通过将CBir1 TCR转基因CD4 + T细胞过继转移到免疫缺陷小鼠来诱导肠道炎症

摘要

在该协议中，描述了肠道微生物群抗原特异性T细胞过继转移结肠炎模型。从CBir1 TCR转基因小鼠中分离出CD4 ⁺ T细胞。这些对于免疫优势性肠道微生物群抗原CBir1鞭毛蛋白具有特异性，其被转移到受体 Rag1^-/- 小鼠中，导致肠道炎症。

摘要

随着发病率的增加，炎症性肠病（IBD）是影响胃肠道的慢性疾病，给个人和社会带来了相当大的健康和经济负担。因此，研究IBD发病机制和发展的机制至关重要。这里描述了肠道微生物群抗原特异性T细胞转移结肠炎模型。CBir1 鞭毛蛋白已被公认为实验性结肠炎和克罗恩病患者的免疫优势性肠道细菌抗原。CBir1 TCR转基因naϊve CD4 ⁺ T细胞，对CBir1鞭毛蛋白具有特异性，可在过继转移到免疫缺陷 的Rag1^-/- 小鼠后诱导慢性结肠炎。通过组织病理学评估疾病的严重程度。还测定了固有结肠层中的CD4 ⁺ T细胞表型。该模型与IBD的发展非常相似，IBD为研究驱动IBD发病机制和测试治疗IBD的潜在药物提供了理想的小鼠模型。

引言

炎症性肠病（IBD），主要包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），其特征是胃肠道的慢性复发缓解炎症，影响全球数百万人¹。IBD的发展和发病机制涉及几个因素，包括遗传易感性、肠道微生物群、免疫反应、饮食和生活方式²。然而，IBD的确切机制仍未完全了解。

其中一个特别感兴趣的是肠道微生物群与宿主免疫反应在调节肠道炎症方面的相互作用³。肠道微生物群提供一系列免疫刺激分子和抗原，可以激活免疫反应⁴。虽然效应T细胞和调节性T细胞（Tregs）之间的平衡对于维持肠道稳态至关重要，但肠粘膜CD4 ⁺ T细胞对肠道微生物群抗原的过度反应会导致肠道炎症^5，6，7。作为一种免疫优势性肠道微生物群抗原，CBir1 鞭毛蛋白与人 ^CD8，9 的发病机制有关。此外，CBir1 TCR转基因（Tg）T细胞的转移在免疫缺陷小鼠⁶中诱导肠道炎症，与人类IBD非常相似，表明这种T细胞转移模型有助于研究人类IBD的机制。

这项工作描述了通过通过收养转移CBir1 TCR Tg naϊve CD4 ⁺ T细胞并评估疾病严重程度来诱导Rag1^-/-小鼠结肠炎的详细方案。此外，还显示了预期的结果，并讨论了程序和故障排除的关键步骤，这将有助于研究人员研究肠道炎症发病机制并测试治疗IBD的潜在药物。

研究方案

所有动物程序均根据德克萨斯大学医学分会的动物使用和护理委员会进行。CBir1 TCR Tg小鼠由阿拉巴马大学伯明翰分校的Charles Elson博士提供。CBir1 TCR Tg小鼠可以是雌性或雄性，但应该在8-12周。C57BL / 6背景上的 Rag1^-/- 小鼠是从杰克逊实验室^获得的10。 Rag1^-/- 小鼠必须是性别和年龄匹配的，可以使用雄性或雌性，但应该在8-12周。整个协议总结如图 1 所示。

1.受体小鼠的制备

1. 在C57BL / 6背景上制备 Rag1^-/- 小鼠，在相同的特定无病原体动物设施中繁殖。通过功率分析计算每组小鼠的数量¹¹。
   注意: Rag1^-/- 小鼠没有成熟的T细胞和B细胞¹⁰。
2. 用耳朵打孔标记老鼠。
3. 在T细胞转移的同一天称量小鼠。

2. 试剂和溶液的制备

注:所使用的试剂具有毒性或生物危害性，其处理需要采取预防措施和安全措施。

1. 准备洗涤缓冲液:将5 mL青霉素-链霉素加入500 mL RPMI 1640培养基中。将其彻底混合并储存在4°C。
2. 制备_Tris-NH4Cl裂解缓冲液。
   1. 准备溶液A部分.将2.06克Tris碱溶解在100毫升双蒸馏水（ddH _2O）中，并用HCl将pH值调节至7.2。
   2. 准备溶液B部分，将7.47克_NH4Cl溶解在800毫升ddH _2O中。
   3. 将 A 和 B 彻底混合。测量pH值，如果没有，则将其调节至7.2。
   4. 将总体积调节至1000 mL。高压灭菌，然后将其储存在4°C。
3. 准备隔离缓冲区。
   1. 将2.5克BSA和500μLEDTA（0.5 M，pH 8.0）加入500 mL1x PBS中。彻底混合。
   2. 通过0.22μm真空驱动的一次性瓶顶过滤器过滤溶液（见 材料表）。将其储存在4°C。
4. 准备 FACS 缓冲区。将1 mL FBS和50 μL EDTA（0.5 M，pH 8.0）加入50 mL洗涤缓冲液（在步骤2.1中制备）。充分混合并将其储存在4°C。
5. 准备完整的培养基。在45 mL洗涤缓冲液中加入5 mL FBS。充分混合并将其储存在4°C。
6. 准备 EDTA-PBS 缓冲区。
   1. 计算所需的 EDTA-PBS 缓冲液的体积。体积 （mL） = 鼠标数量 x 20。
   2. 在PBS中添加适当体积的FBS，EDTA和HEPES（2%的FBS，0.5mM的EDTA，10 mM的PBS中的HEPES）（见 材料表）。
   3. 将其彻底混合并在37°C水浴中预热。
7. 准备消化缓冲液。
   1. 计算所需消化缓冲液的体积。体积 （mL） = 鼠标编号 x 10。
   2. 在洗涤缓冲液中加入适当体积的FBS，胶原酶IV和DNA酶I（2%的FBS，0.5mg / mL胶原酶IV和10 U / mL的DNase I在洗涤缓冲液中）（见 材料表）。
   3. 将其彻底混合并在37°C水浴中预热。
8. 准备 Percoll 解决方案。
   1. 准备100%佩尔科尔。在45 mL原装Percoll中加入5 mL 10x PBS（见 材料表）。
   2. 在洗涤缓冲液中制备2%FBS。在49 mL洗涤缓冲液中加入1 mL FBS。
   3. 将40%佩尔科尔溶液和75%佩尔科尔溶液的体积烧开。40%佩尔科尔溶液（mL）的体积=小鼠数量x 4;75%Percoll溶液（mL）的体积=小鼠数量x 2。
      注:步骤2.1-2.5中制备的试剂/溶液将在步骤3-4中使用，步骤2.6-2.8中制备的试剂/溶液将在步骤9中使用。步骤9中使用的所有试剂/溶液都应新鲜制备。建议为所有步骤制作5%的额外缓冲区。

3. 脾 CBir1 TCR Tg CD4⁺ T 细胞的分离

1. 通过_CO2 安乐死的宫颈脱位对CBir1 TCR Tg小鼠/小鼠实施安乐死（30%-70%气空气置换率）。用70%乙醇润湿小鼠。
2. 进行约1厘米的左腹部切口，将皮肤从腹部肌肉组织中拉开，在腹部肌肉组织中做约3厘米的切口，并用无菌剪刀和镊子切除脾脏。将脾脏置于含有5mL预冷洗涤缓冲液（在步骤2.1中制备）的培养皿中。
3. 用两个无菌载玻片的粗糙表面研磨脾脏。通过100μm细胞过滤器将细胞悬浮液转移到50mL离心管中（见 材料表）。用5 mL预冷洗涤缓冲液冲洗载玻片和培养皿，并将洗涤缓冲液转移到管中。
4. 在4°C下以350×g离心细胞悬浮液8分钟。 弃去上清液，并在每个脾脏中用5mL预热的Tris-NH4Cl裂解缓冲液（在步骤2.2中制备）重悬细胞。在室温下孵育10分钟。将10 mL预冷洗涤缓冲液加入试管中。
5. 在4°C下以350× g 离心细胞悬浮液8分钟。 弃去上清液并用10mL预冷分离缓冲液（在步骤2.3中制备）重悬细胞。
6. 计算细胞。将10μL细胞悬浮液与10μL台盼蓝彻底混合。将10μL混合物加载到载玻片上，将载玻片插入自动细胞计数器（见 材料表）并获得活细胞数¹²。
   注意:在此步骤中，可以从一个供体小鼠获得大约1 x 10 ⁸ 个细胞。
7. 在4°C下以350× g 离心步骤3.6的剩余细胞悬浮液8分钟。 丢弃所有上清液。
8. 彻底涡旋抗小鼠CD4磁性颗粒（见材料表），直接每107个细胞加入50μL颗粒，并与细胞沉淀充分混合。在4°C下孵育30分钟。
   注意:任何其他商业CD4 ⁺ T细胞富集试剂盒都可以在这里使用。
9. 将细胞颗粒悬浮液转移到无菌收集管中。将3.5 mL预冷隔离缓冲液加入试管中。
10. 将管子放在室温下的细胞分离磁铁（见 材料表）上8分钟。使用3 mL转印移液器小心地吸出上清液。
11. 从细胞分离磁铁中取出试管（见 材料表），用3.5 mL预冷隔离缓冲液重悬细胞，并将试管置于室温下磁体4分钟。使用3 mL转印移液器小心地吸出上清液。
12. 重复步骤 3.11。
13. 用1mL预冷FACS缓冲液重悬细胞（在步骤2.4中制备）。

4. CBir1 TCR Tg naϊve CD4⁺ T细胞的纯化

1. 在步骤3.6之后对单元格进行计数。
2. 如果细胞浓度>¹⁰⁷ /mL，加入一定量的FACS缓冲液，以确保细胞浓度≤¹⁰⁷/mL。
   注意:在该步骤中，可以从一个供体小鼠获得~1×¹⁰⁷ 个细胞。
3. 用10μL抗小鼠CD4-APC，10μL抗小鼠CD25-Percp / Cy5.5和10μL抗小鼠CD62L-PE13^，14染色表面标志物（见材料表）。轻轻混合，在黑暗中在4°C下孵育30分钟。
4. 用2mL预冷FACS缓冲液洗涤细胞。在4°C下以350× g 离心细胞悬浮液8分钟。 使用3 mL转印移液管吸出所有上清液。
5. 重复步骤 4.4。
6. 将细胞重悬至预冷FACS缓冲液中的浓度为40 x ¹⁰⁶ / mL。
   注意:为防止分拣机堵塞，请将细胞通过70μm过滤器。
7. 加入0.1微克/毫升DAPI。
   注意:DAPI 用于排除死区。
8. 准备15 mL离心管，其中含有4mL完全培养基（在步骤2.5中制备）以收集分类的细胞。
9. 将电池装载到分拣机上。以纯度模式（喷嘴尺寸:70μm;压力: 70 PSI;事件速率:8000-12000 事件/秒;效率:高于90%）（图2）。
   注意:Naϊve CD4 ⁺ T细胞表达CD62L的高表达，缺乏激活标志物CD2513^，14。
10. 在4°C下以350× g 离心细胞悬浮液8分钟。 使用3 mL转印移液管吸出所有上清液。
11. 将细胞重悬于500μL的1x PBS中。
12. 按照步骤3.6对细胞进行计数
    注意:在本步骤中，可以从一只供体小鼠获得约5个×¹⁰⁶ 个细胞。

5.细胞转移到受体小鼠体内

1. 通过加入1x PBS，将CBir1 TCR Tg naϊve CD4 ⁺ T细胞重悬至5 x ¹⁰⁶ / mL浓度。
2. 在加热灯（见材料表）下加热Rag^-/-小鼠4分钟，并使用小鼠约束剂约束小鼠。
3. 使用1mL胰岛素注射器（27G）静脉内将200μL细胞悬浮液转移到 Rag^-/- 小鼠的尾静脉中（见 材料表）。
   注意:来自一只供体小鼠的细胞足以转移到大约五只受体小鼠。

6. 监测结肠炎进展过程中的临床体征

1. 每周称量小鼠体重，一旦小鼠开始失去原始重量的>5%，观察增加到每周两次。
2. 观察小鼠在轻度刺激时的反应/移动。
3. 观察其他临床异常。即姿势和粪便的一致性。

7. 结肠采集和组织病理学评分

1. 在体重减轻的时间点>20%的原始重量或细胞转移后6周，通过用_CO2 进行宫颈脱位来牺牲受体小鼠。用70%乙醇润湿小鼠。
2. 进行~1cm腹侧中线皮肤切口，将皮肤从腹部肌肉组织中拉开，在腹部肌肉组织中做一个~3cm的切口，识别盲肠，并用无菌剪刀和镊子切除整个结肠。在培养皿中用预冷的PBS润湿结肠。
3. 纵向切开结肠，并用预冷的PBS冲洗。纵向切除1/3的结肠。
4. 将结肠条放在纸巾中，腔内侧朝上。使用牙签进行瑞士滚动¹⁵。
5. 将冒号瑞士放入盒中，并将盒放入10%缓冲福尔马林中24小时¹⁶，然后使用自动处理器（见 材料表）和石蜡包埋脱水。
6. 在切片机上切割5μm的组织切片，安装在载玻片上，并进行苏木精和曙红（H&E）染色¹⁷ （见 材料表）。
7. 通过将六个参数中每个参数的评分组合在一起，最多12个来确定组织病理学评分。固有层炎症（正常，0;轻度，1;中度，2;重度，3）;杯状细胞丢失（正常，0;轻度，1;中度，2;严重，3）;异常隐窝（正常，0;增生，1;杂乱，2;隐窝丢失，3）;隐窝脓肿（不存在，0;存在，1）;粘膜糜烂和溃疡（正常，0;轻度，1;中度，2;重度，3）;和粘膜下改变（无，0;粘膜下，1;透壁，2）¹⁸。

8. 肠层固有细胞的分离和染色

1. 步骤7.3之后，将另一个2/3的结肠切成0.5-1厘米的块，并用预冷PBS清洗。
2. 将结肠段转移到50 mL离心管中的20 mL预热EDTA-PBS缓冲液中。在37°C下孵育，以250rpm振荡30分钟。
3. 涡旋管，通过无菌筛（直径:0.01英寸）丢弃上清液，并将结肠段重悬于50 mL管中的20 mL预冷PBS中。
4. 重复步骤 8.3 两次。
5. 将结肠段置于含有10mL预热消化缓冲液的C管（ 见材料表）中。
6. 将管子放在解离机上（见 材料表），并在"37C_m_LPDK_1"程序下孵育25分钟。
   注:"37C_m_LPDK_1"是解离机中的标准预设程序，用于搅拌样品并将其保持在37°C。
7. 检查组织是否被完全消化，这意味着消化缓冲液中没有一块组织。如果没有，请重复"37C_m_LPDK_1"程序。
8. 通过金属筛和100μL过滤器收集上清液。用 10 mL 预冷 PBS 冲洗。
9. 在4°C下以350× g 离心细胞悬浮液8分钟。 吸出所有上清液。
10. 将细胞重悬于4mL的40%Percoll溶液中并充分混合（在步骤2.8中制备）。
11. 将重悬的细胞转移到15mL离心管中的2mL 75%Percoll溶液中。
12. 在20°C下以850× g 离心细胞悬浮液20分钟（加速度斜坡:0;制动斜坡:0）。
13. 使用3 mL转印移液器小心地去除顶层的脂肪，并将细胞层转移到50 mL管中的20 mL洗涤缓冲液中。
14. 在4°C下以350×g离心细胞悬浮液8分钟。 弃去所有上清液并将细胞重悬于1mL完成培养基中。
15. 在步骤3.6之后对单元格进行计数。
16. 将细胞接种在24孔板中，用50 ng / mL的Phorbol-12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和750ng / mL的离子霉素激活它们2小时，然后与5μg/ mL的Brefeldin A孵育3小时（见 材料表）。
    注:所用试剂有毒，其处理需要采取预防措施和安全措施。
17. 将细胞转移到FACS管中，加入2mL FACS缓冲液，并在4°C下以350× g 离心细胞8分钟。 丢弃上清液。
18. 用12.5μg/ mL抗小鼠CD16 / ³²¹⁹ （ 见材料表）FACS缓冲液孵育细胞，以在室温下阻断Fc受体5分钟。
19. 活/死标记和表面标记的染色。
    1. 用2mL FACS缓冲液洗涤细胞，并在4°C下以350× g 离心8分钟。 丢弃上清液。
    2. 在FACS缓冲液中，用活染料和表面标记物（即抗小鼠CD3和抗小鼠CD4抗体）²⁰ （ 见材料表）在FCS缓冲液中以优化浓度在黑暗中在4°C下染色细胞30分钟。
       注:所用试剂有毒，其处理需要采取预防措施和安全措施。
20. 进行细胞和核染色。
    1. 加入2mL FACS缓冲液，并在4°C下以350× g 离心细胞悬浮液8分钟。 丢弃上清液。
    2. 通过用200μL转录因子固定工作溶液（见 材料表）重用细胞在室温下重用细胞40分钟来透化和固定细胞。
    3. 加入2mL彼尔姆缓冲液，并在4°C下以350× g 离心细胞悬浮液8分钟。 丢弃上清液。
    4. 将细胞和核标志物（即抗小鼠IFNγ，抗小鼠IL-17A和抗小鼠Foxp3抗体）²⁰ 在Perm缓冲液（见 材料表）中孵育细胞，在室温下30分钟-1小时。
    5. 加入2mL彼尔姆缓冲液，并在4°C下以350× g 离心细胞悬浮液8分钟。 丢弃上清液。
    6. 加入1mL FACS缓冲液，并在4°C下以350×g离心细胞悬浮液8分钟。 丢弃上清液。
21. 用200μLFACS缓冲液重悬细胞，并在流式细胞仪上运行样品（见 材料表）。

结果

从成年CBir1 TCR Tg小鼠中分离出每个脾脏约5 x ¹⁰⁶个CBir1 TCR Tg naϊve CD4 ⁺ T细胞。CBir1 TCR Tg naϊve CD4 ⁺ T细胞的转移在受体Rag1^-/-小鼠中诱导慢性结肠炎。细胞转移后，监测临床体征以评估肠道炎症的进展，包括体重减轻，粪便稠度和驼背姿势。正如预期的那样，小鼠在细胞转移后三周左右开始减肥，并且在细胞转移后六周体重达到原始重量的80%-85%左右（

讨论

虽然每个步骤对于该结肠炎模型的可重复性都至关重要，但有几个关键步骤。受体Rag^-/-小鼠应接受足够的活的naϊve CD4 ⁺ T细胞以诱导肠道炎症。我们使用脾脏来分离幼稚的CD4 ⁺ T细胞而不是MLN。因为MLNs中幼稚CD4 ⁺ T细胞的产量远低于脾脏。CD62L在幼稚T细胞中高度表达，CD44和CD25是T细胞的活化标志物^13，14。在这项研究...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter	MilliporeSigma	SCGPS05RE
100x Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
100-µm strainer	BD Biosciences	352360
3-mL Transfer Pipette	Fisherbrand	13-711-9CM
Anti-Mouse CD16/32	Biolegend	101302
Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5	Biolegend	102030
Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5	Biolegend	100327
Anti-Mouse CD4 APC	Biolegend	100516
Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles	BD Biosciences	551539
Anti-Mouse CD4-BV421	Biolegend	100544
Anti-Mouse CD62L-PE	Biolegend	104408
Anti-Mouse Foxp3-PE	ThermoFisher	12-5773-82
Anti-Mouse IFNγ-FITC	Biolegend	505806
Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7	Biolegend	506922
Automated Cell Counter	Bio-rad	TC20
Brefeldin A	BD Biosciences	555029
BSA	Fisher Bioreagents	BP1600-1
C tube	Miltenyi	130-093-237
Cell Separation Magnet	BD Biosciences	552311
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Dissociator Machine	Miltenyi	130-096-427
DNase I	Sigma-Aldrich
EDTA	Corning	46-034-CI
EDTA (0.5 M, PH 8.0)	Corning	46-034-CI
FBS	R&D Systems	S11550
Flow cytometer	BD Biosciences	LSD Fortessa
Heat Lamp	CoverShield	BR40
Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit	Abcam	ab245880
Insulin Syringes	BD Biosciences	329412
Ionomycin	ThermoFisher	I24222
Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit	ThermoFisher	L10119
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers	ThermoFisher	SHKE6000
NH4Cl	Thermo Scientific	A687-500
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Phorbol-12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
RPMI 1640 Medium	Cytiva HyClone	SH3002702
Sorter	BD Biosciences	Arial Fusion
Tissue Automatic Processor	ThermoFisher	STP120
Tissue Embedding/Processing Cassette	Fisher Healthcare	22048142
Tris Base	Thermo Scientific	BP154-1
True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer)	Biolegend	424401