JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طرق الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد للمركبات العضوية المسببة لسرطان المريء الغدي مع أو بدون هضم خلية واحدة لتمكين الباحثين من اختيار الاستراتيجيات المناسبة بناء على تصميمهم التجريبي.

Abstract

يعد عدم وجود نماذج بحثية انتقالية مناسبة تعكس المرض الأولي لاستكشاف تكوين الأورام والاستراتيجيات العلاجية عقبة رئيسية في السرطان الغدي المريئي (EAC). ظهرت المواد العضوية المشتقة من المرضى (PDOs) مؤخرا كنموذج رائع قبل السريري في مجموعة متنوعة من أنواع السرطان. ومع ذلك، لا تزال هناك بروتوكولات محدودة متاحة لتطوير منظمات تنمية نفط أفريقيا التابعة لمجموعة شرق أفريقيا. وبمجرد إنشاء مؤسسات تنمية نفط عمان، يصبح الانتشار والحفظ بالتبريد ضروريين لإجراء المزيد من التحليلات النهائية. هنا ، تم توحيد طريقتين مختلفتين للزراعة الفرعية وحفظ التبريد في EAC PDO ، أي مع وبدون هضم خلية واحدة. يمكن لكلتا الطريقتين الحصول على صلاحية مناسبة للخلية بشكل موثوق وقابلة للتطبيق على إعداد تجريبي متنوع. أظهرت الدراسة الحالية أن زراعة الباطن EAC PDOs مع هضم خلية واحدة مناسبة لمعظم التجارب التي تتطلب التحكم في عدد الخلايا ، والكثافة الموحدة ، وبنية جوفاء تسهل تتبع الحجم. ومع ذلك ، فإن الطريقة القائمة على خلية واحدة تظهر نموا أبطأ في الثقافة وكذلك بعد إعادة الزراعة من المخزونات المجمدة. إلى جانب ذلك ، يتميز التزريع الفرعي بهضم خلية واحدة بتشكيل هياكل مجوفة ذات نواة جوفاء. في المقابل ، فإن معالجة EAC PDOs دون هضم خلية واحدة مواتية للحفظ بالتبريد والتوسع والتوصيف النسيجي. في هذا البروتوكول ، يتم وصف مزايا وعيوب الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد ل EAC PDOs مع وبدون هضم خلية واحدة لتمكين الباحثين من اختيار طريقة مناسبة لمعالجة والتحقيق في المواد العضوية الخاصة بهم.

Introduction

سرطان المريء (EC) هو العاشر الأكثر شيوعا والسبب الرئيسي السادس للوفاة من السرطان في جميع أنحاء العالم1. السرطان الغدي المريئي (EAC) هو أحد الأنواع الفرعية النسيجية الرئيسية لل EC ويحدث بشكل رئيسي في البلدان الغربية2. في العقد الأخير ، زاد معدل الإصابة ب EAC بشكل كبير في العديد من البلدان المتقدمة ، بما في ذلك ألمانيا3. بسبب عدوانية السرطان وعدم وجود أعراض خلال المرحلة المبكرة من تطور الورم ، فإن التشخيص العام في مرضى EAC ضعيف ، حيث يظهر معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات حوالي 20٪ 2,4,5.

منذ أواخر القرن العشرين ، تم إنشاء العديد من النماذج للبحوث الطبية الحيوية في EAC. خطوط خلايا EAC البشرية الكلاسيكية التي تم إنشاؤها في 1990s6 ، توسع معرفتنا ببيولوجيا أورام EAC ، وعلم الوراثة للورم ، بالإضافة إلى استراتيجيات مكافحة الورم ، وتستخدم عادة في أبحاث EAC. إلى جانب ذلك ، نجحت بعض المجموعات البحثية في تطوير نماذج حيوانية من EAC أو مريء باريت عن طريق تعريض الحيوانات لعوامل الخطر المعروفة مثل الارتجاع المعدي المريئي من خلال الأساليب الجراحية أو الالتهابية 7,8,9. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير نماذج xenograft (PDX) المشتقة من المريض والتي تغرس أنسجة السرطان الأولية EAC تحت الجلد أو بشكل تقويمي في الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، لمحاكاة السلوك البيولوجي البشري لورم EAC وبيئة الورم 10،11،12. ومع ذلك ، على الرغم من أن هذه النماذج تعمل على تحسين التطبيقات السريرية وفهمنا للآليات الجزيئية وراء تكوين الأورام وتطورها في EAC ، لا يزال هناك تحد كبير لاستقراء النتائج من هذه النماذج البحثية للبشر.

