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Resumo

Neste protocolo, é descrito um modelo de colite de transferência de células T específica de microbiota intestinal. As células T CD4+ são isoladas de camundongos transgênicos CBir1 TCR. Estes são específicos para um antígeno de microbiota intestinal imunodominante CBir1 flagellin, que é transferido para camundongos Rag1-/- receptores, levando à inflamação intestinal.

Resumo

Com o aumento da incidência, as doenças inflamatórias intestinais (DII), que são doenças crônicas que afetam o trato gastrointestinal, impõem uma considerável carga sanitária e financeira aos indivíduos e à sociedade. Por isso, é fundamental investigar os mecanismos subjacentes à patogênese e ao desenvolvimento do IBD. Aqui, um modelo de colite de transferência de células T específica de microbiota intestinal é descrito. CBir1 flagellin foi reconhecido como o antígeno bacteriano intestinal imunodominante em colite experimental e pacientes com doença de Crohn. As células CD4+ T transgênicas CBir1 T, específicas do CBir1 flagellin, podem induzir colite crônica após transferência adotiva para rag1-/- camundongos deficientes imunológicos. A gravidade da doença é avaliada pela histopatologia. Os fenótipos de células T CD4+ em lavíria lamina colonia também são determinados. Este modelo se assemelha muito ao desenvolvimento do IBD, que fornece um modelo murino ideal para investigar os mecanismos que conduzem a patogênese do IBD e testar os potenciais medicamentos para o tratamento do DII.

Introdução

As doenças inflamatórias intestinais (DII), principalmente incluindo a doença de Crohn (CD) e a colite ulcerativa (UC), são caracterizadas pela inflamação crônica, reencenando-reencenação do trato gastrointestinal, afetando milhões em todo o mundo1. Vários fatores foram implicados no desenvolvimento e na patogênese do DII, incluindo suscetibilidade genética, microbiota intestinal, respostas imunes, dieta e estilo de vida2. No entanto, o mecanismo exato do IBD ainda não é completamente compreendido.

Um dos interesses particulares é a interação entre microbiota intestinal e respostas imunes hospedeiras na regulação da inflamação intestinal3. A microbiota intestinal fornece uma série de moléculas imunoestimulatórias e antígenos, que podem ativar as respostas imunológicas4. Enquanto o equilíbrio entre células T effector e células T regulatórias (Tregs) é fundamental na manutenção da homeostase intestinal, a resposta excessiva das células T mucosas intestinais à microbiota intestinal contribui para inflamação intestinal5,6,7. Como um antígeno de microbiota intestinal imunodominante, cBir1 flagellin tem sido relacionado com a patogênese do CD8,9 humano. Além disso, a transferência de células T transgênicas CBir1 TCR (Tg) induz inflamação intestinal em camundongos imuno-deficientes6, assemelhando-se intimamente ao IBD humano, indicando que este modelo de transferência de células T ajuda a investigar os mecanismos do IBD humano.

Este trabalho descreve o protocolo detalhado de indução de colite em Rag1-/- camundongos por transferência adotiva de células CD4+ T CBir1 Tcr t e avaliação da gravidade da doença. Além disso, os resultados antecipados são mostrados, e são discutidas as etapas críticas do procedimento e solução de problemas, que ajudarão os pesquisadores a investigar os mecanismos da patogênese da inflamação intestinal e testar os potenciais medicamentos para o tratamento do DII.

Protocolo

Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com o Comitê de Uso e Cuidado dos animais da Universidade do Texas Medical Branch. Os ratos CBir1 TCR Tg foram fornecidos pelo Dr. Charles Elson da Universidade do Alabama em Birmingham. Os camundongos CBir1 TCR Tg podem ser fêmeas ou machos, mas devem estar entre 8 e 12 semanas. Os camundongos rag1-/- no fundo C57BL/6 foram obtidos do Laboratório Jackson10. Os camundongos devem ser compatível com sexo e idade, e homens ou mulheres podem ser usados, mas devem ter entre 8 e 12 semanas. Todo o protocolo está resumido na Figura 1.

