3 s e, em seguida, enxaguar-as em água corrente por 2 min.
  9. Manchar a amostra com eosina a 1% por 15 s e, em seguida, incubá-la com etanol 95% por 5 s, com etanol 100% por 2 min e em xileno por 40 min.
  10. Sele as lâminas usando 15 μL de goma neutra e a lamínula de 24 x 50 mm.

3. Imunofluorescência e microscopia confocal

  1. Coletar as seções de parafina de 5 μm de espessura dos testículos de camundongos para imunofluorescência. Incubar as lâminas em xileno por 40 min, em etanol 100% por 6 min, em etanol 95% por 2 min, em etanol 90% por 2 min, em etanol 80% por 2 min e em etanol 70% por 2 min. Enxaguar as lâminas em água destilada por 5 min e enxaguar as lâminas com PBS 0,01 M por 5 min.
  2. Colocar as lâminas na solução de recuperação de antígeno (tampão citrato 0,01 M) e ferver sob alta pressão usando uma panela de pressão por 4 min para recuperação do antígeno. Resfriar as lâminas naturalmente à temperatura ambiente. Enxágue com água destilada por 5 min duas vezes e com PBS por 5 min.
    NOTA: Tampão citrato 0,01 M (pH 6,0): 2,1 mmol/L de ácido cítrico, 11,6 mmol/L de citrato trissódico di-hidratado.
  3. Permeabilizar as células incubando as lâminas em 500 μL de TritonX-100/PBS a 0,25% por 10 min. Enxágue as lâminas com PBS por 5 min três vezes.
  4. Para bloqueio antigênico, incubar as amostras com 300 μL de albumina de soro bovino (BSA) a 3%/PBST (0,1% Tween-20 em PBS) por 1 h. Incubar as amostras com os anticorpos primários em BSA/PBST a 3% durante 16 h a 4 °C. Coloque as lâminas em uma caixa umidificada para evitar que os tecidos sequem. Reaqueça as lâminas naturalmente à temperatura ambiente por 30 min.
  5. Descarte o anticorpo primário e, em seguida, enxágue as lâminas em PBST por 5 min três vezes. Diluir anticorpos secundários em BSA/PBST a 3%. Incubar as amostras com anticorpos secundários durante 1-2 h a 37 °C. Enxaguar as amostras em PBST por 5 min cinco vezes.
  6. Manchar os núcleos com 50 μL de 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 5 min à temperatura ambiente. Monte a lamínula com o meio de montagem anti-desbotamento e sele a lamínula com esmalte.
  7. Observe e registre sinais fluorescentes nas lâminas usando um microscópio fluorescente equipado com uma objetiva NA 40x/ 0,75.

4. Citometria de fluxo

  1. Coletar testículos de camundongos em placas de Petri de 6 cm e cortar os testículos em pedaços de 1 mm3 usando tesoura cirúrgica.
  2. Digerir os testículos usando 1 mL de colagenase a 1% em tubo centrífugo de 1,5 mL por 10 min a 37 °C e, em seguida, centrifugar as amostras a 1.000 x g por 5 min para precipitar as células espermatogênicas.
  3. Eliminar o sobrenadante e, em seguida, adicionar 1 ml de solução de tripsina-EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) a 0,25% durante 20 minutos a 37 °C e, em seguida, centrifugar as amostras a 1.000 x g durante 5 minutos.
  4. Eliminar o sobrenadante e, em seguida, incubar as células precipitadas com 1 mL de etanol gelado a 70% por mais de 8 h a 4 °C.
  5. Centrifugar as amostras a 1.000 x g por 5 min e, em seguida, coletar sedimentos celulares. Corar as células espermatogênicas com 500 μL de solução corada com iodeto de propídio (PI) (50 μg/mL PI, 100 μg/mL RNase A e 0,2% Triton X-100 em PBS) a 37 °C por 30 min.
    NOTA: Agite suavemente o tubo da centrífuga a cada 5 minutos para evitar agregações celulares.
  6. Filtre as amostras usando uma tela de malha 300 para se livrar de detritos celulares; recolher as células num tubo de fluxo e armazená-las a 4 °C.
  7. Detectar sinais de fluorescência e espalhamento de luz no comprimento de onda de excitação de 488 nm usando um citômetro de fluxo. Analise o conteúdo de DNA e espalhamento de luz usando o software Modfit MFLT32.

