食管腺癌类器官的传代培养和冷冻保存:单细胞消化的利弊

摘要

该协议描述了食管腺癌类器官的传代培养和冷冻保存方法，有和没有单细胞消化，使研究人员能够根据其实验设计选择适当的策略。

摘要

缺乏反映原发病的合适的转化研究模型来探索肿瘤发生和治疗策略是食管腺癌（EAC）的主要障碍。患者来源的类器官（PDO）最近已成为各种癌症中一种非凡的临床前模型。但是，可用于开发 EAC PDO 的协议仍然有限。一旦建立了PDO，繁殖和低温保存对于进一步的下游分析至关重要。在这里，两种不同的方法已经标准化为EAC PDO传代培养和冷冻保存，即有和没有单细胞消化。这两种方法都可以可靠地获得适当的细胞活力，并适用于不同的实验设置。目前的研究表明，用单细胞消化传代培养EAC PDO适用于大多数需要细胞数量控制，均匀密度和有利于尺寸跟踪的空心结构的实验。然而，基于单细胞的方法在培养物中以及在从冷冻库存重新培养后显示出较慢的生长。此外，单细胞消化的传代培养的特点是形成具有空心核心的中空结构。相反，在不进行单细胞消化的情况下处理EAC PDO有利于冷冻保存，扩增和组织学表征。在该协议中，描述了具有和不具有单细胞消化的EAC PDO的传代培养和冷冻保存的优缺点，以使研究人员能够选择适当的方法来处理和研究其类器官。

引言

食管癌 （EC） 是全球第十大常见和第六大癌症死因¹.食管腺癌（EAC）是EC的主要组织学亚型之一，主要发生在西方国家²。近十年来，包括德国在内的许多发达国家的 EAC 发病率显著增加³。由于癌症的侵袭性和肿瘤发展早期缺乏症状，EAC患者的整体预后较差，5年生存率约为20%^2，4，5。

自二十世纪末以来，已经为EAC的生物医学研究建立了几种模型。20世纪90年代建立的经典人类EAC细胞系⁶，扩展了我们对EAC肿瘤生物学，肿瘤遗传学以及抗肿瘤策略的知识，并广泛用于EAC研究。此外，一些研究小组通过手术或炎症方法将动物暴露于已知的风险因素（例如胃食管反流）来成功开发了EAC或Barrett食道的动物模型^7，8，9。此外，开发了患者源性异种移植（PDX）模型，该模型将EAC原发性癌组织皮下或原位植入免疫缺陷小鼠中，以模拟人EAC肿瘤生物学行为和肿瘤环境^10，11，12。然而，尽管这些模型改善了临床应用，并且我们对EAC肿瘤发生和进展背后的分子机制的理解，但将这些研究模型的结果外推到人类仍然存在重大挑战。

患者来源的肿瘤类器官（PDO）在3D培养系统中生长，该系统在体外模仿人类发育和器官再生。PDO由患者的原代组织产生，概括了人类肿瘤的分子和表型特征，并在药物开发和个性化癌症治疗中显示出有希望的应用^13，14。通过比较10例EAC PDO与其配对的肿瘤组织，据报道EAC PDO与原发肿瘤具有相似的组织病理学特征和基因组学景观，保留了肿瘤内的异质性并促进了体外有效的药物筛选¹⁵。EAC PDO还用于研究EAC肿瘤细胞与患者来源的癌症相关成纤维细胞（CAFs）的相互作用，表明在肿瘤微环境研究领域的强大应用¹⁶。不幸的是，可用于开发和传播 EAC PDO 的协议有限。在这里，详细描述了两种不同的传代培养和保存EAC PDO的方法:有和没有单细胞消化。维护EAC PDO及其应用的标准化方法可以支持研究人员在EAC PDO研究中为不同目的选择适当的方法。