1. Preparação dos camundongos receptores

  1. Prepare rag1-/- ratos no fundo C57BL/6, criados na mesma instalação animal específica sem patógenos. Calcule o número de ratos por grupo por análise de energia11.
    NOTA: Os camundongos rag1-/- não têm células T maduras e células B10.
  2. Marque os ratos com um soco de orelha.
  3. Pesar os ratos no mesmo dia da transferência de células T.

2. Preparação dos reagentes e soluções

NOTA: Os reagentes utilizados são tóxicos, ou de risco biológico e seu manuseio precisa de precauções e medidas de segurança.

  1. Prepare o tampão de lavagem: adicione 5 mL de penicilina-estreptomicina de 100x em 500 mL de meio RPMI 1640. Misture bem e armazene a 4 °C.
  2. Prepare o tampão de lise tris-NH4Cl.
    1. Prepare a solução Parte A. Dissolva 2,06 g de base Tris em 100 mL de água dupla destilada (ddH2O) e ajuste o valor do pH para 7,2 com HCl.
    2. Prepare a solução Parte B. Dissolva 7,47 g de NH4Cl em 800 mL de ddH2O.
    3. Misture bem A e B. Meça o pH e ajuste-o para 7,2 se não.
    4. Ajuste o volume total para 1000 mL. Autoclave e, em seguida, armazene-o a 4 °C.
  3. Prepare o Tampão de Isolamento.
    1. Adicione 2,5 g de BSA e 500 μL de EDTA (0,5 M, pH 8.0) em 500 mL de 1x PBS. Misture bem.
    2. Filtre a solução através de um filtro de garrafa descartável movido a vácuo de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais). Armazene a 4 °C.
  4. Prepare o buffer FACS. Adicione 1 mL de FBS e 50 μL de EDTA (0,5 M, pH 8.0) em 50 mL de Tampão de Lavagem (preparado na etapa 2.1). Misture bem e armazene a 4 °C.
  5. Prepare o Meio Completo. Adicione 5 mL de FBS em 45 mL de tampão de lavagem. Misture bem e armazene a 4 °C.
  6. Prepare o buffer EDTA-PBS.
    1. Calcule o volume do buffer EDTA-PBS necessário. Volume (mL) = número do mouse x 20.
    2. Adicione volume adequado de FBS, EDTA e HEPES no PBS (2% de FBS, 0,5 mM de EDTA, 10 mM de HEPES na PBS) (ver Tabela de Materiais).
    3. Misture bem e pré-aqueça em um banho de água de 37 °C.
  7. Prepare o buffer de digestão.
    1. Calcule o volume do buffer de digestão necessário. Volume (mL) = número do mouse x 10.
    2. Adicione o volume apropriado de FBS, Collagenase IV e DNase I em Tampão de Lavagem (2% de FBS, 0,5 mg/mL de Colagenase IV e 10 U/mL de DNase I em Tampão de Lavagem) (ver Tabela de Materiais).
    3. Misture bem e pré-aqueça em um banho de água de 37 °C.
  8. Prepare a Solução Percoll.
    1. Prepare-se 100% Percoll. Adicione 5 mL de PBS de 10x em 45 mL de Percoll original (ver Tabela de Materiais).
    2. Prepare 2% de FBS no tampão de lavagem. Adicione 1 mL de FBS em 49 mL de tampão de lavagem.
    3. Caulule o volume de 40 % Solução Percoll e Solução Percoll de 75 %. Volume de Solução Percoll de 40% (mL) = número do mouse x 4; Volume de 75% Solução Percoll (mL) = número do mouse x 2.
      NOTA: Os reagentes/soluções preparados nas etapas 2.1-2.5 serão utilizados nas etapas 3-4, e aqueles preparados nas etapas 2.6-2.8 serão utilizados na etapa 9. Todos os reagentes/soluções utilizados na etapa 9 devem ser preparados recentemente. A fabricação de 5 % de buffer extra é recomendada para todas as etapas.

