JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذا البروتوكول ، يتم وصف نموذج التهاب القولون المنقول بالخلية التائية الخاص بمستضد الأمعاء. يتم عزل الخلايا التائية CD4+ من الفئران المعدلة وراثيا CBir1 TCR. هذه خاصة بمستضد ميكروبات الأمعاء المهيمنة على المناعة CBir1 السوط ، والذي يتم نقله إلى الفئران المتلقية Rag1-/- ، مما يؤدي إلى التهاب الأمعاء.

Abstract

مع زيادة معدل الإصابة ، تفرض أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD) ، وهي أمراض مزمنة تؤثر على الجهاز الهضمي ، عبئا صحيا وماليا كبيرا على الأفراد والمجتمع. لذلك ، من الأهمية بمكان التحقيق في الآليات الكامنة وراء التسبب في مرض الأمعاء الالتهابي وتطوره. هنا ، يتم وصف نموذج التهاب القولون نقل الخلايا التائية الخاص بمستضد الميكروبات المعوية. تم التعرف على السوط CBir1 باعتباره المستضد البكتيري المعوي المناعي في التهاب القولون التجريبي والمرضى الذين يعانون من مرض كرون. CBir1 TCR naϊve CD4+ الخلايا التائية المعدلة وراثيا ، الخاصة ب CBir1 السوط ، يمكن أن تحفز التهاب القولون المزمن بعد النقل بالتبني إلى الفئران Rag1-/- التي تعاني من نقص المناعة. يتم تقييم شدة المرض من قبل علم الأنسجة المرضية. كما يتم تحديد الأنماط الظاهرية للخلايا التائية CD4+ في الصفيحة القولونية. يشبه هذا النموذج إلى حد كبير تطور مرض الأمعاء الالتهابي، الذي يوفر نموذجا مثاليا للفئران للتحقيق في الآليات التي تقود التسبب في مرض الأمعاء الالتهابي واختبار الأدوية المحتملة لعلاج مرض الأمعاء الالتهابي.

Introduction

تتميز أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD)، بما في ذلك بشكل رئيسي مرض كرون (CD) والتهاب القولون التقرحي (UC)، بالتهاب مزمن وانتكاسي في الجهاز الهضمي، مما يؤثر على الملايين في جميع أنحاء العالم1. وقد تورطت عدة عوامل في تطور مرض الأمعاء الالتهابي والتسبب فيه، بما في ذلك القابلية الوراثية، وميكروبات الأمعاء، والاستجابات المناعية، والنظام الغذائي، ونمط الحياة2. ومع ذلك ، فإن الآلية الدقيقة ل IBD لا تزال غير مفهومة تماما.

أحد الاهتمامات الخاصة هو التفاعل بين ميكروبات الأمعاء والاستجابات المناعية للمضيف في تنظيم التهاب الأمعاء3. توفر ميكروبات الأمعاء سلسلة من الجزيئات والمستضدات المناعية المحفزة للمناعة، والتي يمكن أن تنشط الاستجابات المناعية4. في حين أن التوازن بين الخلايا التائية المستجيبة والخلايا التائية التنظيمية (Tregs) أمر بالغ الأهمية في الحفاظ على التوازن المعوي ، فإن استجابة الخلايا التائية المخاطية المعوية CD4 + T المفرطة لمستضدات ميكروبات الأمعاء تساهم في التهاب الأمعاء5،6،7. كمستضد ميكروبات الأمعاء المناعية ، ارتبط السوط CBir1 بالتسبب في CD8,9 البشري. وعلاوة على ذلك، فإن نقل الخلايا التائية المعدلة وراثيا CBir1 TCR (Tg) يحفز الالتهاب المعوي في الفئران التي تعاني من نقص المناعة6، وهو ما يشبه إلى حد كبير مرض الأمعاء الالتهابي البشري، مما يشير إلى أن نموذج نقل الخلايا التائية هذا يساعد في التحقيق في آليات مرض الأمعاء الالتهابي البشري.