تزرع المواد العضوية المشتقة من المريض (PDOs) في نظام ثقافة 3D الذي يحاكي التنمية البشرية وتجديد الأعضاء في المختبر. تقوم PDOs المتولدة من الأنسجة الأولية للمرضى بتلخيص الخصائص الجزيئية والمظهرية للورم البشري وأظهرت تطبيقات واعدة في تطوير الأدوية وعلاج السرطان الشخصي13,14. ومن خلال مقارنة عشر حالات من منظمات تنمية نفط أفريقيا مع أنسجة الورم المقترنة بها، تفيد التقارير بأن هذه الحالات تشترك في سمات نسيجية مرضية مماثلة ومشهد جينومي مع الورم الأساسي، وتحتفظ بعدم التجانس داخل الورم وتسهل الفحص الفعال للأدوية في المختبر15. كما تم استخدام منظمات تنمية نفط أفريقيا في دراسة تفاعل الخلايا السرطانية التابعة ل EAC مع الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) المشتقة من المريض ، مما يشير إلى وجود تطبيق قوي في مجال أبحاث البيئة الدقيقة للورم16. لسوء الحظ ، كانت هناك بروتوكولات محدودة متاحة لتطوير ونشر منظمات تنمية نفط EAC. هنا ، يتم وصف طريقتين مختلفتين للزراعة الفرعية والحفاظ على PDOs EAC بالتفصيل: مع وبدون هضم خلية واحدة. يمكن للطرق الموحدة لصيانة منظمات تنمية نفط أفريقيا وتطبيقاتها أن تدعم الباحثين لاختيار الأساليب المناسبة لأغراض مختلفة في أبحاثهم الخاصة بشركة تنمية نفط أفريقيا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمثل ثقافة شركة تنمية نفط عمان الراسخة والمتنامية جيدا الأساس لنجاح الثقافة الفرعية والحفظ بالتبريد الموصوف في هذا البروتوكول. هنا ، تم إنشاء EAC PDOs من أنسجة الورم الأولية لمرضى EAC باستخدام البروتوكول الذي وصفه Karakasheva T. A. et al17. تم جمع أنسجة EAC من البنك الحيوي بموجب موافقة BioMaSOTA (وافقت عليها لجنة الأخلاقيات بجامعة كولونيا ، ID: 13-091).

ملاحظة: تم استزراع شركات تنمية نفط عمان التابعة لشركة EAC في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 باستخدام وسيط استزراع شركة تنمية نفط عمان (الجدول 1). في الخطوات التالية ، يتم وصف طريقتين للثقافة الفرعية بالتفصيل. يوصى باستخدام صفيحة من 12 بئرا لزراعة برادو بكثافة بذر تبلغ ثلاث قباب هلامية مصفوفة خارج الخلية (ECM) لكل بئر ، لأنها تسمح بالاستخدام المرن لكل بئر وكمية مناسبة من PDOs لأغراض مختلفة. تقنية التعقيم إلزامية أثناء التعامل مع شركات تنمية نفط عمان.