研究方案

成熟且生长良好的PDO培养物是该协议中描述的成功传代培养和冷冻保存的基础。在这里，EAC PDO是使用Karakasheva T. A.等人¹⁷描述的方案从EAC患者的原发肿瘤组织中产生的。EAC组织是在BioMaSOTA的批准下从生物库中收集的（由科隆大学伦理委员会批准，ID:13-091）。

注意:EAC PDO已在37°C和5%CO₂的加湿培养箱中使用PDO培养基进行培养（表1）。在以下步骤中，详细介绍了两种传代方法。建议使用12孔板对PDO进行传代培养，每孔的接种密度为三个细胞外基质（ECM）凝胶圆顶，因为它允许灵活地使用每个孔和适当数量的PDO用于不同目的。在处理PDO时，无菌技术是强制性的。

1. 提前准备

1. 在传代培养之前，通过将12孔板放入37°C CO₂培养箱中过夜来预热板，以确保板完全升温。如果可用，使用具有当前PDO培养物的板中的空孔。
   注意:建议在37°C下连续储存1-2个新鲜板，以实现灵活的传代计划。
2. 预冷 1，000 μL 和 200 μL 吸头，在 -20 °C 下使用宽孔口（建议连续储存）。在4°C下预冷离心。
3. 将旋转培养箱的温度设置为37°C（如果进行单细胞消化）。
4. 将适当体积的ECM凝胶在冰上孵育1小时以液化。将细胞回收溶液放在冰上。

2. 采集类器官

1. 从CO₂培养箱中取出带有生长PDO的板。
2. 使用真空泵吸出旧介质。
   注:避免触摸半球罩。
3. 向孔中加入适当体积的冰冷细胞回收溶液（500μL/圆顶）。
4. 通过上下移液几次来分解ECM凝胶，使用具有宽孔的1，000μL吸头将ECM凝胶圆顶破碎成小块。
5. 将PDO，ECM凝胶和细胞回收溶液的混合物从最多两个孔（六个圆顶）中混合，并将其转移到5 mL低结合管中（如果更多的孔用于传代培养，请使用第二个管）。
   注意:或者，如果ECM凝胶未完全溶解，则在PDO，ECM凝胶和细胞回收溶液的混合物中再加入1.5 mL细胞回收溶液。
6. 将步骤2.5中含有混合物的试管在冰上孵育20分钟，通过倒置试管5次每5分钟混合一次，以确保ECM凝胶的液化。
7. 在4°C下以500× g 离心4分钟。
8. 如果离心后有可见且稳定的沉淀，请继续执行步骤2.10。否则，请继续执行步骤 2.9。
9. 如果没有可见的沉淀，并且PDO似乎仍然卡在凝胶相中，请用真空泵小心地除去上清液，直到达到含有ECM凝胶- PDO-溶液的相并加入3mL冰冷的细胞回收溶液。
   1. 将管倒置几次，并在冰上再孵育10分钟。通过不时倒置管子进行混合。
   2. 在4°C下以500× g 离心4分钟，继续步骤2.10。
10. 使用真空泵或1，000μL移液器小心地丢弃上清液。尽量去除上清液。
    注意:由于管的结合面较低，颗粒不会像往常一样稳定。
11. 将PDO沉淀物储存在冰上，并根据不同的目的继续执行步骤3（不消化）或步骤4（单细胞消化）。

3. 不消化的传代培养

注意:此方法旨在增加PDO的大小和密度。更大的尺寸和更高的密度有利于包埋过程，组织学表征和PDO扩增。根据PDO分裂比（基于PDO的密度，建议比例在1:3和1:6之间），将步骤2.8中的沉淀重悬于适当体积的液体ECM凝胶中。