5. Microscopia eletrônica de transmissão

  1. Cortar os testículos em pedaços de 1 mm 3 usando o bisturi afiado e incubar rapidamente as amostras com solução de paraformaldeído a3 % de glutaraldeído a 1,5% em PBS 0,1 M (pH 7,2) por 4 h a 4 °C para evitar as alterações da ultraestrutura. Enxaguar as amostras com PBS 0,1 M por 5 min três vezes.
    OBS: O bisturi e a tesoura devem ser afiados e tentar evitar apertos e puxadas artificiais. O processamento das amostras deve ser realizado no fluido de fixação.
  2. Fixar as amostras em solução de ferrocianeto de potássio a 1% de ácido ósmico a 1,5% a 4 °C durante 1,5 horas. Secar a água com papel filtro e enxaguar as amostras com PBS 0,1 M por 5 min três vezes.
  3. Desidratar as amostras em 40 mL de etanol a 50% por 10 min a 4 °C. Incubar as amostras em 40 mL de etanol 70% de etanol saturado com acetato de urânio a 4 °C por 12 h, em 40 mL de etanol 90% por 10 min a 4 °C, em 40 mL de etanol-acetona a 90% por 10 min à temperatura ambiente e em 40 mL de acetona anidra por 10 min três vezes à temperatura ambiente.
  4. Incubar as amostras em mistura anidra de acetona-resina epóxi 618 (v / v = 1:1) durante 1,5 h e, em seguida, incluir as amostras em agentes incorporadores de resina epóxi 618 a 35 °C durante 3 horas.
  5. Para a polimerização da resina, incubar as amostras em agentes incorporadores de resina epóxi 618 a 35 °C por 12 h, a 45 °C por 12 h e, em seguida, a 60 °C por 24 h.
  6. Instale as amostras e a faca de vidro e, em seguida, ajuste as distâncias entre as amostras e a faca. Prepare as seções ultrafinas de 90 nm de espessura usando um micrótomo ultrafino. Corte as amostras a uma velocidade constante e, em seguida, coloque as lâminas em uma malha de níquel. Coloque as lâminas em uma placa de Petri à temperatura ambiente.
  7. Manchar as lâminas com acetato de uranila a 2% por 10 min e, em seguida, corar as amostras com citrato de chumbo a 2% por 10 min. Enxágue as lâminas com água destilada. Secar as lâminas por 24 h à temperatura ambiente.
  8. Observe as lâminas e registre imagens eletrônicas a 70-100 kV usando um microscópio eletrônico de transmissão.

Resultados

Construímos com sucesso um modelo in vivo de inibição do CENP-E de testículos de camundongos através de cirurgia abdominal e injeção testicular de GSK92329519. Os principais passos técnicos desse método foram mostrados na Figura 1. Após injeção testicular de GSK923295 por 4 dias, os testículos foram colhidos para análises posteriores. No grupo controle, a onda espermatogênica nos túbulos seminíferos era regular e organizada (

Discussão

Neste estudo, estabelecemos um modelo in vivo de inibição do CENP-E de testículos de camundongos usando a cirurgia abdominal e microinjeção de GSK923295. A cirurgia abdominal e o método de injeção testicular utilizados neste estudo apresentam as seguintes vantagens. Primeiro, não se limita à idade dos ratos. Os experimentadores podem realizar a injeção testicular em um estágio inicial, por exemplo, em camundongos de 3 semanas de idade ou mais jovens. Em segundo lugar, GSK923295 tem um efeito inibit?...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a todos os membros do Laboratório de Citoesqueleto da Fujian Medical University pelas discussões úteis. Agradecemos a Jun-Jin Lin, do Centro de Serviços de Tecnologia Pública da Fujian Medical University, pela assistência técnica em citometria de fluxo. Agradecemos a Ming-Xia Wu e Lin-Ying Zhou no Laboratório de Microscopia Eletrônica do Centro de Serviços de Tecnologia Pública da Fujian Medical University pelas assistências técnicas em microscopia eletrônica. Agradecemos a Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke, e Jun Song no Centro de Ensino Experimental de Ciências Médicas Básicas da Fujian Medical University por seus apoios. Este estudo foi apoiado pelas seguintes bolsas: Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número de bolsa 82001608), Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (número de bolsa 2019J05071), Projeto de Tecnologia de Saúde da Província de Fujian (número de bolsa 2018-1-69), Fundo de Startup para Pesquisa Científica, Universidade Médica de Fujian (número de bolsa 2017XQ1001), projeto de financiamento de start-up de pesquisa científica de talentos de alto nível da Fujian Medical University (número de bolsa XRCZX2017025) e projeto de pesquisa de educação on-line e ensino de estudantes de pós-graduação em medicina chinesa (bolsa número B-YXC20200202-06).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200056
1 ml SyringeSeveral commercial brands availableSterile.
1.5 mL Centrifuge tubeAxygenMCT-150-C
50 mL Centrifuge TubeCorning430828
6 cm Petri dishCorning430166
95% EthanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009164
tubulin rabbit polyclonal antibodyBeyotimeAF0001For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibodyAbcamab267372For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibodySangon BiotechD110022For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibodyAbcamab175191For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slidesCITOTEST188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibodyBeyotimeA0423Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10001060
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd100092690
Anti-fade mounting mediumBeyotimeP0131Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto IIBD BiosciencesFACS Canto II
Bovine Serum AlbuminSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd69003435
CentrifugeEppendorf5424BK745380
Chloral hydrateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80037516
Citric acidShanghai Experiment Reagent Co., Ltd122670
CollagenaseSangon BiotechA004194-0100
CoverslipsCITOTEST10212020C20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPIBeyotimeC1006
Dye vatSeveral commercial brands available91347802
Eosin Y, alcohol solubleSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd71014460
EtherSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009318
Formaldehyde - aqueous solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10010018
GSK923295MedChemExpressHY-10299
Hematoxylin, anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd71020784
ICR mouseShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J softwareNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotomeLeica
Leica EM UC-7 ultramicrotomeLeicaEM UC7
Modfit MFLT32Verity Software HouseFor analysis of flow cytometry results.
Nail polishSeveral commercial brands available
Neutral gumSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10004160
Nikon Ti-S2 microscopeNikonTi-S2
Picric acidSinopharm Chemical Reagent Co.,LtdJ60807
RheodyneSangon BiotechF519160-000110 μl rheodyne
Sliced paraffinSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd69019461
Sodium iodateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80117214
Surgical instrumentsSeveral commercial brands availableFor abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscopeFEITecnai G2
Trisodium citrate dihydrateShanghai Experiment Reagent Co., Ltd173970
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd30188928Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd30189328Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
ParaformaldehydeSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80096618
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10023418

Referências

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