CBir1 TCR Transgenik CD4+ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

Özet

Bu protokolde bağırsak mikrobiyota antijenine özgü T hücreli benimseyen transfer kolit modeli tanımlanmıştır. CD4⁺ T hücreleri CBir1 TCR transgenik farelerden izole edilmiştir. Bunlar, alıcı Rag1^/- farelere aktarılan ve bağırsak iltihabına yol açan immünodominant bağırsak mikrobiyota antijeni CBir1 flagellin için özeldir.

Özet

Görülme sıklığının artmasıyla gastrointestinal sistemi etkileyen kronik hastalıklar olan inflamatuar bağırsak hastalıkları (IBD), bireylere ve topluma önemli bir sağlık ve finansal yük getirmektedir. Bu nedenle, patogenezin ve IBD gelişiminin altında kalan mekanizmaların araştırılması kritik öneme sahiptir. Burada bağırsak mikrobiyota antijenine özgü T hücre transferi kolit modeli tanımlanmıştır. CBir1 flagellin, deneysel kolitte ve Crohn hastalığı olan hastalarda immünomisinant bağırsak bakteriyel antijeni olarak kabul edilmiştir. CBir1 flagellin'e özgü CBir1 transgenik naϊve CD4⁺ T hücreleri, bağışıklık eksikliği olan Rag1^/- farelere evlat edindikten sonra kronik kolite neden olabilir. Hastalığın şiddeti histopatoloji ile değerlendirilir. Kolonik lamina propriasındaki CD4⁺ T hücre fenotipleri de belirlenir. Bu model, IBD patogenezini yönlendiren mekanizmaları araştırmak ve IBD'yi tedavi etmek için potansiyel ilaçları test etmek için ideal bir murine modeli sağlayan IBD'nin geliştirilmesine yakından benzemektedir.

Giriş

Özellikle Crohn hastalığı (CD) ve ülseratif kolit (UC) dahil olmak üzere enflamatuar bağırsak hastalıkları (IBD^), gastrointestinal sistemin kronik, nükseden-remitting iltihabı ile karakterizedir ve dünya çapında milyonlarca 1. Genetik duyarlılık, bağırsak mikrobiyotası, immün yanıtlar, diyet ve yaşam tarzı2 dahil olmak üzere IBD'nin gelişiminde ve patogenezinde çeşitli faktörler söze dahil ^edilmiştir2. Ancak, IBD'nin tam mekanizması hala tam olarak anlaşılamamıştır.

Özel ilgi alanlardan biri bağırsak mikrobiyotası ve konak immün yanıtları arasındaki etkileşim bağırsak iltihabını

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi'nin Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Komitesi'ne göre gerçekleştirildi. CBir1 TCR Tg fareleri Birmingham'daki Alabama Üniversitesi'nden Dr. Charles Elson tarafından sağlandı. CBir1 TCR Tg fareleri dişi veya erkek olabilir, ancak 8-12 haftada olmalıdır. C57BL^/6 arka planındaki Rag1-/- fareler Jackson ^{Laboratuvarı10'dan} elde edildi. Rag1^-/- fareler cinsiyet ve yaşla eşleşmelidir ve erkek veya dişi kullanılabilir, ancak 8-12 haftada olmalıdır. Protokolün tamamı Şekil 1'de özetlenmiştir.

1. A....

Sonuçlar

Dalak başına yaklaşık 5 x ¹⁰⁶ CBir1 TCR Tg naϊve CD4⁺ T hücreleri yetişkin bir CBir1 TCR Tg fareden izole edildi. CBir1 TCR Tg naϊve CD4⁺ T hücrelerinin transferi, alıcı Rag1^/- farelerde kronik kolit indüklendi. Hücre transferlerinden sonra, kilo kaybı, dışkı kıvamı ve kambur duruş da dahil olmak üzere bağırsak iltihabının ilerlemesini değerlendirmek için klinik belirtiler izlendi. Beklendiği gibi, fareler hücre transferi sonrası yaklaşı.......

Tartışmalar

Bu kolit modelinin tekrarlanabilirliği için her adım şart olsa da, birkaç kritik adım vardır. Alıcı Rag^-/- fareler bağırsak iltihabını teşvik etmek için CD4 ⁺ T hücreleri naϊve yeterli uygulanabilir almalıdır. MLN'ler yerine naif CD4⁺ T hücrelerinin izolasyonu için dalak kullandık. Çünkü MLN'lerde naif CD4⁺ T hücrelerinin verimi dalaklara göre çok daha düşüktür. CD62L naif T hücrelerinde yüksek oranda ifade edilir ve CD44 ve CD25 T hü.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter	MilliporeSigma	SCGPS05RE
100x Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
100-µm strainer	BD Biosciences	352360
3-mL Transfer Pipette	Fisherbrand	13-711-9CM
Anti-Mouse CD16/32	Biolegend	101302
Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5	Biolegend	102030
Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5	Biolegend	100327
Anti-Mouse CD4 APC	Biolegend	100516
Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles	BD Biosciences	551539
Anti-Mouse CD4-BV421	Biolegend	100544
Anti-Mouse CD62L-PE	Biolegend	104408
Anti-Mouse Foxp3-PE	ThermoFisher	12-5773-82
Anti-Mouse IFNγ-FITC	Biolegend	505806
Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7	Biolegend	506922
Automated Cell Counter	Bio-rad	TC20
Brefeldin A	BD Biosciences	555029
BSA	Fisher Bioreagents	BP1600-1
C tube	Miltenyi	130-093-237
Cell Separation Magnet	BD Biosciences	552311
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Dissociator Machine	Miltenyi	130-096-427
DNase I	Sigma-Aldrich
EDTA	Corning	46-034-CI
EDTA (0.5 M, PH 8.0)	Corning	46-034-CI
FBS	R&D Systems	S11550
Flow cytometer	BD Biosciences	LSD Fortessa
Heat Lamp	CoverShield	BR40
Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit	Abcam	ab245880
Insulin Syringes	BD Biosciences	329412
Ionomycin	ThermoFisher	I24222
Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit	ThermoFisher	L10119
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers	ThermoFisher	SHKE6000
NH4Cl	Thermo Scientific	A687-500
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Phorbol-12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
RPMI 1640 Medium	Cytiva HyClone	SH3002702
Sorter	BD Biosciences	Arial Fusion
Tissue Automatic Processor	ThermoFisher	STP120
Tissue Embedding/Processing Cassette	Fisher Healthcare	22048142
Tris Base	Thermo Scientific	BP154-1
True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer)	Biolegend	424401