1. 从 -20 °C 冰箱中取出预冷的 200 μL 和 1，000 μL 吸头，并加宽孔口，并将其放在干净的工作台上。
2. 使用预冷的1，000μL吸头将步骤2.11中的沉淀重悬于ECM凝胶中。通过上下移液约10次进行混合，以确保PDO不会结块并且均匀分布在ECM凝胶中。
   注意:使用50μL ECM凝胶/圆顶。始终计算一个圆顶超过所需（例如，对于九个圆顶（即三个孔），将沉淀重悬于500μL液体ECM凝胶（450 + 50μL额外）中。尽量避免在重悬过程中产生气泡！
3. 在播种圆顶之前，从培养箱中取出预热的12孔板。
4. 将含有50μL ECM凝胶的种子圆顶放入温板（三个圆顶/孔）中。避免将气泡移液到ECM凝胶球室中。
5. 将板放回37°C和5%CO₂培养箱中，孵育20-30分钟以固化ECM凝胶。
6. 小心地加入预热的PDO培养基（表1），不要干扰圆顶。
7. 培养PDO7-14天，直到达到所需的密度和形态。

4. 单细胞消化传代培养

注:以下步骤旨在增加每个半球摄像机的 PDO 数量。单细胞消化有助于细胞数量控制和PDO扩增。

1. 通过混合2mL 0.25%胰蛋白酶EDTA和20μL DNase I（用于消化三个圆顶）来制备消化培养基。
2. 将步骤2.11中的沉淀与适当体积的预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA + DNase I重悬，并使用1，000μL移液管上下移液将其混合约10次（使用正常的1，000μL吸头）。
3. 在37°C下在旋转培养箱中孵育10分钟，转速至少为28rpm。
4. 准备含有6mL大豆胰蛋白酶抑制剂（STI， 表2）溶液的15mL管（每2mL0.25%胰蛋白酶- EDTA）。
5. 消化后，用1，000μL移液器将消化的PDO彻底混合几次以破坏PDO。
6. 将消化的PDO转移到含有STI溶液的15mL管中以停止消化过程。
7. 在4°C下以500× g 离心4分钟。 使用真空泵或1，000μL移液器小心地丢弃上清液。将沉淀重悬于1mL基础培养基中（表3）。
8. 使用自动细胞计数器或血细胞计数器确定细胞浓度和活力。
9. 种子将PDO消化到12孔板中，每个圆顶具有2 x 10⁴ 个细胞。
   1. 根据计划用于接种的圆顶计算细胞数量，并将其转移到新鲜的1.5 mL低结合管中。
      注意:计算多一个半球（+ 2 x 10⁴ 个额外的单元格）。例如，要将三个圆顶播种到一个孔中，取8 x 10⁴ （2 x 10⁴ * 3 + 2 x 10⁴ 额外）细胞。
   2. 在4°C下以500× g 离心4分钟。
   3. 如果没有可见的沉淀，请记住离心机内管的方向，以了解沉淀的位置。
   4. 使用1，000μL移液管小心地丢弃上清液。尽可能在不干扰沉淀的情况下除去上清液。
   5. 使用具有预冷的1，000 μL宽孔头（50 μL /圆顶+ 50 μL额外）的1，000 μL移液器向沉淀液中加入适当体积的ECM凝胶。
   6. 按照步骤 3.3-3.7 进行操作。

5. 消化和未消化PDO的冷冻保存

注意:单细胞消化和未消化的PDO适用于制备冷冻备用储备。请注意，从单细胞冷冻储液中重新培养的PDO需要更长的时间才能恢复并达到一定大小。

1. 未消化的PDO的冷冻保存。
   1. 从步骤2.8开始用沉淀开始冷冻保存过程。使用500μL冷冷冻培养基重悬沉淀并将其转移到低温小瓶中。
      注意:每个小瓶存放两个圆顶。
   2. 使用适当的细胞冷冻容器在-80°C冰箱中冷冻PDO过夜。
2. 单细胞消化PDO的冷冻保存
   1. 收获并消化PDO后，从步骤4.8开始冷冻保存。
   2. 要储存一个低温小瓶，将4-5 x 10⁵ 个细胞转移到新鲜的1.5 mL低结合管中。
      注意:存放三个圆顶/小瓶。
   3. 在4°C下以500× g 离心4分钟。 使用1，000μL移液器小心地丢弃上清液。尽可能在不干扰沉淀的情况下除去上清液。
   4. 将沉淀重悬于适当体积的冷冻培养基（500μL /小瓶）中，并将其转移到低温小瓶中。
   5. 使用适当的细胞冷冻容器在-80°C冰箱中冷冻PDO过夜，并将其转移到-150°C冰箱或液氮中长期储存。