1. التحضيرات مقدما

  1. قم بتسخين صفيحة من 12 بئرا مسبقا عن طريق وضعها في حاضنة CO2 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل الزراعة الفرعية لضمان الاحترار الكامل للصفيحة. إذا كان ذلك متاحا، استخدم الآبار الفارغة من طبق مع ثقافة شركة تنمية نفط عمان الحالية.
    ملاحظة: يوصى بالتخزين المستمر ل 1-2 ألواح طازجة عند 37 درجة مئوية للتخطيط المرن للزراعة الفرعية.
  2. قم بتبريد 1000 ميكرولتر و 200 ميكرولتر مسبقا مع فتحة واسعة عند -20 درجة مئوية (يوصى بالتخزين المستمر). جهاز طرد مركزي بارد مسبقا عند 4 درجات مئوية.
  3. قم بإعداد درجة حرارة الحاضنة الدوارة إلى 37 درجة مئوية (إذا تم إجراء عملية هضم خلية واحدة).
  4. احتضان كمية مناسبة من هلام ECM لمدة 1 ساعة على الجليد لتسييلها. ضع محلول استعادة الخلية على الجليد.

2. حصاد المواد العضوية

  1. قم بإزالة اللوحة مع شركات تنمية نفط عمان المتنامية من حاضنة CO2.
  2. شفط الوسط القديم باستخدام مضخة تفريغ.
    ملاحظة: تجنب لمس القباب.
  3. أضف كمية مناسبة من محلول استعادة الخلايا الباردة (500 ميكرولتر / قبة) إلى البئر.
  4. قم بتفكيك هلام ECM عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفتيت قباب هلام ECM إلى قطع صغيرة باستخدام أطراف 1000 ميكرولتر مع فتحة واسعة.
  5. امزج خليط من PDO وهلام ECM ومحلول استعادة الخلايا من بئرين كحد أقصى (ست قباب) وانقله إلى أنبوب منخفض الربط سعة 5 مل (استخدم أنبوبا ثانيا في حالة استخدام المزيد من الآبار للزراعة الفرعية).
    ملاحظة: اختياريا، إذا لم يتم إذابة هلام ECM بالكامل، أضف 1.5 مل إضافية من محلول استعادة الخلايا إلى خليط من PDO وهلام ECM ومحلول استرداد الخلايا.
  6. احتضن الأنبوب الذي يحتوي على الخليط في الخطوة 2.5 على الثلج لمدة 20 دقيقة ، واخلطه كل 5 دقائق عن طريق عكس الأنبوب خمس مرات لضمان تسييل هلام ECM.
  7. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  8. إذا كانت هناك حبيبة مرئية ومستقرة بعد الطرد المركزي ، فتابع الخطوة 2.10. وإلا، فتابع إلى الخطوة 2.9.
  9. إذا لم يكن هناك حبيبات مرئية ولا تزال PDOs عالقة في مرحلة هلام ، فقم بإزالة supernatant بعناية باستخدام مضخة تفريغ حتى يتم الوصول إلى المرحلة التي تحتوي على ECM gel-PDO-Solution وإضافة 3 مل من محلول استعادة الخلايا الباردة الثلجية.
    1. اقلب الأنبوب عدة مرات واحتضنه على الثلج لمدة 10 دقائق أخرى. اخلط عن طريق عكس الأنبوب من وقت لآخر.
    2. جهاز طرد مركزي عند 500 × g لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية واستمر في الخطوة 2.10.
  10. تخلص من المادة الفائقة بعناية باستخدام مضخة تفريغ أو ماصة سعة 1000 ميكرولتر. حاول إزالة supernatant قدر الإمكان.
    ملاحظة: نظرا لانخفاض سطح الربط للأنبوب ، لن تكون الكريات مستقرة كالمعتاد.
  11. قم بتخزين حبيبات شركة تنمية نفط عمان على الجليد وتابع الخطوة 3 (بدون هضم) أو الخطوة 4 (مع هضم خلية واحدة) اعتمادا على الأغراض المختلفة.

3. الزراعة الفرعية دون هضم

ملاحظة: تهدف هذه الطريقة إلى زيادة حجم وكثافة شركات تنمية نفط عمان. يسهل الحجم الأكبر والكثافة العالية عملية التضمين والتوصيف النسيجي وتوسيع شركة تنمية نفط عمان. اعتمادا على نسب تقسيم شركة تنمية نفط عمان (بناء على كثافة شركات تنمية نفط عمان، يوصى بنسبة تتراوح بين 1:3 و 1:6)، أعد تعليق الكريات من الخطوة 2.8 في حجم مناسب من هلام ECM السائل.

