Özofagus adenokarsinom organoidlerinin alt kültürü ve kriyoprezervasyonu: Tek hücreli sindirim için artıları ve eksileri

Özet

Bu protokol, araştırmacıların deneysel tasarımlarına dayanarak uygun stratejileri seçmelerini sağlamak için özofagus adenokarsinom organoidlerinin tek hücreli sindirimli ve tek hücreli sindirimsiz alt kültür ve kriyoprezervasyon yöntemlerini açıklamaktadır.

Özet

Tümörigenezi ve tedavi stratejilerini araştırmak için primer hastalığı yansıtan uygun translasyonel araştırma modellerinin bulunmaması, özofagus adenokarsinomunda (EAC) önemli bir engeldir. Hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar) son zamanlarda çeşitli kanserlerde dikkate değer bir klinik öncesi model olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, EAC PDO'ları geliştirmek için hala sınırlı protokoller bulunmaktadır. PDO'lar kurulduktan sonra, yayılma ve kriyoprezervasyon, daha sonraki aşağı akış analizleri için gereklidir. Burada, EAC PDO'ların alt kültürü ve kriyoprezervasyonu, yani tek hücreli sindirimli ve sindirimsiz olmak üzere iki farklı yöntem standartlaştırılmıştır. Her iki yöntem de uygun hücre canlılığını güvenilir bir şekilde elde edebilir ve çeşitli deneysel kurulumlar için uygulanabilir. Mevcut çalışma, EAC PDO'ların tek hücreli sindirimle alt kültürlenmesinin, hücre numarası kontrolü, homojen yoğunluk ve boyut izlemeyi kolaylaştıran içi boş bir yapı gerektiren çoğu deney için uygun olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, tek hücreli yöntem, kültürde ve dondurulmuş stoklardan yeniden ekimden sonra daha yavaş büyüme göstermektedir. Ayrıca, tek hücreli sindirim ile alt kültürleme, içi boş bir çekirdeğe sahip içi boş yapılar oluşturarak karakterize edilir. Buna karşılık, EAC PDO'ların tek hücreli sindirim olmadan işlenmesi kriyoprezervasyon, genişleme ve histolojik karakterizasyon için elverişlidir. Bu protokolde, araştırmacıların organoidlerini işlemek ve araştırmak için uygun bir yöntem seçmelerini sağlamak için EAC PDO'ların tek hücreli sindirimli ve tek hücreli sindirimsiz alt kültürlenmesi ve kriyoprezervasyonunun avantajları ve dezavantajları açıklanmaktadır.

Giriş

Özofagus kanseri (EC), dünya çapında kanserden kaynaklanan ölümlerin onuncu en yaygın ve altıncı önde gelen nedenidir¹. Özofagus adenokarsinomu (EAK) EK'nin başlıca histolojik alt tiplerinden biridir ve esas olarak batı ülkelerinde görülür². Son on yılda, EAC insidansı, Almanya³ de dahil olmak üzere birçok gelişmiş ülkede önemli ölçüde artmıştır. Kanserin agresifliği ve tümör gelişiminin erken evresinde semptomların olmaması nedeniyle, EAC hastalarında genel prognoz kötüdür ve 5 yıllık sağkalım ^{oranı yaklaşık%} 20,4,5'tir.

Yirminci yüzyılın sonlarından bu yana, EAC'nin biyomedikal araştırmaları için çeşitli modeller oluşturulmuştur. 1990'larda kurulan klasik insan EAC hücre hatları⁶, EAC tümör biyolojisi, tümör genetiği ve anti-tümör stratejileri hakkındaki bilgimizi genişletir ve EAC araştırmalarında yaygın olarak kullanılır. Ayrıca, bazı araştırma grupları, cerrahi veya enflamatuar yaklaşımlarla hayvanları gastroözofageal reflü gibi bilinen risk faktörlerine maruz bırakarak EAC veya Barrett özofagusunun hayvan modellerini başarıyla geliştirmiştir ^7,8,9. Ek olarak, EAC primer kanser dokularını deri altından veya ortopik olarak immün yetmezlikli farelere aşılayan hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri, insan EAC tümör biyolojik davranışını ve tümör ortamını simüle etmek için geliştirilmiştir^10,11,12. Bununla birlikte, klinik uygulamaları geliştiren bu modellere ve EAC tümörigenezi ve progresyonunun arkasındaki moleküler mekanizmaları anlamamıza rağmen, bu araştırma modellerinden elde edilen sonuçları insanlara tahmin etmek için hala büyük bir zorluk vardır.

Hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDO'lar), in vitro olarak insan gelişimini ve organ yenilenmesini taklit eden bir 3D kültür sisteminde yetiştirilir. Hastaların birincil dokusundan üretilen PDO'lar, insan tümörünün moleküler ve fenotipik özelliklerini özetlemekte ve ilaç geliştirme ve kişiselleştirilmiş kanser tedavisinde umut verici uygulamalar göstermiştir^13,14. On EAC PDO vakasını eşleştirilmiş tümör dokusu ile karşılaştırarak, EAC PDO'ların primer tümörle benzer histopatolojik özellikleri ve genomik manzarayı paylaştığı, tümör içi heterojeniteyi koruduğu ve in vitro^15'te etkili ilaç taramasını kolaylaştırdığı bildirilmiştir. EAC PDO'lar, EAC tümör hücrelerinin hasta kaynaklı kanserle ilişkili fibroblastlarla (CAF'lar) etkileşimini incelemede de kullanılmıştır, bu da tümör mikroçevre araştırması alanında güçlü bir uygulamaya işaret etmektedir¹⁶. Ne yazık ki, EAC PDO'ları geliştirmek ve yaymak için sınırlı protokoller mevcuttur. Burada, EAC PDO'ların alt kültürlenmesi ve korunması için iki farklı yöntem ayrıntılı olarak açıklanmaktadır: tek hücreli sindirim ile ve sindirimsiz. EAC PDO'ların ve uygulamalarının bakımı için standartlaştırılmış yöntemler, araştırmacıların EAC PDO araştırmalarında farklı amaçlar için uygun yöntemleri seçmelerini destekleyebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Yerleşik ve iyi büyüyen bir PDO kültürü, bu protokolde açıklanan başarılı bir alt kültür ve kriyoprezervasyonun temelini temsil eder. Burada, EAC PDO'ları, Karakasheva T. A. ve ark.¹⁷ tarafından tanımlanan protokol kullanılarak EAC hastalarının primer tümör dokusundan üretildi. EAC dokuları BioMaSOTA'nın onayı altında biyobankadan toplanmıştır (Köln Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır, ID: 13-091).

NOT: EAC PDO'lar, bir PDO kültür ortamı kullanılarak nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de ve% 5 CO_2'de kültürlenmiştir (Tablo 1). Aşağıdaki adımlarda, alt kültürün iki yöntemi ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. PDO'ların kuyu başına üç hücre dışı matris (ECM) jel kubbesinin tohumlama yoğunluğuna sahip alt kültürlenmesi için 12 delikli bir plaka önerilir, çünkü her bir kuyucuğun esnek kullanımına ve farklı amaçlar için uygun miktarda PDO'ya izin verir. PDO'ları kullanırken aseptik bir teknik zorunludur.

1. Önceden hazırlıklar

1. 12 delikli bir plakayı, plakanın tamamen ısınmasını sağlamak için alt kültürden önce gece boyunca 37 °C CO₂ inkübatöre yerleştirerek önceden ısıtın. Varsa, mevcut PDO kültürüne sahip bir plakadan boş kuyucuklar kullanın.
   NOT: Esnek alt kültür planlaması için 1-2 taze plakanın 37 °C'de sürekli depolanması önerilir.
2. -20 °C'de geniş bir deliğe sahip 1.000 μL ve 200 μL uçları önceden soğutun (sürekli depolama önerilir). 4 °C'de ön soğutma santrifüjü.
3. Dönen inkübatörün sıcaklığını 37 ° C'ye ayarlayın (tek hücreli sindirim gerçekleştirilirse).
4. Sıvılaştırmak için buz üzerinde 1 saat boyunca uygun miktarda ECM jeli inkübe edin. Hücre kurtarma solüsyonunu buzun üzerine yerleştirin.