结果

该协议介绍了包括具有和不具有单细胞消化的EAC PDO的传代培养和冷冻保存的程序。

图1 显示了两种不同亚文化策略的代表性相差图片。EAC PDO达到适当的传代培养密度（图1，左）。没有单细胞消化的传代培养需要更少的时间即可达到可比的密度，并且主要导致结构紧凑（图1，顶行）。相比之下，单细胞消化?...

讨论

在该协议中，描述了EAC PDO的两种不同的传代培养和冷冻保存方法，即具有和不具有单细胞消化。几项研究建议用单细胞消化^15，17传代EAC PDO，这对于大多数需要细胞数量控制，均匀密度和促进大小跟踪的中空结构的实验是有益的。然而，基于单细胞的方法的特征在于从冷冻储备中重新培养后生长较慢，并且在培养期间形态不太紧凑。经验表明，基于单?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
-20°C Freezer	Bosch		Economic
-80°C Freezer	Panasonic		MDF DU500VH-PE
Automated Cell counter	Thermo Fisher	AMQAX1000	Countess II
Biological Safety Cabinet Class II	Thermo Scientific	51022482	Herasafe KS12
Centrifuge	Heraeus	75003060	Megafuge 1.0R
CO2 Incubator	Thermo Scientific	50116048	Heracell 150i
Inverted automated fluorescence microscope	Olympus		IX83
Inverted light microscope	Leica		DMIL LED Fluo
Pipette 1000 µL	Eppendorf	3123000063	Research Plus
Pipette 200 µL	Eppendorf	3123000039	Research Plus
Rotating Incubator	Scientific Industries, sc.	SI-1200	Enviro-genie
Shaker	Eppendorf	5355 000.011	Thermomixer Comfort
Vacuum pump	Vacuubrand	20727200	BVC control
Waterbath	Medingen	p2725	W22
Material
15 mL tube	Sarstedt	62.554.502	Inc Screw cap tube PP 15 mL
Cryo vial 2 mL	Sarstedt	72.379	CryoPure 2.0 mL tube
Low bind tube 1.5 mL	Sarstedt	72.706.600	Micro tube 1.5 mL protein LB
Low bind tube 5 mL	Eppendorf	0030 108.302	Protein LoBind Tube 5.0 mL
Pipette tip 200 µL	Starlab	E1011-8000	200 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Starlab	E1011-9000	1000 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Sarstedt	70.3050	Pipette tip 1000 µL
Sterile filter 0.2 µm	Sarstedt	83.1826.001	Filtropur 0.2 µm sterile filter
Tissue culture plate	Sarstedt	83.3921	12 well-plate
Reagent/Chemical
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
B-27	Thermo Fisher Scientific	17504001
Cell Recovery Solution	Corning	354253
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182/CS-0181
DNase I grade II, from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190094
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231
FGF-10a	Peprotech	100-26-100
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium	Thermo Fisher Scientific	12648010
Gastrin	Sigma	G9020
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL)	PromoCell	C-36030
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
L-Glutamine 200 mM (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030024
N-2	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165
Nicotinamide	Sigma	N0636-100
Noggin	Peprotech	120-10C-50
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells	Biotechne	3710-001-01
SB202190	MedChemExpress	152121-30-7
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich	93620-1G
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Wnt-3A conditioned medium	Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group
Y-27632	Sigma	Y0503