3. Isolamento das células CBir1 TCR Tg CD4+

  1. Eutanize O rato/camundongos TCR TCR de eutanize CBir1 por uma luxação cervical com eutanásia de CO2 (taxa de deslocamento gaso-ar de 30%-70%). Molhe os ratos com 70% de etanol.
  2. Realize uma incisão do abdômen esquerdo de ~1 cm, puxe a pele para longe do tecido muscular abdominal, faça uma incisão de ~3 cm no tecido muscular abdominal e remova o baço com tesouras estéreis e fórceps. Coloque o baço em um prato de cultura contendo 5 mL de tampão de lavagem pré-frio (preparado na etapa 2.1).
  3. Triture o baço com a superfície áspera de duas lâminas de vidro estéreis. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 50 mL passando por um coador de células de 100 μm (ver Tabela de Materiais). Enxágüe os slides de vidro e o prato de cultura com 5 mL de tampão de lavagem pré-frio e transfira o tampão de lavagem para o tubo.
  4. Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernascer e resuspenque as células com 5 mL de tampão de lyse tris-nh4Cl pré-aquecido (preparado na etapa 2.2) por baço. Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. Adicione 10 mL de tampão de lavagem pré-frio ao tubo.
  5. Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernatante e resuspenque as células com 10 mL de tampão de isolamento pré-frio (preparado na etapa 2.3).
  6. Conte as células. Misture 10 μL de suspensão celular com 10 μL de azul trypan completamente. Carregue 10 μL da mistura em um slide, insira o slide no Contador automatizado de células (ver Tabela de Materiais) e obtenha o número de célula viável12.
    NOTA: Aproximadamente 1 x 108 células podem ser obtidas de um rato doador nesta etapa.
  7. Centrifugar a suspensão celular restante da etapa 3.6 a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte todos os supernantes.
  8. Vórtice as partículas magnéticas CD4 anti-mouse cuidadosamente (ver Tabela de Materiais), adicione diretamente 50 μL das partículas por 107 células e misture-se completamente com pelotas celulares. Incubar por 30 min a 4 °C.
    NOTA: Qualquer outro kit comercial de enriquecimento celular CD4+ T pode ser usado aqui.
  9. Transfira a suspensão da célula-partícula para um tubo de coleta estéril. Adicione 3,5 mL de tampão de isolamento pré-frio no tubo.
  10. Coloque o tubo no ímã de separação celular (ver Tabela de Materiais) por 8 minutos em temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente o supernaste usando uma Pipeta de transferência de 3 mL.
  11. Remova o tubo do ímã de separação celular (ver Tabela de Materiais), resuspense as células com 3,5 mL de tampão de isolamento pré-frio e coloque o tubo no Ímã por 4 minutos em temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente o supernaste usando uma Pipeta de transferência de 3 mL.
  12. Repita o passo 3.11.
  13. Resuspende as células com 1 mL de tampão FACS pré-frio (preparado na etapa 2.4).

4. Purificação de células CBir1 TCR Tg naic4+ T

  1. Conte as células seguindo o passo 3.6.
  2. Se a concentração celular estiver >107/mL, adicione um volume de tampão FACS para garantir que a concentração celular esteja ≤ 107/mL.
    NOTA: ~1 × 107 células podem ser obtidas de um rato doador nesta etapa.
  3. Colorigue os marcadores de superfície com 10 μL de CD4-APC anti-mouse, 10 μL de CD25-Percp/Cy5.5 anti-mouse e 10 μL de anti-mouse CD62L-PE13,14 (ver Tabela de Materiais). Misture delicadamente e incubar por 30 min a 4 °C no escuro.
  4. Lave as células com 2 mL de tampão FACS pré-frio. Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Aspire todas as supernatantsusing uma Pipette de transferência de 3 mL.
  5. Repita o passo 4.4.
  6. Resuspende as células à concentração de 40 x 106/mL no buffer FACS pré-frio.
    NOTA: Para evitar que o classificador entupisse, passe as células através de um filtro de 70 μm.
  7. Adicione 0,1 μg/mL de DAPI.
    NOTA: O DAPI é usado para excluir as células mortas.
  8. Prepare tubos de centrífugas de 15 mL contendo 4 mL de Meio Completo (preparado na etapa 2.5) para coleta das células classificadas.
  9. Coloque as células no classificador. Classificar células CD4+ T únicas viáveis (células DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ ) no modo de pureza (tamanho do bocal: 70 μm; Pressão: 70 PSI; Taxa de eventos: 8000-12000 eventos/s; Eficiência: superior a 90%) (Figura 2).
    NOTA: As células Narsve CD4+ T expressam alta expressão do CD62L e não possuem o marcador de ativação CD2513,14.
  10. Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Aspire todos os supernantes usando uma Pipeta de transferência de 3 mL.
  11. Resuspend as células em 500 μL de 1x PBS.
  12. Contar células seguindo a etapa 3.6
    NOTA: ~5 × 106 células podem ser obtidas de um rato doador nesta etapa.

5. Transferência celular para os camundongos receptores

  1. Resuspende as células CBir1 TCR Tg nars cd4+ T à concentração de 5 x 106/mL adicionando 1x PBS.
  2. Aqueça os ratos rag-/- sob uma lâmpada de calor (ver Tabela de Materiais) por 4 minutos, e contenha os ratos usando um conterrante de rato.
  3. Transfira por via intravenosa 200 μL da suspensão celular para a veia traseira de rag-/- camundongos usando uma seringa de insulina de 1 mL (27 G) (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Células de um rato doador são suficientes para transferir para cerca de cinco ratos receptores.

6. Monitoramento de sinais clínicos durante a progressão da colite

  1. Pesar os camundongos toda semana e aumentar a observação para duas vezes por semana, uma vez que os ratos começam a perder >5% dos pesos originais.
  2. Observe a resposta/movimento dos camundongos quando suavemente estimulado.
  3. Observe outras anormalidades clínicas. ou seja, postura e consistência nas fezes.

7. Coleção de cólons e pontuação histopatológica

  1. Sacrifique os camundongos receptores por uma luxação cervical com CO2 em um ponto de tempo da perda de peso >20% do peso original ou 6 semanas de transferência pós-célula. Molhe os ratos com 70% de etanol.
  2. Realizar uma incisão de pele de linha média ventral de ~1 cm, puxar a pele para longe do tecido muscular abdominal, fazer uma incisão de ~3 cm no tecido muscular abdominal, identificar o ceco e remover todo o cólon com tesouras e fórceps estéreis. Molhe o cólon com PBS pré-frio em um prato de cultura.
  3. Incise o cólon longitudinalmente e enxágue-o com PBS pré-frio. Corte 1/3 do cólon longitudinalmente.
  4. Coloque a tira do cólon em uma toalha de papel com o lado luminal voltado para cima. Execute a rolagem suíça usando um palito15.
  5. Coloque o cólon suíço em um e coloque o em formalina 10% tamponada por 24 h16, seguido de desidratação usando um processador automatizado (ver Tabela de Materiais) e incorporação de parafina.
  6. Corte seções de tecido de 5 μm em um microtome, montado em lâminas, e realize a mancha de Hemaoxilina e eosina (H&E)17 (ver Tabela de Materiais).
  7. Determine os escores histopatológicos combinando os escores para cada um dos seis parâmetros para um máximo de 12. Inflamação da lavíria (normal, 0; leve, 1; moderada, 2; grave, 3); perda de célula de cálice (normal, 0; leve, 1; moderada, 2; grave, 3); cripta anormal (normal, 0; hiperplástica, 1; desorganização, 2; perda de cripta, 3); abscesso cripta (ausente, 0; presente, 1); erosão mucosa e ulceração (normal, 0; leve, 1; moderada, 2; grave, 3); e mudança submucosal (nenhum, 0; submucosa, 1; transmural, 2)18.