  1. قم بإزالة أطراف 200 ميكرولتر و 1000 ميكرولتر المبردة مسبقا باستخدام فتحة واسعة من الفريزر -20 درجة مئوية وضعها على مقعد نظيف.
  2. أعد تعليق الكريات من الخطوة 2.11 في هلام ECM باستخدام أطراف 1000 ميكرولتر مبردة مسبقا. امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات للتأكد من أن شركات تنمية نفط عمان لا تتكتل ويتم توزيعها بالتساوي في هلام ECM.
    ملاحظة: استخدم 50 ميكرولتر ECM gel/dome. احسب دائما لقبة واحدة أكثر من المطلوب (على سبيل المثال ، لتسع قباب (أي ثلاثة آبار) ، أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من هلام ECM السائل (450 + 50 ميكرولتر إضافي). حاول تجنب إنتاج فقاعات أثناء إعادة التعليق!
  3. قم بإزالة الصفيحة ذات ال 12 بئرا التي تم تسخينها مسبقا من الحاضنة مباشرة قبل بذر القباب.
  4. قباب البذور التي تحتوي على 50 ميكرولتر من هلام ECM في الصفيحة الدافئة (ثلاث قباب / بئر). تجنب سحب الفقاعات إلى قباب هلام ECM.
  5. ضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2واحتضنها لمدة 20-30 دقيقة لتصلب هلام ECM.
  6. أضف وسيط شركة تنمية نفط عمان المسخن مسبقا (الجدول 1) بعناية دون إزعاج القباب.
  7. استزرع مؤسسات تنمية نفط عمان لمدة 7-14 يوما حتى تحدث الكثافة والمورفولوجيا المطلوبة.

4. الزراعة الفرعية مع هضم خلية واحدة

ملاحظة: تهدف الخطوات التالية إلى زيادة عدد شركات تنمية نفط عمان لكل قبة. يسهل هضم الخلية الواحدة التحكم في عدد الخلايا وتوسيع شركة تنمية نفط عمان.

  1. تحضير وسط الهضم عن طريق خلط 2 مل من 0.25 ٪ من التربسين-EDTA و 20 ميكرولتر DNase I (لهضم ثلاث قباب).
  2. أعد تعليق الكريات من الخطوة 2.11 بحجم مناسب من Trypsin-EDTA + DNase I المسخن مسبقا بنسبة 0.25٪ واخلطها حوالي 10 مرات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر (استخدم نصائح 1000 ميكرولتر العادية).
  3. احتضن لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة دوارة بسرعة دوران لا تقل عن 28 دورة في الدقيقة.
  4. قم بإعداد أنبوب 15 مل يحتوي على 6 مل من محلول مثبطات التربسين لفول الصويا (STI ، الجدول 2) (لكل 2 مل من 0.25٪ Trypsin-EDTA).
  5. بعد الهضم، امزج منظمات تنمية نفط عمان المهضومة جيدا عدة مرات مع ماصة سعة 1000 ميكرولتر لتعطيل منظمات تنمية نفط عمان.
  6. انقل PDOs المهضومة إلى أنبوب 15 مل يحتوي على محلول STI لوقف عملية الهضم.
  7. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة بعناية باستخدام مضخة تفريغ أو ماصة سعة 1000 ميكرولتر. أعد تعليق الكريات في 1 مل من الوسط القاعدي (الجدول 3).
  8. تحديد تركيز الخلية وقابليتها للحياة باستخدام عداد خلية آلي أو مقياس دم.
  9. هضمت البذور شركة تنمية نفط عمان في صفيحة من 12 بئرا مع 2 × 104 خلايا لكل قبة.
    1. احسب رقم الخلية وفقا للقباب المخطط لها للبذر وانقلها إلى أنبوب ربط منخفض 1.5 مل جديد.
      ملاحظة: احسب لقبة واحدة أكثر (+ 2 × 104 خلايا إضافية). على سبيل المثال ، لبذر ثلاث قباب في بئر واحد ، خذ 8 × 10 4 (2 × 10 4 * 3 + 2 × 104 إضافية) خلايا.
    2. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. في حالة عدم وجود بيليه مرئي ، تذكر اتجاه الأنبوب داخل جهاز الطرد المركزي لمعرفة مكان وجود الكرية.
    4. تخلص بعناية من supernatant باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. قم بإزالة supernatant قدر الإمكان دون إزعاج الكريات.
    5. أضف الحجم المناسب من هلام ECM إلى الكريات باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع طرف فتحة عريضة 1000 ميكرولتر مبرد مسبقا (50 ميكرولتر / قبة + 50 ميكرولتر إضافي).
    6. اتبع الخطوات من 3.3 إلى 3.7.