2. Organoidlerin toplanması

1. Büyüyen PDO'larla plakayı CO₂inkübatöründen çıkarın.
2. Bir vakum pompası kullanarak eski ortamı aspire edin.
   NOT: Kubbelere dokunmaktan kaçının.
3. Kuyuya uygun miktarda buz gibi soğuk hücre geri kazanım çözeltisi (500 μL / kubbe) ekleyin.
4. ECM jel kubbelerini geniş delikli 1.000 μL uçlar kullanarak küçük parçalara ayırmak için ECM jelini birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek parçalayın.
5. PDO, ECM jel ve hücre geri kazanım çözeltisi karışımını maksimum iki kuyucuktan (altı kubbe) birleştirin ve 5 mL'lik düşük bağlamalı bir tüpe aktarın (alt kültür için daha fazla kuyu kullanılması durumunda ikinci bir tüp kullanın).
   NOT: İsteğe bağlı olarak, ECM jeli tamamen çözülmemişse, PDO, ECM jeli ve hücre geri kazanım çözeltisi karışımına ilave 1,5 mL hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin.
6. Karışımı içeren tüpü 2.5. adımda buz üzerinde 20 dakika boyunca inkübe edin, ECM jelinin sıvılaşmasını sağlamak için tüpü beş kez ters çevirerek her 5 dakikada bir karıştırın.
7. 4° C'de 4 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj
8. Santrifüjlemeden sonra görünür ve kararlı bir pelet varsa, adım 2.10 ile devam edin. Aksi takdirde, adım 2.9 ile devam edin.
9. Görünür bir pelet yoksa ve PDO'lar hala bir jel fazında sıkışmış gibi görünüyorsa, ECM jel-PDO-Çözeltisi içeren faza ulaşılana kadar süpernatantı bir vakum pompasıyla dikkatlice çıkarın ve 3 mL buz gibi soğuk hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin.
   1. Tüpü birkaç kez ters çevirin ve 10 dakika daha buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Zaman zaman tüpü ters çevirerek karıştırın.
   2. 4 °C'de 4 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve adım 2.10 ile devam edin.
10. Süper natantı bir vakum pompası veya 1.000 μL pipet kullanarak dikkatlice atın. Süpernatantı mümkün olduğunca çıkarmaya çalışın.
    NOT: Tüpün düşük bağlanma yüzeyi nedeniyle, pelet her zamanki gibi stabil olmayacaktır.
11. PDO peletini buz üzerinde saklayın ve farklı amaçlara bağlı olarak adım 3 (sindirim olmadan) veya adım 4 (tek hücreli sindirim ile) ile devam edin.

3. Sindirim olmadan alt kültürleme

NOT: Bu yöntem, PDO'ların boyutunu ve yoğunluğunu arttırmayı amaçlamaktadır. Daha büyük boyut ve daha yüksek yoğunluk, gömme işlemini, histolojik karakterizasyonu ve PDO genişlemesini kolaylaştırır. PDO bölünmüş oranlarına bağlı olarak (PDO'ların yoğunluğuna bağlı olarak, 1:3 ile 1:6 arasında bir oran önerilir), peleti uygun bir sıvı ECM jeli hacminde adım 2.8'den yeniden askıya alın.

1. Önceden soğutulmuş 200 μL ve 1.000 μL uçları geniş bir delikle -20 °C dondurucudan çıkarın ve temiz bir tezgaha yerleştirin.
2. Önceden soğutulmuş 1.000 μL uçlar kullanarak peleti ECM jelindeki adım 2.11'den yeniden askıya alın. PDO'ların kümelenmediğinden ve ECM jelinde eşit olarak dağıtıldığından emin olmak için yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın.
   NOT: 50 μL ECM jel/kubbe kullanın. Her zaman gerekenden daha fazla bir kubbe için hesaplayın (örneğin, dokuz kubbe (yani üç kuyucuk) için, peleti 500 μL sıvı ECM jelinde (450 + 50 μL ekstra) yeniden askıya alın. Yeniden süspansiyon sırasında kabarcık üretmekten kaçınmaya çalışın!
3. Kubbeleri tohumlamadan hemen önce önceden ısıtılmış 12 delikli plakayı inkübatörden çıkarın.
4. Sıcak plakaya 50 μL ECM jel içeren tohum kubbeleri (üç kubbe / kuyu). ECM jel kubbelerine pipetleme kabarcıkları sokmaktan kaçının.
5. Plakayı tekrar 37 °C ve% 5 CO₂inkübatöre koyun ve ECM jelini katılaştırmak için 20-30 dakika inkübe edin.
6. Kubbeleri rahatsız etmeden önceden ısıtılmış PDO ortamını (Tablo 1) dikkatlice ekleyin.
7. Kültür PDO'ları 7-14 gün boyunca gerekli yoğunluk ve morfoloji oluşana kadar kültüre alın.

4. Tek hücreli sindirim ile alt kültürleme

NOT: Aşağıdaki adımlar, kubbe başına PDO sayısını artırmayı amaçlamaktadır. Tek hücreli sindirim, hücre sayısı kontrolünü ve PDO genişlemesini kolaylaştırır.

1. 2 mL% 0.25 Tripsin-EDTA ve 20 μL DNaz I (üç kubbenin sindirimi için) karıştırarak sindirim ortamı hazırlayın.
2. Peleti adım 2.11'den uygun bir önceden ısıtılmış %0,25 Tripsin-EDTA + DNaz I hacmiyle yeniden askıya alın ve 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetle çekerek yaklaşık 10 kez karıştırın (normal 1.000 μL uçları kullanın).
3. Minimum 28 rpm dönüş hızına sahip döner bir inkübatörde 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
4. 6 mL Soya Tripsin İnhibitörü (STI, Tablo 2) çözeltisi içeren 15 mL'lik bir tüp hazırlayın (2 mL% 0.25 Tripsin-EDTA başına).
5. Sindirimden sonra, PDO'ları bozmak için sindirilmiş PDO'ları 1.000 μL'lik bir pipetle birkaç kez iyice karıştırın.
6. Sindirim sürecini durdurmak için sindirilmiş PDO'ları STI çözeltisi içeren 15 mL tüpe aktarın.
7. 4 °C'de 4 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj. Süper natantı bir vakum pompası veya 1.000 μL pipet kullanarak dikkatlice atın. Peletin 1 mL bazal ortamda yeniden askıya alınması (Tablo 3).
8. Otomatik bir hücre sayacı veya bir Hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu ve canlılığını belirleyin.
9. Tohum, PDO'yu kubbe başına 2 x 10⁴ hücreli 12 delikli bir plakaya sindirdi.
   1. Tohumlama için planlanan kubbelere göre hücre sayısını hesaplayın ve bunları taze bir 1,5 mL düşük bağlama tüpüne aktarın.
      NOT: Bir kubbe daha (+ 2 x 10⁴ hücre ekstra) için hesaplayın. Örneğin, üç kubbeyi bir kuyuya yerleştirmek için 8 x 10 4 (2 x 10 4 * 3 + 2 x 10⁴ ekstra) hücre alın.
   2. 4 °C'de 4 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj.
   3. Görünür bir pelet yoksa, peletin nerede olduğunu bilmek için santrifüjün içindeki tüpün yönünü unutmayın.
   4. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice atın. Pelet'i rahatsız etmeden süpernatantı mümkün olduğunca çıkarın.
   5. Önceden soğutulmuş 1.000 μL geniş delik ucuna sahip 1.000 μL pipet kullanarak pelete uygun hacimde ECM jeli ekleyin (50 μL/kubbe + 50 μL ekstra).
   6. 3.3-3.7 arasındaki adımları izleyin.

5. Sindirilmiş ve sindirilmemiş PDO'ların kriyoprezervasyonu

NOT: Tek hücreli sindirilmiş ve sindirilmemiş PDO'lar, dondurulmuş yedek stokların hazırlanması için uygundur. Tek hücreli dondurulmuş stoklardan yeniden ekilen PDO'ların iyileşmesi ve belirli bir boyuta ulaşması için daha uzun bir süre gerektiğini unutmayın.

1. Sindirilmemiş PDO'ların kriyoprezervasyonu.
   1. Adım 2.8'den itibaren pelet ile kriyoprezervasyon işlemine başlayın. Peleti yeniden askıya almak ve kriyojenik bir şişeye aktarmak için 500 μL soğuk dondurma ortamı kullanın.
      NOT: Şişe başına iki kubbe saklayın.
   2. Uygun bir hücre dondurma kabı kullanarak PDO'ları -80 °C'lik bir dondurucuda gece boyunca dondurun.
2. Tek hücreli sindirilmiş PDO'ların kriyoprezervasyonu.
   1. PDO'ları hasat ettikten ve sindirdikten sonra, adım 4.8'den kriyoprezervasyona başlayın.
   2. Bir kriyojenik şişeyi saklamak için, 4-5 x 10 5 hücreyi taze bir^1.5 mL düşük bağlanma tüpüne aktarın.
      NOT: Üç kubbe/şişe saklayın.
   3. 4 °C'de 4 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice atın. Pelet'i rahatsız etmeden süpernatantı mümkün olduğunca çıkarın.
   4. Peleti uygun hacimli bir dondurma ortamında (500 μL / şişe) yeniden askıya alın ve kriyojenik bir şişeye aktarın.
   5. Uygun bir hücre dondurma kabı kullanarak PDO'ları -80 °C'lik bir dondurucuda gece boyunca dondurun ve uzun süreli depolama için -150 °C'lik bir dondurucuya veya sıvı nitrojene aktarın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu protokol, tek hücreli sindirimli ve tek hücreli sindirimsiz EAC PDO'ların alt kültürü ve kriyoprezervasyonunu içeren prosedürleri sunar.

Şekil 1 , iki farklı alt kültür stratejisinin temsili faz-kontrast resimlerini göstermektedir. EAC PDO'lar alt kültürleme için uygun yoğunluğa ulaşmıştır (Şekil 1, sol). Tek hücreli sindirim olmadan alt kültürleme, karşılaştırılabilir yoğunluğa ulaşmak için daha ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokolde EAC PDO'ların iki farklı alt kültür ve kriyoprezervasyon yöntemi, yani tek hücreli sindirimli ve sindirimsiz olarak tanımlanmıştır. Birçok çalışma, EAC PDO'ların tek hücreli sindirim^15,17 ile geçişini önerdi; bu, hücre numarası kontrolü^, tekdüze yoğunluk ve boyut izlemeyi kolaylaştıran içi boş bir yapı gerektiren çoğu deney için faydalıdır. Bununla birlikte, tek hücreli yöntem, dondurulmuş stoklardan yeniden ekim...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
-20°C Freezer	Bosch		Economic
-80°C Freezer	Panasonic		MDF DU500VH-PE
Automated Cell counter	Thermo Fisher	AMQAX1000	Countess II
Biological Safety Cabinet Class II	Thermo Scientific	51022482	Herasafe KS12
Centrifuge	Heraeus	75003060	Megafuge 1.0R
CO2 Incubator	Thermo Scientific	50116048	Heracell 150i
Inverted automated fluorescence microscope	Olympus		IX83
Inverted light microscope	Leica		DMIL LED Fluo
Pipette 1000 µL	Eppendorf	3123000063	Research Plus
Pipette 200 µL	Eppendorf	3123000039	Research Plus
Rotating Incubator	Scientific Industries, sc.	SI-1200	Enviro-genie
Shaker	Eppendorf	5355 000.011	Thermomixer Comfort
Vacuum pump	Vacuubrand	20727200	BVC control
Waterbath	Medingen	p2725	W22
Material
15 mL tube	Sarstedt	62.554.502	Inc Screw cap tube PP 15 mL
Cryo vial 2 mL	Sarstedt	72.379	CryoPure 2.0 mL tube
Low bind tube 1.5 mL	Sarstedt	72.706.600	Micro tube 1.5 mL protein LB
Low bind tube 5 mL	Eppendorf	0030 108.302	Protein LoBind Tube 5.0 mL
Pipette tip 200 µL	Starlab	E1011-8000	200 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Starlab	E1011-9000	1000 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Sarstedt	70.3050	Pipette tip 1000 µL
Sterile filter 0.2 µm	Sarstedt	83.1826.001	Filtropur 0.2 µm sterile filter
Tissue culture plate	Sarstedt	83.3921	12 well-plate
Reagent/Chemical
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
B-27	Thermo Fisher Scientific	17504001
Cell Recovery Solution	Corning	354253
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182/CS-0181
DNase I grade II, from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190094
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231
FGF-10a	Peprotech	100-26-100
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium	Thermo Fisher Scientific	12648010
Gastrin	Sigma	G9020
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL)	PromoCell	C-36030
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
L-Glutamine 200 mM (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030024
N-2	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165
Nicotinamide	Sigma	N0636-100
Noggin	Peprotech	120-10C-50
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells	Biotechne	3710-001-01
SB202190	MedChemExpress	152121-30-7
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich	93620-1G
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Wnt-3A conditioned medium	Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group
Y-27632	Sigma	Y0503