8. Isolamento e coloração de células de lamina propria intestinal

  1. Após a etapa 7.3, corte mais 2/3 do cólon em pedaços de 0,5-1 cm e lave-o com PBS pré-frio.
  2. Transfira os segmentos de cólon para um buffer EDTA-PBS pré-aquecido de 20 mL em um tubo de centrífuga de 50 mL. Incubar a 37 °C com 250 rpm tremendo por 30 min.
  3. Vórtice do tubo, descarte os supernantes passando-o através de uma peneira estéril (diâmetro: 0,01 polegadas), e resuspenque os segmentos de cólon em 20 mL de PBS pré-frio no tubo de 50 mL.
  4. Repita o passo 8.3 duas vezes.
  5. Coloque os segmentos de cólon em um tubo C (ver Tabela de Materiais) contendo 10 mL de buffer de digestão pré-aquecido.
  6. Coloque o tubo em uma máquina dissociadora (ver Tabela de Materiais) e incubar sob o programa de "37C_m_LPDK_1" por 25 min.
    NOTA: "37C_m_LPDK_1" é um programa de pré-definido padrão na máquina dissociadora usada para agitar as amostras e mantê-las a 37 °C.
  7. Verifique se o tecido é digerido completamente, o que significa que nenhum pedaço de tecido está no tampão de digestão. Se não, repita o programa de "37C_m_LPDK_1".
  8. Colete o supernatante passando por uma peneira metálica e um coador de 100 μL. Enxágüe com 10 mL de PBS pré-frio.
  9. Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Aspire todos os supernantes.
  10. Resuspense as células em 4 mL de solução percoll de 40% e misture-a completamente (preparada na etapa 2.8).
  11. Transfira as células resuspended para 2 mL de solução percoll de 75% em um tubo de centrífuga de 15 mL.
  12. Centrifugar a suspensão da célula a 850 x g por 20 min a 20 °C (Rampa de aceleração: 0; Rampa de freio: 0).
  13. Remova cuidadosamente a gordura na camada superior usando uma Pipeta de transferência de 3 mL e transfira a camada celular para 20 mL de tampão de lavagem em um tubo de 50 mL.
  14. Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte todos os supernacantes e células resuspend em 1 mL de Meio Concluído.
  15. Conte as células seguindo o passo 3.6.
  16. Semente as células em uma placa de 24 poços, ative-as com 50 ng/mL de Phorbol-12-myristate 13-acetato e 750 ng/mL de ionomicina por 2h, seguida de incubação com 5 μg/mL de Brefeldin A por 3 h (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Os reagentes utilizados são tóxicos, e seu manuseio precisa de precauções e medidas de segurança.
  17. Transfira as células para um tubo FACS, adicione 2 mL de tampão FACS e centrifugar as células a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
  18. Incubar as células com 12,5 μg/mL de CD16/3219 anti-rato (ver Tabela de Materiais) tampão FACS para bloquear receptores Fc por 5 minutos à temperatura ambiente.
  19. Mancha para marcador vivo/morto e superfície.
    1. Lave as células com 2 mL de Tampão FACS e centrífugue-as a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
    2. Colorir as células com corante vivo e marcadores de superfície (ou seja, anticorpos CD3 anti-mouse e anticorpos CD4 anti-mouse)20 (ver Tabela de Materiais) em Tampão FACS na concentração otimizada por 30 min a 4 °C no escuro.
      NOTA: Os reagentes utilizados são tóxicos, e seu manuseio precisa de precauções e medidas de segurança.
  20. Faça a coloração celular e nuclear.
    1. Adicione 2 mL de tampão FACS e centrifule a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
    2. Permeabilize e fixe as células reutilizando as células com 200 μL de solução de trabalho de correção de fator de transcrição (ver Tabela de Materiais) por 40 minutos à temperatura ambiente.
    3. Adicione 2 mL de tampão perm e centrifule a suspensão celular a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
    4. Incubar as células com marcadores celulares e nucleares (ou seja, anti-rato IFNγ, anticorpos anti-mouse IL-17A e anti-mouse Foxp3)20 em tampão perm (ver Tabela de Materiais) por 30 min-1 h em temperatura ambiente.
    5. Adicione 2 mL de tampão perm e centrifule a suspensão celular a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
    6. Adicione 1 mL de tampão FACS e centrifule a suspensão da célula a 350 x g por 8 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
  21. Resuspend células com 200 μL de Tampão FACS e executar as amostras em um citômetro de fluxo (ver Tabela de Materiais).

Resultados

Aproximadamente 5 x 106 CBir1 TCR Tg na camiseta CD4+ células T por baço foram isoladas de um rato CBir1 TCR Tg adulto. Transferência de células CBir1 TCR Tg naic4+ T induzidas colite crônica em rag1-/- camundongos receptores. Após a transferência celular, foram monitorados sinais clínicos para avaliar a progressão da inflamação intestinal, incluindo perda de peso, consistência das fezes e postura curvada. Como esperado, os camundongos começaram a perder p...

Discussão

Embora cada passo seja essencial para a reprodutibilidade desse modelo de colite, existem várias etapas críticas. Os camundongos rag-/- receptores devem receber células INV4+ inválidas adequadas para induzir inflamação intestinal. Usamos baços para o isolamento de células T CD4+ ingênuas em vez de MLNs. Porque o rendimento de células T CD4+ ingênuas em MLNs é muito menor do que em baços. CD62L é altamente expresso em células T ingênuas, e CD44 e CD25 s?...

Divulgações

Nenhum autor tem interesses financeiros, profissionais ou pessoais conflitantes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte pelos subsídios do National Institutes of Health DK125011, AI150210 e DK124132, o prêmio STARs do Sistema da Universidade do Texas (Y.C.), e o James W. McLaughlin Fellowship Fund da University of Texas Medical Branch em Galveston (W.Y.). A Figura 1 foi criada com BioRender.com.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filterMilliporeSigmaSCGPS05RE
100x Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI
100-µm strainerBD Biosciences352360
3-mL Transfer PipetteFisherbrand13-711-9CM
Anti-Mouse CD16/32Biolegend101302
Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5Biolegend102030
Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5Biolegend100327
Anti-Mouse CD4 APCBiolegend100516
Anti-Mouse CD4 Magnetic ParticlesBD Biosciences551539
Anti-Mouse CD4-BV421Biolegend100544
Anti-Mouse CD62L-PEBiolegend104408
Anti-Mouse Foxp3-PEThermoFisher12-5773-82
Anti-Mouse IFNγ-FITCBiolegend505806
Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7Biolegend506922
Automated Cell CounterBio-radTC20
Brefeldin ABD Biosciences555029
BSAFisher BioreagentsBP1600-1
C tubeMiltenyi130-093-237
Cell Separation MagnetBD Biosciences552311
Collagenase IVSigma-AldrichC5138
DAPISigma-AldrichD9542
Dissociator MachineMiltenyi130-096-427
DNase ISigma-Aldrich
EDTACorning46-034-CI
EDTA (0.5 M, PH 8.0)Corning46-034-CI
FBSR&D SystemsS11550
Flow cytometerBD BiosciencesLSD Fortessa
Heat LampCoverShieldBR40
Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain KitAbcamab245880
Insulin SyringesBD Biosciences329412
IonomycinThermoFisherI24222
Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kitThermoFisherL10119
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable ShakersThermoFisherSHKE6000
NH4ClThermo ScientificA687-500
PercollGE Healthcare17-0891-01
Phorbol-12-myristate 13-acetateSigma-AldrichP8139
RPMI 1640 MediumCytiva HyCloneSH3002702
SorterBD BiosciencesArial Fusion
Tissue Automatic ProcessorThermoFisherSTP120
Tissue Embedding/Processing CassetteFisher Healthcare22048142
Tris BaseThermo ScientificBP154-1
True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer)Biolegend424401

Referências

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