5. الحفظ بالتبريد لمنظمات تنمية نفط عمان المهضومة وغير المهضومة

ملاحظة: تعتبر منظمات تنمية نفط عمان المهضومة وغير المهضومة ذات الخلية الواحدة مناسبة لإعداد المخزونات الاحتياطية المجمدة. لاحظ أن شركة تنمية نفط عمان المعاد زراعتها من المخزونات المجمدة ذات الخلية الواحدة تتطلب وقتا أطول للتعافي والوصول إلى حجم معين.

  1. الحفظ بالتبريد لمنظمات تنمية نفط عمان غير المهضومة.
    1. ابدأ عملية الحفظ بالتبريد باستخدام الكريات من الخطوة 2.8. استخدم 500 ميكرولتر من وسط التجميد البارد لإعادة تعليق الكريات ونقلها إلى قارورة مبردة.
      ملاحظة: تخزين قبتين لكل قارورة.
    2. قم بتجميد PDOs بين عشية وضحاها في ثلاجة -80 درجة مئوية باستخدام حاوية تجميد الخلايا المناسبة.
  2. الحفظ بالتبريد ل PDOs المهضومة ذات الخلية الواحدة
    1. بعد حصاد وهضم PDOs ، ابدأ الحفظ بالتبريد من الخطوة 4.8.
    2. لتخزين قارورة واحدة مبردة ، انقل 4-5 × 10 5 خلايا إلى أنبوب ربط منخفض1.5 مل جديد.
      ملاحظة: تخزين ثلاث قباب / قارورة.
    3. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت بعناية باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. قم بإزالة supernatant قدر الإمكان دون إزعاج الكريات.
    4. أعد تعليق الكريات في حجم مناسب من وسط التجميد (500 ميكرولتر / قارورة) وانقلها إلى قارورة مبردة.
    5. قم بتجميد PDOs بين عشية وضحاها في ثلاجة -80 درجة مئوية باستخدام حاوية تجميد الخلايا المناسبة ونقلها إلى فريزر -150 درجة مئوية أو النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يقدم هذا البروتوكول الإجراءات بما في ذلك الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد ل EAC PDOs مع وبدون هضم خلية واحدة.

ويبين الشكل 1 صورا تمثيلية لتباين الطور لاستراتيجيتي الثقافة الفرعية المختلفتين. وصلت شركات تنمية نفط أفريقيا إلى الكثافة المناسبة للزراعة الفرعية (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذا البروتوكول ، يتم وصف طريقتين مختلفتين للزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد ل EAC PDOs ، أي مع وبدون هضم خلية واحدة. أوصت العديد من الدراسات بتمرير PDOs EAC مع هضم خلية واحدة15,17 ، وهو أمر مفيد لمعظم التجارب التي تتطلب التحكم في عدد الخلايا ، وكثافة موحدة ، وبنية مج?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح في هذا العمل.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج كولن فورتشن / كلية الطب ، جامعة كولونيا. ونشكر المساعدة التقنية المقدمة من سوزان نيس وميكايلا هايتمان وأنكي ويناند - دورفيلر. تم دعم Ningbo Fan ماليا من قبل مجلس قوانغتشو للمنح الدراسية للنخبة (GESC). يشكر المؤلفون الدكتور جوشوا دي روزاريو على مساعدته في التحرير اللغوي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
-20°C FreezerBoschEconomic
-80°C FreezerPanasonicMDF DU500VH-PE
Automated Cell counterThermo FisherAMQAX1000Countess II
Biological Safety Cabinet Class IIThermo Scientific51022482Herasafe KS12
CentrifugeHeraeus75003060Megafuge 1.0R
CO2 IncubatorThermo Scientific50116048Heracell 150i
Inverted automated fluorescence microscopeOlympusIX83
Inverted light microscopeLeicaDMIL LED Fluo
Pipette 1000 µLEppendorf3123000063Research Plus
Pipette 200 µLEppendorf3123000039Research Plus
Rotating IncubatorScientific Industries, sc.SI-1200Enviro-genie
ShakerEppendorf5355 000.011Thermomixer Comfort
Vacuum pumpVacuubrand20727200BVC control
WaterbathMedingenp2725W22
Material
15 mL tubeSarstedt62.554.502Inc Screw cap tube PP 15 mL
Cryo vial 2 mLSarstedt72.379CryoPure 2.0 mL tube
Low bind tube 1.5 mLSarstedt72.706.600Micro tube 1.5 mL protein LB
Low bind tube 5 mLEppendorf0030 108.302Protein LoBind Tube 5.0 mL
Pipette tip 200 µLStarlabE1011-8000200 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µLStarlabE1011-90001000 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µLSarstedt70.3050Pipette tip 1000 µL
Sterile filter 0.2 µmSarstedt83.1826.001Filtropur 0.2 µm sterile filter
Tissue culture plateSarstedt83.392112 well-plate
Reagent/Chemical
A83-01Tocris2939
Advanced DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634010
Amphotericin BThermo Fisher Scientific15290026
B-27Thermo Fisher Scientific17504001
Cell Recovery SolutionCorning354253
CHIR-99021MedChemExpressHY-10182/CS-0181
DNase I grade II, from bovine pancreasSigma-Aldrich10104159001
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190094
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane MatrixCorning356231
FGF-10aPeprotech100-26-100
Freezing medium: Recovery Cell Freezing MediumThermo Fisher Scientific12648010
GastrinSigmaG9020
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL)PromoCellC-36030
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080
L-Glutamine 200 mM (100X)Thermo Fisher Scientific25030024
N-2Thermo Fisher Scientific17502-048
N-AcetylcysteineSigmaA9165
NicotinamideSigmaN0636-100
NogginPeprotech120-10C-50
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)Thermo Fisher Scientific15140122
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)PeprotechAF-100-15
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin CellsBiotechne3710-001-01
SB202190MedChemExpress152121-30-7
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)Sigma-Aldrich93620-1G
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol redThermo Fisher Scientific25200056
Wnt-3A conditioned mediumWnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group
Y-27632SigmaY0503

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Coleman, H. G., Xie, S. -H., Lagergren, J. The epidemiology of esophageal adenocarcinoma. Gastroenterology. 154 (2), 390-405 (2018).
  3. Rumgay, H., et al. International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence. The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).
  4. Qian, H., et al. Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis. Frontiers in Oncology. 11, 603349(2021).
  5. Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. Oesophageal cancer. Lancet. 390 (10110), London, England. 2383-2396 (2017).
  6. Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization. British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).
  7. Hashimoto, N. Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents. ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).
  8. Quante, M., et al. Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia. Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).
  9. Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future. Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).
  10. Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers. Aging. 13 (8), Albany NY. 12273-12293 (2021).
  11. Liu, D. S. H., et al. APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma. Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).
  12. Ebbing, E. A., et al. Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition. Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).
  13. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  14. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  15. Li, X., et al. Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. Nature Communications. 9, 2983(2018).
  16. Ebbing, E. A., et al. Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).
  17. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109(2020).
  18. Ordóñez, N. G. Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review. Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).
  19. Maniar, K. P., Umpires, B. Cytokeratin 7 (CK7, K7). Pathology Outlines.com website. , https://www.pathologyoutlines.com/topic/stainsck7.html (2021).
  20. Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
  21. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  22. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved