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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo protocollo, viene descritto un modello di colite di trasferimento adottivo delle cellule T antigene-antigene specifico per l'intestino. Le cellule T CD4+ sono isolate da topi transgenici CBir1 TCR. Questi sono specifici per un antigene del microbiota intestinale immunodominante CBir1 flagellina, che viene trasferito nei topi Rag1-/- riceventi, portando all'infiammazione intestinale.

Abstract

Con l'aumento dell'incidenza, le malattie infiammatorie intestinali (IBD), che sono malattie croniche che colpiscono il tratto gastrointestinale, impongono un notevole onere sanitario e finanziario agli individui e alla società. Pertanto, è fondamentale studiare i meccanismi alla base della patogenesi e dello sviluppo dell'IBD. Qui, viene descritto un modello di colite da trasferimento delle cellule T antigene-antigene specifico del microbiota intestinale. La flagellina CBir1 è stata riconosciuta come l'antigene batterico intestinale immunodominante nella colite sperimentale e nei pazienti con malattia di Crohn. Le cellule T CBir1 TCR transgeniche naϊve CD4+ , specifiche per la flagellina CBir1, possono indurre la colite cronica dopo il trasferimento adottivo in topi Rag1-/- immunodeficienti. La gravità della malattia è valutata dall'istopatologia. Vengono anche determinati i fenotipi delle cellule T CD4+ nella lamina propria del colon. Questo modello assomiglia molto allo sviluppo dell'IBD, che fornisce un modello murino ideale per studiare i meccanismi che guidano la patogenesi dell'IBD e testare i potenziali farmaci per il trattamento dell'IBD.

Introduzione

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD), tra cui principalmente il morbo di Crohn (CD) e la colite ulcerosa (UC), sono caratterizzate da infiammazione cronica, recidivante-remittente del tratto gastrointestinale, che colpisce milioni di persone in tutto il mondo1. Diversi fattori sono stati implicati nello sviluppo e nella patogenesi dell'IBD, tra cui la suscettibilità genetica, il microbiota intestinale, le risposte immunitarie, la dieta e lo stile di vita2. Tuttavia, l'esatto meccanismo di IBD non è ancora completamente compreso.

Uno degli interessi particolari è l'interazione tra il microbiota intestinale e le risposte immunitarie dell'ospite nella regolazione dell'infiammazione intestinale3. Il microbiota intestinale fornisce una serie di molecole e antigeni immunostimolatori, che possono attivare le risposte immunitarie4. Mentre l'equilibrio tra cellule T effettrici e cellule T regolatorie (Tregs) è fondamentale per mantenere l'omeostasi intestinale, l'eccessiva risposta delle cellule T CD4+ della mucosa intestinale agli antigeni del microbiota intestinale contribuisce all'infiammazione intestinale5,6,7. Come antigene immunodominante del microbiota intestinale, la flagellina CBir1 è stata correlata alla patogenesi della CD8,9 umana. Inoltre, il trasferimento di cellule T transgeniche CBir1 TCR (Tg) induce infiammazione intestinale in topi immunodeficienti6, molto simile all'IBD umano, indicando che questo modello di trasferimento delle cellule T aiuta a studiare i meccanismi dell'IBD umano.

Questo lavoro descrive il protocollo dettagliato di indurre la colite nei topi Rag1-/- mediante trasferimento adottivo di cellule TN CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ e valutare la gravità della malattia. Inoltre, vengono mostrati i risultati attesi e vengono discussi i passaggi critici della procedura e la risoluzione dei problemi, che aiuteranno i ricercatori a studiare i meccanismi di patogenesi dell'infiammazione intestinale e testare i potenziali farmaci per il trattamento dell'IBD.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo il Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università del Texas Medical Branch. I topi CBir1 TCR Tg sono stati forniti dal Dr. Charles Elson dell'Università dell'Alabama a Birmingham. I topi CBir1 TCR Tg possono essere femmine o maschi, ma dovrebbero essere a 8-12 settimane. I topi Rag1-/- sullo sfondo C57BL/6 sono stati ottenuti dal Jackson Laboratory10. I topi Rag1-/- devono essere abbinati al sesso e all'età, e possono essere usati maschi o femmine, ma dovrebbero essere a 8-12 settimane. L'intero protocollo è riassunto nella Figura 1.

1. Preparazione dei topi riceventi

  1. Preparare topi Rag1-/- sullo sfondo C57BL/6, allevati nella stessa specifica struttura animale priva di agenti patogeni. Calcolare il numero di topi per gruppo mediante l'analisi di potenza11.
    NOTA: i topi Rag1-/- non hanno cellule T mature e cellule B10.
  2. Segna i topi con un pugno all'orecchio.
  3. Pesare i topi lo stesso giorno del trasferimento delle cellule T.

2. Preparazione dei reagenti e delle soluzioni

NOTA: I reagenti utilizzati sono tossici o a rischio biologico e la loro manipolazione richiede precauzioni e misure di sicurezza.

  1. Preparare il tampone di lavaggio: aggiungere 5 ml di penicillina-streptomicina 100x in 500 ml di rpmI 1640 medio. Mescolare accuratamente e conservare a 4 °C.
  2. Preparare il tampone di lisi Tris-NH4Cl.
    1. Preparare la soluzione Parte A. Sciogliere 2,06 g di base di Tris in 100 mL di acqua a doppia distillazione (ddH2O) e regolare il valore del pH a 7,2 con HCl.
    2. Preparare la soluzione Parte B. Sciogliere 7,47 g di NH4Cl in 800 mL di ddH2O.
    3. Mescolare accuratamente A e B. Misurare il pH e regolarlo a 7,2 in caso contrario.
    4. Regolare il volume totale a 1000 ml. Autoclave e poi conservare a 4 °C.
  3. Preparare il buffer di isolamento.
    1. Aggiungere 2,5 g di BSA e 500 μL di EDTA (0,5 M, pH 8,0) in 500 mL di 1x PBS. Mescolare accuratamente.
    2. Filtrare la soluzione attraverso un filtro monouso per bottiglie da 0,22 μm sottovuoto (vedere Tabella dei materiali). Conservare a 4 °C.
  4. Preparare il buffer FACS. Aggiungere 1 mL di FBS e 50 μL di EDTA (0,5 M, pH 8,0) in 50 mL di tampone di lavaggio (preparato al punto 2.1). Mescolare accuratamente e conservare a 4 °C.
  5. Preparare il mezzo completo. Aggiungere 5 ml di FBS in 45 ml di tampone di lavaggio. Mescolare accuratamente e conservare a 4 °C.
  6. Preparare il buffer EDTA-PBS.
    1. Calcolare il volume del buffer EDTA-PBS necessario. Volume (mL) = numero del mouse x 20.
    2. Aggiungere il volume appropriato di FBS, EDTA e HEPES nel PBS (2% di FBS, 0,5 mM di EDTA, 10 mM di HEPES in PBS) (vedere Tabella dei materiali).
    3. Mescolare accuratamente e preriscaldare a bagnomaria a 37 °C.
  7. Preparare il buffer di digestione.
    1. Calcolare il volume del buffer di digestione necessario. Volume (mL) = numero del mouse x 10.
    2. Aggiungere il volume appropriato di FBS, collagenasi IV e DNasi I nel tampone di lavaggio (2% di FBS, 0,5 mg / mL di collagenasi IV e 10 U / mL di DNasi I nel tampone di lavaggio) (vedere Tabella dei materiali).
    3. Mescolare accuratamente e preriscaldare a bagnomaria a 37 °C.
  8. Preparare la soluzione Percoll.
    1. Prepara 100% Percoll. Aggiungere 5 ml di PBS 10x in 45 mL di Percoll originale (vedere Tabella dei materiali).
    2. Preparare il 2% di FBS nel tampone di lavaggio. Aggiungere 1 mL di FBS in 49 mL di tampone di lavaggio.
    3. Caulculare il volume del 40 % della soluzione di Percoll e del 75 % della soluzione di Percoll. Volume della soluzione di Percoll al 40% (mL) = numero del mouse x 4; Volume della soluzione di Percoll al 75% (mL) = numero del mouse x 2.
      NOTA: i reagenti/soluzioni preparati nei passaggi 2.1-2.5 saranno utilizzati nei passaggi 3-4 e quelli preparati nei passaggi 2.6-2.8 saranno utilizzati nel passaggio 9. Tutti i reagenti/soluzioni utilizzati nella fase 9 devono essere preparati al momento. Si consiglia di aggiungere il 5% di buffer in più per tutti i passaggi.

3. Isolamento delle cellule T spleniche CBir1 TCR Tg CD4+

  1. Eutanasia CBir1 TCR Tg topo/topi da una lussazione cervicale con eutanasia CO2 (tasso di spostamento gas-aria del 30%-70%). Bagnare i topi con il 70% di etanolo.
  2. Eseguire un'incisione dell'addome sinistro di ~ 1 cm, allontanare la pelle dal tessuto muscolare addominale, praticare un'incisione di ~ 3 cm nel tessuto muscolare addominale e rimuovere la milza con forbici e pinze sterili. Introdurre la milza in un piatto di coltura contenente 5 ml di tampone di lavaggio pre-freddo (preparato al punto 2.1).
  3. Macinare la milza con la superficie ruvida di due vetrini sterili. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 50 mL passando attraverso un filtro cellulare da 100 μm (vedere Tabella dei materiali). Risciacquare i vetrini e il piatto di coltura con 5 ml di tampone di lavaggio pre-freddo e trasferire il tampone di lavaggio nel tubo.
  4. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 min a 4 °C. Scartare il surnatante e risospesciare le cellule con 5 mL di tampone di lisi Tris-NH4Cl preriscaldato (preparato nel passaggio 2.2) per milza. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio pre-freddo al tubo.
  5. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 min a 4 °C. Scartare il surnatante e risospese le cellule con 10 mL di tampone di isolamento pre-freddo (preparato nella fase 2.3).
  6. Contare le celle. Mescolare accuratamente 10 μL di sospensione cellulare con 10 μL di tripano blu. Caricare 10 μL della miscela su un vetrino, inserire il vetrino nel contatore automatico di celle (vedere Tabella dei materiali) e ottenere il numero di cella vitale12.
    NOTA: Circa 1 x 108 cellule possono essere ottenute da un topo donatore in questo passaggio.
  7. Centrifugare la restante sospensione cellulare dal punto 3.6 a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Scartare tutti i supernatanti.
  8. Ruotare accuratamente le particelle magnetiche CD4 anti-mouse (vedere Tabella dei materiali), aggiungere direttamente 50 μL delle particelle per 107 celle e mescolare accuratamente con i pellet di cellule. Incubare per 30 minuti a 4 °C.
    NOTA: qualsiasi altro kit commerciale di arricchimento delle cellule T CD4 + può essere utilizzato qui.
  9. Trasferire la sospensione di particelle cellulari in un tubo di raccolta sterile. Aggiungere 3,5 mL di tampone di isolamento pre-freddo nel tubo.
  10. Posizionare il tubo sul magnete di separazione cellulare (vedere Tabella dei materiali) per 8 minuti a temperatura ambiente. Aspirare accuratamente il surnatante utilizzando una pipetta di trasferimento da 3 ml.
  11. Rimuovere il tubo dal magnete di separazione cellulare (vedere Tabella dei materiali), risospesare le celle con un tampone di isolamento pre-freddo da 3,5 mL e posizionare il tubo sul magnete per 4 minuti a temperatura ambiente. Aspirare accuratamente il surnatante utilizzando una pipetta di trasferimento da 3 ml.
  12. Ripetere il passaggio 3.11.
  13. Risospendare le celle con 1 mL di tampone FACS pre-freddo (preparato nel passaggio 2.4).

4. Purificazione delle cellule TN CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T

  1. Contare le celle dopo il passaggio 3.6.
  2. Se la concentrazione cellulare è >107/mL, aggiungere un volume di tampone FACS per assicurarsi che la concentrazione cellulare sia ≤ 107/mL.
    NOTA: ~1 × 107 cellule possono essere ottenute da un topo donatore in questo passaggio.
  3. Macchiare i marcatori superficiali con 10 μL di CD4-APC anti-mouse, 10 μL di CD25-Percp/Cy5.5 anti-mouse e 10 μL di CD62L-PE13,14 anti-mouse (vedere Tabella dei materiali). Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a 4 °C al buio.
  4. Lavare le celle con 2 ml di tampone FACS pre-freddo. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 min a 4 °C. Aspirare tutti i supernatanti utilizzando una pipetta di trasferimento da 3 ml.
  5. Ripetere il passaggio 4.4.
  6. Risospesere le cellule alla concentrazione di 40 x 106/mL nel tampone FACS pre-freddo.
    NOTA: per evitare che la selezionatrice si intasi, far passare le cellule attraverso un filtro da 70 μm.
  7. Aggiungere 0,1 μg/mL di DAPI.
    NOTA: DAPI viene utilizzato per escludere le cellule morte.
  8. Preparare tubi centrifughi da 15 mL contenenti 4 mL di Complete Medium (preparati al punto 2.5) per la raccolta delle celle selezionate.
  9. Caricare le celle sullo smistatore. Ordinare le singole celle T NAΪve CD4+ (cellule DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ ) in modalità purezza (Dimensione ugello: 70 μm; Pressione: 70 PSI; Frequenza eventi: 8000-12000 eventi/s; Efficienza: superiore al 90%) (Figura 2).
    NOTA: Le cellule T Naϊve CD4+ esprimono un'alta espressione di CD62L e mancano del marcatore di attivazione CD2513,14.
  10. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 min a 4 °C. Aspirare tutti i supernatanti utilizzando una pipetta di trasferimento da 3 ml.
  11. Risospese le cellule in 500 μL di 1x PBS.
  12. Contare le celle dopo il passaggio 3.6
    NOTA: ~5 × 106 cellule possono essere ottenute da un topo donatore in questo passaggio.

5. Trasferimento cellulare nei topi riceventi

  1. Risospesso le cellule T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ alla concentrazione 5 x 106/mL aggiungendo 1x PBS.
  2. Riscaldare i topi Rag-/- sotto una lampada di calore (vedi Tabella dei materiali) per 4 minuti e trattenere i topi usando un dispositivo di ritenuta per mouse.
  3. Trasferire per via endovenosa 200 μL della sospensione cellulare nella vena della coda dei topi Rag-/- utilizzando una siringa da insulina da 1 mL (27 G) (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: le cellule di un topo donatore sono sufficienti per trasferirsi a circa cinque topi riceventi.

6. Monitoraggio dei segni clinici durante la progressione della colite

  1. Pesare i topi ogni settimana e aumentare l'osservazione a due volte a settimana una volta che i topi iniziano a perdere >5% dei pesi originali.
  2. Osservare la risposta / movimento dei topi quando stimolati delicatamente.
  3. Osservare altre anomalie cliniche. cioè, postura e consistenza delle feci.

7. Raccolta del colon e punteggio istopatologico

  1. Sacrificare i topi riceventi da una lussazione cervicale con CO2 in un punto temporale della perdita di peso >20% del peso originale o 6 settimane dopo il trasferimento cellulare. Bagnare i topi con il 70% di etanolo.
  2. Eseguire un'incisione cutanea ventrale della linea mediana di ~ 1 cm, allontanare la pelle dal tessuto muscolare addominale, praticare un'incisione di ~ 3 cm nel tessuto muscolare addominale, identificare il cieco e rimuovere l'intero colon con forbici e pinze sterili. Bagnare il colon con PBS pre-freddo in un piatto di coltura.
  3. Incidere il colon longitudinalmente e risciacquarlo con PBS pre-freddo. Tagliare 1/3 del colon longitudinalmente.
  4. Posizionare la striscia del colon in un tovagliolo di carta con il lato luminale rivolto verso l'alto. Eseguire la laminazione svizzera con uno stuzzicadenti15.
  5. Posizionare il colon svizzero in una cassetta e mettere la cassetta in formalina tamponata al 10% per 24 ore 16, seguita da disidratazione utilizzando un processore automatizzato (vedi Tabella dei materiali) e incorporamento di paraffina.
  6. Tagliare sezioni di tessuto da 5 μm su un microtomo, montate su vetrini, ed eseguire la colorazione di ematossilina ed eosina (H &E)17 (vedere Tabella dei materiali).
  7. Determinare i punteggi istopatologici combinando i punteggi per ciascuno dei sei parametri per un massimo di 12. Infiammazione della lamina propria (normale, 0; lieve, 1; moderata, 2; grave, 3); perdita di cellule caliciformi (normale, 0; lieve, 1; moderata, 2; grave, 3); cripta anormale (normale, 0; iperplastica, 1; disorganizzazione, 2; perdita di cripta, 3); ascessi della cripta (assente, 0; presente, 1); erosione della mucosa e ulcerazione (normale, 0; lieve, 1; moderata, 2; grave, 3); e cambiamento sottomucoso (nessuno, 0; sottomucosa, 1; transmurale, 2)18.

8. Isolamento e colorazione delle cellule della lamina propria intestinale

  1. Dopo il passaggio 7.3, tagliare altri 2/3 del colon in pezzi di 0,5-1 cm e lavarlo con PBS pre-freddo.
  2. Trasferire i segmenti del colon in un tampone EDTA-PBS preriscaldato da 20 mL in un tubo centrifugo da 50 mL. Incubare a 37 °C con 250 giri/min scuotendo per 30 min.
  3. Ruotare il tubo, scartare i supernatanti facendolo passare attraverso un setaccio sterile (diametro: 0,01 pollici) e risospescere i segmenti del colon in 20 ml di PBS pre-freddo nel tubo da 50 ml.
  4. Ripetere due volte il passaggio 8.3.
  5. Posizionare i segmenti del colon in un tubo C (vedere Tabella dei materiali) contenente 10 ml di tampone di digestione preriscaldato.
  6. Posizionare il tubo su una macchina dissociatore (vedi Tabella dei materiali) e incubare secondo il programma di "37C_m_LPDK_1" per 25 min.
    NOTA: "37C_m_LPDK_1" è un programma preimpostato standard nella macchina Dissociatore utilizzata per agitare i campioni e mantenerli a 37 °C.
  7. Controllare se il tessuto viene digerito completamente, il che significa che nessun pezzo di tessuto è nel tampone di digestione. In caso contrario, ripetere il programma di "37C_m_LPDK_1".
  8. Raccogliere il surnatante passando attraverso un setaccio metallico e un filtro da 100 μL. Risciacquare con 10 ml di PBS pre-freddo.
  9. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 min a 4 °C. Aspirare tutti i supernatanti.
  10. Risospenare le cellule in 4 mL di soluzione di Percoll al 40% e mescolarle accuratamente (preparate al punto 2.8).
  11. Trasferire le celle risospese in 2 mL di soluzione di Percoll al 75% in un tubo centrifugo da 15 mL.
  12. Centrifugare la sospensione cellulare a 850 x g per 20 min a 20 °C (Rampa di accelerazione: 0; Rampa freno: 0).
  13. Rimuovere con cura il grasso sullo strato superiore utilizzando una pipetta di trasferimento da 3 ml e trasferire lo strato cellulare a 20 ml di tampone di lavaggio in un tubo da 50 ml.
  14. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 min a 4 °C. Scartare tutti i supernatanti e le cellule risospese in 1 mL di Medium Completato.
  15. Contare le celle dopo il passaggio 3.6.
  16. Seminare le cellule in una piastra a 24 pozzetti, attivarle con 50 ng/mL di Phorbol-12-myristate 13-acetato e 750 ng/mL di ionomicina per 2 ore, seguite da incubazione con 5 μg/mL di Brefeldin A per 3 ore (vedi Tabella dei materiali).
    NOTA: I reagenti utilizzati sono tossici e la loro manipolazione richiede precauzioni e misure di sicurezza.
  17. Trasferire le celle in un tubo FACS, aggiungere 2 mL di tampone FACS e centrifugare le celle a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
  18. Incubare le cellule con 12,5 μg/mL di anti-topo CD16/3219 in (vedi Tabella dei Materiali) tampone FACS per bloccare i recettori Fc per 5 minuti a temperatura ambiente.
  19. Macchia per marcatore vivo/morto e di superficie.
    1. Lavare le celle con 2 mL di tampone FACS e centrifugarle a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
    2. Macchiare le cellule con coloranti vivi e marcatori di superficie (cioè anticorpi CD3 anti-topo e cd4 anti-topo)20 (vedi Tabella dei materiali) in FACS Buffer alla concentrazione ottimizzata per 30 minuti a 4 °C al buio.
      NOTA: I reagenti utilizzati sono tossici e la loro manipolazione richiede precauzioni e misure di sicurezza.
  20. Eseguire la colorazione cellulare e nucleare.
    1. Aggiungere 2 mL di tampone FACS e centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
    2. Permeabilizzare e fissare le cellule risospendendo le celle con 200 μL di soluzione di lavoro Transcription Factor Fix (vedi Tabella dei materiali) per 40 minuti a temperatura ambiente.
    3. Aggiungere 2 mL di tampone di Perm e centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
    4. Incubare le cellule con marcatori cellulari e nucleari (cioè anti-topo IFNγ, anti-topo IL-17A e anticorpi anti-topo Foxp3)20 nel tampone di Perm (vedi Tabella dei materiali) per 30 min-1 h a temperatura ambiente.
    5. Aggiungere 2 mL di tampone di Perm e centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
    6. Aggiungere 1 mL di tampone FACS e centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 8 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
  21. Risospese le cellule con 200 μL di tampone FACS ed eseguire i campioni su un citometro a flusso (vedere Tabella dei materiali).

Risultati

Circa 5 x 106 cellule TG CBir1 TCR naϊve CD4+ per milza sono state isolate da un topo adulto CBir1 TCR Tg. Il trasferimento di cellule TN CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ ha indotto la colite cronica nei topi Rag1-/- riceventi. Dopo il trasferimento cellulare, i segni clinici sono stati monitorati per valutare la progressione dell'infiammazione intestinale, compresa la perdita di peso, la consistenza delle feci e la postura curva. Come previsto, i topi hanno iniziato a perder...

Discussione

Sebbene ogni passaggio sia essenziale per la riproducibilità di questo modello di colite, ci sono diversi passaggi critici. I topi Rag-/- riceventi devono ricevere adeguate cellule T naϊve CD4+ vitali per indurre l'infiammazione intestinale. Abbiamo usato la milza per l'isolamento di cellule T CD4+ ingenue invece di MLN. Perché la resa delle cellule T CD4+ ingenue nelle MLN è molto più bassa che nella milza. CD62L è altamente espresso nelle cellule T naïve e CD4...

Divulgazioni

Nessun autore ha interessi finanziari, professionali o personali contrastanti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato in parte dalle sovvenzioni del National Institutes of Health DK125011, AI150210 e DK124132, dal premio STARs dell'Università del Texas System (Y.C.) e dal James W. McLaughlin Fellowship Fund della University of Texas Medical Branch di Galveston (W.Y.). La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filterMilliporeSigmaSCGPS05RE
100x Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI
100-µm strainerBD Biosciences352360
3-mL Transfer PipetteFisherbrand13-711-9CM
Anti-Mouse CD16/32Biolegend101302
Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5Biolegend102030
Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5Biolegend100327
Anti-Mouse CD4 APCBiolegend100516
Anti-Mouse CD4 Magnetic ParticlesBD Biosciences551539
Anti-Mouse CD4-BV421Biolegend100544
Anti-Mouse CD62L-PEBiolegend104408
Anti-Mouse Foxp3-PEThermoFisher12-5773-82
Anti-Mouse IFNγ-FITCBiolegend505806
Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7Biolegend506922
Automated Cell CounterBio-radTC20
Brefeldin ABD Biosciences555029
BSAFisher BioreagentsBP1600-1
C tubeMiltenyi130-093-237
Cell Separation MagnetBD Biosciences552311
Collagenase IVSigma-AldrichC5138
DAPISigma-AldrichD9542
Dissociator MachineMiltenyi130-096-427
DNase ISigma-Aldrich
EDTACorning46-034-CI
EDTA (0.5 M, PH 8.0)Corning46-034-CI
FBSR&D SystemsS11550
Flow cytometerBD BiosciencesLSD Fortessa
Heat LampCoverShieldBR40
Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain KitAbcamab245880
Insulin SyringesBD Biosciences329412
IonomycinThermoFisherI24222
Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kitThermoFisherL10119
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable ShakersThermoFisherSHKE6000
NH4ClThermo ScientificA687-500
PercollGE Healthcare17-0891-01
Phorbol-12-myristate 13-acetateSigma-AldrichP8139
RPMI 1640 MediumCytiva HyCloneSH3002702
SorterBD BiosciencesArial Fusion
Tissue Automatic ProcessorThermoFisherSTP120
Tissue Embedding/Processing CassetteFisher Healthcare22048142
Tris BaseThermo ScientificBP154-1
True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer)Biolegend424401

Riferimenti

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