يصف هذا العمل البروتوكول التفصيلي للحث على التهاب القولون في الفئران Rag1-/- عن طريق النقل المتبني للخلايا التائية CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ وتقييم شدة المرض. إلى جانب ذلك ، يتم عرض النتائج المتوقعة ، ومناقشة الخطوات الحاسمة للإجراء واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، مما سيساعد الباحثين على التحقيق في آليات التسبب في التهاب الأمعاء واختبار الأدوية المحتملة لعلاج مرض الأمعاء الالتهابي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للجنة الفرع الطبي بجامعة تكساس المعنية باستخدام الحيوانات ورعايتها. تم توفير الفئران CBir1 TCR Tg من قبل الدكتور تشارلز إلسون من جامعة ألاباما في برمنغهام. يمكن أن تكون الفئران CBir1 TCR Tg من الإناث أو الذكور ولكن يجب أن تكون في 8-12 أسبوعا. تم الحصول على الفئران Rag1-/- على خلفية C57BL/6 من مختبر جاكسون10. يجب أن تكون الفئران Rag1-/- متطابقة مع الجنس والعمر ، ويمكن استخدام الذكور أو الإناث ولكن يجب أن تكون في 8-12 أسبوعا. يتم تلخيص البروتوكول بأكمله في الشكل 1.

1. إعداد الفئران المتلقية

  1. قم بإعداد الفئران Rag1-/- على خلفية C57BL/6 ، التي يتم تربيتها في نفس المنشأة الحيوانية المحددة الخالية من مسببات الأمراض. احسب عدد الفئران لكل مجموعة حسب تحليل الطاقة11.
    ملاحظة: لا تحتوي الفئران Rag1-/- على خلايا تائية ناضجة وخلايا بائية10.
  2. ضع علامة على الفئران عن طريق لكمة الأذن.
  3. وزن الفئران في نفس اليوم من نقل الخلايا التائية.

2. إعداد الكواشف والحلول

ملاحظة: الكواشف المستخدمة سامة أو خطرة بيولوجيا وتحتاج مناولتها إلى احتياطات وتدابير سلامة.

  1. تحضير الغسيل العازل: أضف 5 مل من 100x البنسلين الستربتومايسين إلى 500 مل من RPMI 1640 متوسط. امزجها جيدا وخزنها على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. تحضير المخزن المؤقت لتحلل Tris-NH4Cl.
    1. تحضير المحلول الجزء A. قم بإذابة 2.06 جم من قاعدة Tris في 100 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) واضبط قيمة الرقم الهيدروجيني على 7.2 باستخدام HCl.
    2. تحضير الحل الجزء B. قم بإذابة 7.47 جم من NH4Cl في 800 مل من ddH2O.
    3. امزج A و B جيدا. قم بقياس الرقم الهيدروجيني واضبطه على 7.2 إن لم يكن كذلك.
    4. اضبط الحجم الإجمالي إلى 1000 مل. الأوتوكلاف ثم تخزينه في 4 درجات مئوية.
  3. قم بإعداد المخزن المؤقت للعزل.
    1. أضف 2.5 جم من BSA و 500 ميكرولتر من EDTA (0.5 M ، الرقم الهيدروجيني 8.0) إلى 500 مل من 1x PBS. امزجها جيدا.
    2. قم بتصفية المحلول من خلال فلتر أعلى زجاجة يمكن التخلص منه بسعة 0.22 ميكرومتر يعمل بالتفريغ (انظر جدول المواد). تخزينها في 4 درجة مئوية.
  4. تحضير المخزن المؤقت FACS. أضف 1 مل من FBS و 50 ميكرولتر من EDTA (0.5 م ، درجة الحموضة 8.0) إلى 50 مل من مخزن الغسيل المؤقت (تم إعداده في الخطوة 2.1). تخلط جيدا وتخزن في 4 درجات مئوية.
  5. إعداد وسيط كامل. أضف 5 مل من FBS في 45 مل من مخزن الغسيل المؤقت. تخلط جيدا وتخزن في 4 درجات مئوية.
  6. إعداد EDTA-PBS المخزن المؤقت.
    1. حساب حجم المخزن المؤقت EDTA-PBS المطلوب. الحجم (مل) = رقم الماوس × 20.
    2. أضف الحجم المناسب من FBS و EDTA و HEPES في PBS (2٪ من FBS ، 0.5 mM من EDTA ، 10 mM من HEPES في PBS) (انظر جدول المواد).
    3. امزجها جيدا وقم بتسخينها مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  7. تحضير المخزن المؤقت للهضم.
    1. احسب حجم مخزن الهضم المؤقت المطلوب. الحجم (مل) = رقم الماوس × 10.
    2. أضف الحجم المناسب من FBS و Collagenase IV و DNase I في مخزن الغسيل المؤقت (2٪ من FBS و 0.5 مجم / مل من Collagenase IV و 10 U / mL من DNase I في Washing Buffer) (انظر جدول المواد).
    3. امزجها جيدا وقم بتسخينها مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  8. إعداد حل بيركول.
    1. تحضير 100٪ بيركول. أضف 5 مل من 10x PBS في 45 مل من Percoll الأصلي (انظر جدول المواد).
    2. قم بإعداد 2٪ FBS في الغسيل المخزن المؤقت. أضف 1 مل من FBS في 49 مل من المخزن المؤقت للغسيل.
    3. قم بسد حجم 40٪ محلول Percoll و 75٪ محلول Percoll. حجم 40٪ Percoll Solution (mL) = رقم الماوس × 4 ؛ حجم 75٪ Percoll Solution (mL) = رقم الماوس × 2.
      ملاحظة: ستستخدم الكواشف/المحاليل المعدة في الخطوات 2-1-2-5 في الخطوات من 3 إلى 4، وستستخدم الكواشف/المحاليل المعدة في الخطوات 2-6-2-8 في الخطوات 9. يجب إعداد جميع الكواشف / المحاليل المستخدمة في الخطوة 9 طازجة. يوصى بعمل مخزن مؤقت إضافي بنسبة 5٪ لجميع الخطوات.

3. عزل الخلايا التائية CBir1 TCR Tg CD4+ الطحالية

  1. القتل الرحيم CBir1 TCR Tg الفأر / الفئران عن طريق خلع عنق الرحم مع القتل الرحيم CO2 (30٪ -70٪ معدل إزاحة الغاز والهواء). رطب الفئران مع 70 ٪ من الإيثانول.
  2. قم بإجراء شق في البطن الأيسر ~ 1 سم ، واسحب الجلد بعيدا عن الأنسجة العضلية البطنية ، وقم بعمل شق ~ 3 سم في أنسجة عضلات البطن ، وقم بإزالة الطحال بمقص وملقط معقم. ضع الطحال في طبق استزراع يحتوي على 5 مل من المخزن المؤقت للغسيل قبل البرودة (يتم إعداده في الخطوة 2.1).
  3. طحن الطحال مع السطح الخشن لاثنين من الشرائح الزجاجية المعقمة. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل عن طريق المرور عبر مصفاة خلية 100 ميكرومتر (انظر جدول المواد). اشطف الشرائح الزجاجية وطبق الثقافة ب 5 مل من المخزن المؤقت للغسيل قبل التبريد وانقل المخزن المؤقت للغسيل إلى الأنبوب.
  4. الطرد المركزي تعليق الخلية في 350 × غرام لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا باستخدام 5 مل من مخزن Tris-NH4Cl Lysis Buffer المخزن المؤقت للتحلل (المحضر في الخطوة 2.2) لكل طحال. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 10 مل من المخزن المؤقت للغسيل قبل التبريد إلى الأنبوب.
  5. الطرد المركزي تعليق الخلية في 350 × غرام لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا باستخدام 10 مل من مخزن العزل العازل قبل البرودة (المعد في الخطوة 2.3).
  6. عد الخلايا. امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا مع 10 ميكرولتر من التربان الأزرق جيدا. قم بتحميل 10 ميكرولتر من الخليط على شريحة ، وأدخل الشريحة في عداد الخلايا الآلي (انظر جدول المواد) واحصل على رقم الخلية القابل للتطبيق 12.
    ملاحظة: يمكن الحصول على ما يقرب من 1 × 108 خلايا من ماوس مانح واحد في هذه الخطوة.
  7. الطرد المركزي لتعليق الخلية المتبقي من الخطوة 3.6 عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من جميع السوبرناتونات.
  8. دوامة الجسيمات المغناطيسية CD4 المضادة للفأر جيدا (انظر جدول المواد) ، إضافة مباشرة 50 ميكرولتر من الجسيمات لكل 107 خلية وتخلط مع كريات الخلايا جيدا. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي مجموعة إثراء أخرى للخلايا التائية CD4+ تجارية هنا.
  9. انقل تعليق الجسيمات الخلوية إلى أنبوب تجميع معقم. أضف 3.5 مل من المخزن المؤقت للعزل قبل التبريد إلى الأنبوب.
  10. ضع الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا (انظر جدول المواد) لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بشفط السوبرناتانت بعناية باستخدام ماصة نقل 3 مل.
  11. قم بإزالة الأنبوب من مغناطيس فصل الخلايا (انظر جدول المواد) ، وأعد تعليق الخلايا باستخدام 3.5 مل من العزل العازل قبل البرد ، وضع الأنبوب على المغناطيس لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بشفط السوبرناتانت بعناية باستخدام ماصة نقل 3 مل.
  12. كرر الخطوة 3.11.
  13. أعد تعليق الخلايا مع 1 مل من مخزن FACS المخزن المؤقت قبل التبريد (تم إعداده في الخطوة 2.4).

4. تنقية CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + الخلايا التائية

  1. حساب الخلايا التالية للخطوة 3.6.
  2. إذا كان تركيز الخلية >107/mL، أضف حجما من المخزن المؤقت FACS للتأكد من أن تركيز الخلية ≤ 107/mL.
    ملاحظة: يمكن الحصول على 1 × 107 خلية من فأر مانح واحد في هذه الخطوة.
  3. قم بتلطيخ علامات السطح ب 10 ميكرولتر من CD4-APC المضاد للماوس ، و 10 ميكرولتر من CD25-Percp / Cy5.5 المضاد للماوس ، و 10 ميكرولتر من CD62L-PE13,14 المضاد للماوس (انظر جدول المواد). تخلط بلطف وتحضن لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام.
  4. اغسل الخلايا ب 2 مل من مخزن FACS المخزن المؤقت قبل التبريد. الطرد المركزي تعليق الخلية في 350 × غرام لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. شفط جميع supernatants باستخدام ماصة نقل 3 مل.
  5. كرر الخطوة 4.4.
  6. أعد تعليق الخلايا إلى تركيز 40 × 106/مل في مخزن FACS المخزن المؤقت قبل التبريد.
    ملاحظة: لمنع الفارز من الانسداد، مرر الخلايا عبر مصفاة 70 ميكرومتر.
  7. أضف 0.1 ميكروغرام/مل من DAPI.
    ملاحظة: يستخدم DAPI لاستبعاد الخلايا الميتة.
  8. قم بإعداد أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل تحتوي على 4 مل من الوسط الكامل (أعدت في الخطوة 2.5) لجمع الخلايا المفروزة.
  9. قم بتحميل الخلايا على جهاز الفرز. فرز خلايا naϊve CD4+ T واحدة قابلة للحياة (DAPI- CD4 + CD25- خلايا CD62L +) في وضع النقاء (حجم الفوهة: 70 ميكرومتر; الضغط: 70 رطل لكل بوصة مربعة. معدل الحدث: 8000-12000 الأحداث / الأحداث. الكفاءة: أعلى من 90٪ (الشكل 2).
    ملاحظة: تعبر الخلايا التائية Naϊve CD4+ عن التعبير العالي عن CD62L وتفتقر إلى علامة التنشيط CD2513,14.
  10. الطرد المركزي تعليق الخلية في 350 × غرام لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بشفط جميع المواد الخارقة باستخدام ماصة نقل 3 مل.
  11. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من 1x PBS.
  12. حساب عدد الخلايا بعد الخطوة 3.6
    ملاحظة: يمكن الحصول على حوالي 5 × 106 خلية من فأر مانح واحد في هذه الخطوة.

5. نقل الخلايا إلى الفئران المتلقية

  1. أعد تعليق خلايا CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T إلى تركيز 5 × 106/مل بإضافة 1x PBS.
  2. قم بتسخين الفئران Rag-/- تحت مصباح حراري (انظر جدول المواد) لمدة 4 دقائق ، وكبح جماح الفئران باستخدام مانع الماوس.
  3. نقل 200 ميكرولتر من تعليق الخلية عن طريق الوريد عن طريق الوريد الخلفي لفئران Rag-/- باستخدام حقنة أنسولين 1 مل (27 جم) (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: الخلايا من فأر مانح واحد كافية للانتقال إلى حوالي خمسة فئران متلقية.

6. مراقبة العلامات السريرية أثناء تطور التهاب القولون

  1. وزن الفئران كل أسبوع وزيادة الملاحظة إلى مرتين في الأسبوع بمجرد أن تبدأ الفئران في فقدان >5٪ من الأوزان الأصلية.
  2. راقب استجابة / تحرك الفئران عند تحفيزها بلطف.
  3. مراقبة التشوهات السريرية الأخرى. أي الموقف واتساق البراز.

7. جمع القولون والنتيجة النسيجية المرضية

  1. التضحية بالفئران المتلقية عن طريق خلع عنق الرحم مع CO2 في نقطة زمنية من فقدان الوزن >20 ٪ من الوزن الأصلي أو 6 أسابيع بعد نقل الخلايا. رطب الفئران مع 70 ٪ من الإيثانول.
  2. قم بإجراء شق جلدي بطني في خط الوسط ~ 1 سم ، واسحب الجلد بعيدا عن الأنسجة العضلية البطنية ، وقم بعمل شق ~ 3 سم في أنسجة عضلات البطن ، وحدد الأعور ، وأزل القولون بأكمله بمقص وملقط معقم. بلل القولون ب PBS قبل البرودة في طبق ثقافي.
  3. شق القولون بالطول وشطفه باستخدام PBS قبل البرودة. قطع 1/3 من القولون طوليا.
  4. ضع شريط القولون في منشفة ورقية مع توجيه الجانب المضيء لأعلى. قم بإجراء التدحرج السويسري باستخدام مسواك15.
  5. ضع القولون السويسري في كاسيت وضع الكاسيت في الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ لمدة 24 h16 ، يليه الجفاف باستخدام معالج آلي (انظر جدول المواد) وتضمين البارافين.
  6. قم بقص 5 ميكرومتر من مقاطع الأنسجة على ميكروتوم ، مثبتة على شرائح ، وقم بإجراء صبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) 17 (انظر جدول المواد).
  7. حدد الدرجات النسيجية المرضية من خلال الجمع بين الدرجات لكل معلمة من المعلمات الستة بحد أقصى 12. التهاب الصفيحة بروبريا (طبيعي ، 0 ؛ خفيف ، 1 ؛ معتدل ، 2 ؛ شديد ، 3) ؛ فقدان الخلايا الكأسية (طبيعي ، 0 ؛ خفيف ، 1 ؛ معتدل ، 2 ؛ شديد ، 3) ؛ سرداب غير طبيعي (عادي ، 0 ؛ فرط البلاستيك ، 1 ؛ عدم التنظيم ، 2 ؛ فقدان السرداب ، 3) ؛ خراجات سرداب (غائبة ، 0 ؛ حاضرة ، 1) ؛ تآكل الغشاء المخاطي وتقرحه (طبيعي ، 0 ؛ خفيف ، 1 ؛ معتدل ، 2 ؛ شديد ، 3) ؛ والتغيير تحت المخاطي (لا شيء ، 0 ؛ تحت الغشاء المخاطي ، 1 ؛ عبر الجدارية ، 2)18.

8. عزل وتلطيخ خلايا الصفيحة المعوية بروبريا

  1. بعد الخطوة 7.3 ، قطع 2/3 آخر من القولون إلى قطع 0.5-1 سم واغسلها باستخدام PBS قبل البرودة.
  2. انقل أجزاء القولون إلى مخزن مؤقت EDTA-PBS مدفأ مسبقا بسعة 20 مل في أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل. احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز 250 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
  3. دوامة الأنبوب ، والتخلص من supernatants عن طريق تمريره من خلال غربال معقم (قطر: 0.01 بوصة) ، وإعادة تعليق شرائح القولون في 20 مل من PBS قبل البرد في أنبوب 50 مل.
  4. كرر الخطوة 8.3 مرتين.
  5. ضع أجزاء القولون في أنبوب C (انظر جدول المواد) يحتوي على 10 مل من المخزن المؤقت للهضم المسخن مسبقا.
  6. ضع الأنبوب على آلة التفكك (انظر جدول المواد) واحتضنه في إطار برنامج "37C_m_LPDK_1" لمدة 25 دقيقة.
    ملاحظة: "37C_m_LPDK_1" هو برنامج قياسي معد مسبقا في آلة التفكك المستخدمة لتحريك العينات وإبقائها عند 37 درجة مئوية.
  7. تحقق مما إذا كان يتم هضم الأنسجة بالكامل ، مما يعني أنه لا توجد قطعة من الأنسجة في مخزن الهضم. إذا لم يكن الأمر كذلك ، كرر برنامج "37C_m_LPDK_1".
  8. جمع supernatant عن طريق المرور من خلال غربال معدني ومصفاة 100 ميكرولتر. شطف مع 10 مل من PBS قبل الباردة.
  9. الطرد المركزي تعليق الخلية في 350 × غرام لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. شفط جميع supernatants.
  10. أعد تعليق الخلايا في 4 مل من محلول Percoll بنسبة 40٪ واخلطها جيدا (أعدت في الخطوة 2.8).
  11. انقل الخلايا المعاد تعليقها إلى 2 مل من محلول Percoll بنسبة 75٪ في أنبوب طرد مركزي 15 مل.
  12. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 850 × g لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية (منحدر التسارع: 0; منحدر الفرامل: 0).
  13. قم بإزالة الدهون بعناية من الطبقة العليا باستخدام ماصة نقل 3 مل ونقل طبقة الخلية إلى 20 مل من الغسيل العازل في أنبوب 50 مل.
  14. الطرد المركزي تعليق الخلية في 350 × غرام لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من جميع المواد الفائقة وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسط المكتمل.
  15. حساب الخلايا التالية للخطوة 3.6.
  16. زرع الخلايا في صفيحة من 24 بئرا ، وتنشيطها مع 50 نانوغرام / مل من Phorbol-12-myristate 13-acetate و 750 نانوغرام / مل من الأيونومايسين لمدة 2 ساعة ، تليها حضانة مع 5 ميكروغرام / مل من Brefeldin A لمدة 3 ساعات (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: الكواشف المستخدمة سامة، وتحتاج مناولتها إلى احتياطات وتدابير سلامة.
  17. انقل الخلايا إلى أنبوب FACS ، وأضف 2 مل من FACS Buffer ، وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
  18. احتضان الخلايا مع 12.5 ميكروغرام / مل من CD16/3219 المضادة للفأر في (انظر جدول المواد) FACS المخزن المؤقت لمنع مستقبلات Fc لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  19. وصمة عار للحية / الميتة وعلامة السطح.
    1. اغسل الخلايا ب 2 مل من FACS Buffer وقم بطردها مركزيا عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
    2. قم بتلطيخ الخلايا بالصبغة الحية وعلامات السطح (أي الأجسام المضادة المضادة CD3 المضادة للفأر والأجسام المضادة CD4 المضادة للفأر)20 (انظر جدول المواد) في FACS Buffer بتركيز محسن لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
      ملاحظة: الكواشف المستخدمة سامة، وتحتاج مناولتها إلى احتياطات وتدابير سلامة.
  20. أداء تلطيخ الخلوية والنووية.
    1. أضف 2 مل من المخزن المؤقت FACS وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
    2. تخلل الخلايا وإصلاحها عن طريق تعليق الخلايا باستخدام 200 ميكرولتر من حل عمل Transcription Factor Fix (انظر جدول المواد) لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. أضف 2 مل من المخزن المؤقت Perm وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
    4. احتضان الخلايا بعلامات خلوية ونووية (أي الأجسام المضادة للفأر IFNγ والأجسام المضادة المضادة للفأر IL-17A والأجسام المضادة المضادة للفأر Foxp3)20 في مخزن بيرم المؤقت (انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة - 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    5. أضف 2 مل من المخزن المؤقت Perm وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
    6. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
  21. أعد تعليق الخلايا التي تحتوي على 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وقم بتشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم عزل ما يقرب من 5 × 106 CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + T الخلايا لكل طحال من ماوس CBir1 TCR Tg البالغ. نقل CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + الخلايا التائية المستحثة التهاب القولون المزمن في الفئران المتلقية Rag1-/- . بعد نقل الخلايا ، تمت مراقبة العلامات السريرية لتقييم تطور التهاب الأمعاء ، بما في ذلك فقد?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

على الرغم من أن كل خطوة ضرورية لتكرار نموذج التهاب القولون هذا ، إلا أن هناك العديد من الخطوات الحاسمة. يجب أن تتلقى الفئران Rag-/- المتلقية خلايا naϊve CD4 + T كافية قابلة للحياة للحث على التهاب الأمعاء. استخدمنا الطحال لعزل الخلايا التائية CD4+ الساذجة بدلا من MLNs. لأن غلة خلا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

لا يوجد مؤلفون لديهم مصالح مالية أو مهنية أو شخصية متضاربة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة DK125011 و AI150210 و DK124132 ، وجائزة جامعة تكساس System STARs (Y.C.) ، وصندوق زمالة James W. McLaughlin من الفرع الطبي لجامعة تكساس في Galveston (W.Y). تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filterMilliporeSigmaSCGPS05RE
100x Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI
100-µm strainerBD Biosciences352360
3-mL Transfer PipetteFisherbrand13-711-9CM
Anti-Mouse CD16/32Biolegend101302
Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5Biolegend102030
Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5Biolegend100327
Anti-Mouse CD4 APCBiolegend100516
Anti-Mouse CD4 Magnetic ParticlesBD Biosciences551539
Anti-Mouse CD4-BV421Biolegend100544
Anti-Mouse CD62L-PEBiolegend104408
Anti-Mouse Foxp3-PEThermoFisher12-5773-82
Anti-Mouse IFNγ-FITCBiolegend505806
Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7Biolegend506922
Automated Cell CounterBio-radTC20
Brefeldin ABD Biosciences555029
BSAFisher BioreagentsBP1600-1
C tubeMiltenyi130-093-237
Cell Separation MagnetBD Biosciences552311
Collagenase IVSigma-AldrichC5138
DAPISigma-AldrichD9542
Dissociator MachineMiltenyi130-096-427
DNase ISigma-Aldrich
EDTACorning46-034-CI
EDTA (0.5 M, PH 8.0)Corning46-034-CI
FBSR&D SystemsS11550
Flow cytometerBD BiosciencesLSD Fortessa
Heat LampCoverShieldBR40
Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain KitAbcamab245880
Insulin SyringesBD Biosciences329412
IonomycinThermoFisherI24222
Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kitThermoFisherL10119
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable ShakersThermoFisherSHKE6000
NH4ClThermo ScientificA687-500
PercollGE Healthcare17-0891-01
Phorbol-12-myristate 13-acetateSigma-AldrichP8139
RPMI 1640 MediumCytiva HyCloneSH3002702
SorterBD BiosciencesArial Fusion
Tissue Automatic ProcessorThermoFisherSTP120
Tissue Embedding/Processing CassetteFisher Healthcare22048142
Tris BaseThermo ScientificBP154-1
True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer)Biolegend424401

References

  1. Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
  2. Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
  3. Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
  4. Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
  5. Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
  6. Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells' differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
  7. Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
  8. Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
  9. Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn's disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
  10. Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
  11. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
  12. Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
  13. Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
  14. Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
  15. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161(2016).
  16. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161(2016).
  17. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  18. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
  19. Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
  20. Yang, W., et al. Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457(2020).
  21. Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
  22. Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn's disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
  23. Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533(2015).
  24. Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
  25. Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F. The gut microbiota in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (10), 599-608 (2012).
  26. Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555(2018).
  27. Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
  28. Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
  29. Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved