A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
تضخيم الإشريكية القولونية في رقاقة الموائع الدقيقة PCR ذات التدفق المستمر واكتشافها باستخدام نظام الرحلان الكهربائي الشعري
In This Article
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية بناء نظام سلسلة بوليميراز التدفق المستمر على أساس شريحة الموائع الدقيقة وكيفية بناء نظام الرحلان الكهربائي الشعري في المختبر. يقدم طريقة بسيطة لتحليل الأحماض النووية في المختبر.
Abstract
تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو طريقة تقليدية تستخدم لتضخيم الجين المستهدف الذي لعب دورا مهما في التشخيص الجزيئي الحيوي. ومع ذلك ، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي يستغرق وقتا طويلا للغاية بسبب كفاءة تباين درجات الحرارة المنخفضة. يقترح هذا العمل نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل المستمر التدفق (CF-PCR) على أساس شريحة الموائع الدقيقة. يمكن تقليل وقت التضخيم بشكل كبير عن طريق تشغيل محلول PCR في قناة صغيرة موضوعة على سخانات مضبوطة في درجات حرارة مختلفة. علاوة على ذلك ، نظرا لأن الرحلان الكهربائي الشعري (CE) هو طريقة مثالية للتمييز بين منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الإيجابية والكاذبة ، فقد تم بناء نظام CE لتحقيق الفصل الفعال لشظايا الحمض النووي. تصف هذه الورقة عملية تضخيم الإشريكية القولونية (E. coli) بواسطة نظام CF-PCR المدمج داخليا والكشف عن منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة CE. تظهر النتائج أن الجين المستهدف من E. coli قد تم تضخيمه بنجاح في غضون 10 دقائق ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام هذين النظامين للتضخيم السريع والكشف عن الأحماض النووية.
Introduction
تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو تقنية بيولوجيا جزيئية تستخدم لتضخيم شظايا معينة من الحمض النووي ، وبالتالي تضخيم كميات ضئيلة من الحمض النووي مئات الملايين من المرات. لقد تم استخدامه على نطاق واسع في التشخيص السريري ، والبحوث الطبية ، وسلامة الأغذية ، وتحديد الطب الشرعي ، وغيرها من المجالات. تتكون عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل أساسي من ثلاث خطوات: تمسخ عند 90-95 درجة مئوية ، والتلدين عند 50-60 درجة مئوية ، والتمديد عند 72-77 درجة مئوية. تعد الدورة الحرارية جزءا مهما من عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل ؛ ومع ذلك ، فإن جهاز تدوير الدراجات الحرارية PCR التقليدي ليس ضخما فحسب ، بل غير فعال أيضا ، ويتطلب حوالي 40 دقيقة لإكمال 25 دورة. للتغلب على هذه القيود ، تم بناء نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل المستمر التدفق (CF-PCR) داخليا ، استنادا إلى شريحة الموائع الدقيقة. يمكن أن يوفر CF-PCR الوقت بشكل كبير عن طريق دفع حل PCR إلى القنوات الدقيقة الموضوعة على السخانات في درجات حرارة مختلفة1،2،3،4،5.
نظرا لأن الرحلان الكهربائي الشعري (CE) له العديد من المزايا ، مثل الدقة العالية والسرعة العالية والتكاثر الممتاز6،7،8،9،10،11 ، فقد أصبح أداة شائعة في المختبر لتحليل الأحماض النووية والبروتينات. ومع ذلك ، فإن معظم المختبرات ، وخاصة المختبرات في العالم النامي ، لا تستطيع تحمل تكلفة هذه التكنولوجيا بسبب ارتفاع سعر أداة CE. هنا ، حددنا بروتوكولات لكيفية تصنيع رقاقة الموائع الدقيقة CF-PCR وكيفية بناء نظام CE متعدد الاستخدامات في المختبر. نوضح أيضا عملية تضخيم الإشريكية القولونية بواسطة نظام CF-PCR هذا واكتشاف منتجات PCR بواسطة نظام CE. باتباع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول ، يجب أن يكون المستخدمون قادرين على تصنيع رقائق الموائع الدقيقة ، وإعداد حلول تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وبناء نظام CF-PCR لتضخيم الحمض النووي ، وإنشاء نظام CE بسيط ، حتى مع الموارد المحدودة ، لفصل شظايا الحمض النووي.
Protocol
ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. تصنيع رقاقة الموائع الدقيقة CF-PCR
- سخني رقاقة السيليكون على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة لإزالة الرطوبة.
- الاستغناء عن 1 مل من SU-8-2075 مقاوم للضوء لكل بوصة من الرقاقة. قم بتدويرها على رقاقة السيليكون باستخدام طبقة دوران عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 5-10 ثوان مع تسارع 100 دورة في الدقيقة / ثانية ، ثم عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية مع تسارع 500 دورة في الدقيقة / ثانية.
- تخبز رقاقة السيليكون على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، ثم على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- اضبط 150 - 215 مللي جول / سم² كطاقة تعرض لآلة الطباعة الحجرية الضوئية ، وقم بنقش النمط المصمم على مقاوم الضوء باستخدام قناع الطباعة الحجرية الضوئية. ضع رقاقة السيليكون والقناع جاهزين للتعرض.
- بعد التعرض ، اخبز رقاقة السيليكون على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، ثم على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
- اغمر رقاقة السيليكون في محلول المطور لإزالة المقاومة الزائدة للضوء وإخراجها عندما يمكن رؤية القنوات الدقيقة (الشكل 1). استخدم الأيزوبروبانول لشطف محلول المطور المتبقي.
- امزج بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS) وعامل المعالجة بنسبة 10: 1. صب محلول PDMS المختلط في قالب النسخة المتماثلة وقم بتثبيته عند 80 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- قم بربط شريحة الموائع الدقيقة PDMS على شريحة بعد التنشيط باستخدام منظف البلازما ، وقم بتثبيتها عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في أسرع وقت ممكن (الشكل 2).
ملاحظة: الأبعاد الخارجية للرقاقة هي 80.0 مم × 30.0 مم × 0.4 مم. هناك 40 قناة اعوج (100 ميكرومتر × 1.46 مم × 100 ميكرومتر ، عرض × طول × عمق) في رقاقة الموائع الدقيقة.
2. إعداد حل PCR
- قم بإذابة الكواشف تماما قبل التكوين. استخدم خلاط دوامة وأجهزة طرد مركزي لضمان خلط الكواشف جيدا.
- قم بإعداد أنبوب طرد مركزي ، مع إضافة المكونات التالية بهذا الترتيب: 33.75 ميكرولتر من الماء ، 1.0 ميكرولتر من قالب الحمض النووي ، 0.5 ميكرولتر من التمهيدي ، 5.0 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، 4.0 ميكرولتر من خليط dNTP ، 1.5 ميكرولتر من توين 20 ، 3.5 ميكرولتر من PVP ، وأخيرا 0.25 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي.
ملاحظة: هنا ، قالب الحمض النووي المستخدم هو E. coli. يتم سرد الاشعال للإشريكية القولونية ومكونات محلول PCR في الجدول 1 والجدول 2 ، على التوالي. - خلط الحل عن طريق دوامة.
3. بناء نظام CF-PCR
- قم بإعداد سخانين من السيراميك بمعامل درجة الحرارة الموجبة (PTC) ، ومرحلين للحالة الصلبة ، وجهازي تحكم في درجة الحرارة PID ، ومستشعرين لدرجة الحرارة ، وسلك طاقة.
ملاحظة: يعتمد حجم سخانات السيراميك PTC على حجم رقاقة الموائع الدقيقة ؛ يجب أن يكون الطول أكبر من طول الشريحة - الطول والعرض والارتفاع لسخانات السيراميك PTC المستخدمة هنا هو 10 سم × 2 سم × 0.4 سم. - قم بتوصيل السخان بمرحل الحالة الصلبة.
- قم بتوصيل مرحل الحالة الصلبة بجهاز التحكم في درجة الحرارة PID.
- قم بتوصيل مسبار مستشعر درجة الحرارة بأسفل السخانين وقم بتوصيل الطرف بجهاز التحكم في درجة الحرارة PID.
- قم بتوصيل مرحلتين من الحالة الصلبة في سلسلة وقم بتوصيل سلك الطاقة.
- اطبع 3D فتحة للسخانين واحتفظ بالسخانات على نفس المستوى (انظر الملف التكميلي 1 لملفات STL المطلوبة للطباعة ثلاثية الأبعاد).
ملاحظة: اترك فجوة هوائية 12 مم بين السخانين. - ضع شريحة الموائع الدقيقة على السخانين.
- قم بإعداد مضخة حقنة ومحقنة ، وقم بتثبيت المحقنة على مضخة المحقنة ، وقم بتوصيل أنبوب سيليكون (قطر داخلي 0.8 مم [ID]) بحقنة ، وقم بتوصيل إبرة فولاذية (معرف 0.7 مم) بأعلى أنبوب السيليكون (الشكل 3).
- أدخل الإبرة الفولاذية في مدخل رقاقة الموائع الدقيقة.
- ضع طرف ماصة عند مخرج الشريحة لجمع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل.
4. بناء نظام CE
- استخدام مصدر طاقة عالي الجهد لتوليد مجال كهربائي نابض ؛ لاحظ الأقطاب الموجبة والسالبة.
- استخدم مصباح الزئبق كمصدر للضوء وقم بتصفية الطول الموجي للإثارة من مصباح الزئبق من خلال مرشح.
- ضع الشعيرات الدموية على مرحلة المجهر.
- اجمع انبعاث التألق مع الهدف ، ثم اكتشفه باستخدام أنبوب المضاعف الضوئي R928 (PMT). مراقبة المجهر والشعيرات الدموية. قم بتشغيل الضوء في ظل ظروف الغرفة المظلمة ؛ يتم جمع ضوء الإثارة حسب الهدف.
- استخدم برنامج LABVIEW المطور ذاتيا للتحكم في مصدر الطاقة وإكمال الحصول على البيانات (الموضح في الخطوات 6.3-6.6). انظر https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب في غرفة مظلمة ، ويظهر الرسم التخطيطي لنظام CE في الشكل 4.
5. قم بتشغيل حل PCR
- اضبط مسبقا درجة حرارة سخانات نظام CF-PCR على 65 درجة مئوية و 95 درجة مئوية.
- ضع رقاقة الموائع الدقيقة على كتلتي التسخين.
- أدخل طرف أنبوب السيليكون في أنبوب طرد مركزي يحتوي على 50 ميكرولتر من محلول تفاعل البوليميراز المتسلسل (من الخطوة 2.3). اسحب مكبس المحقنة لسحب المحلول ببطء. ثبت المحقنة على مضخة حقنة. أدخل الإبرة الفولاذية في مدخل رقاقة الموائع الدقيقة.
- اضبط معدل تدفق المضخة على 10 ميكرولتر / دقيقة واضغط على زر البدء لدفع المحلول في القناة الدقيقة عند مدخل الرقاقة.
- جمع منتجات PCR عند مخرج رقاقة الموائع الدقيقة.
ملاحظة: شطف القناة بالماء عالي النقاء قبل وبعد تفاعل البوليميراز المتسلسل لإزالة الشوائب.
6. الكشف عن منتجات PCR بواسطة نظام CE المدمج في المنزل
- تحضير الشعيرات الدموية بطول إجمالي 8 سم وطول فعال 6 سم.
- قم بإعداد مخزن الفصل المؤقت عن طريق خلط 100 ميكرولتر من 1٪ هيدروكسي إيثيل سلولوز (HEC ، w / v) ، 2 ميكرولتر من 100x SYBR Green I ، و 98 ميكرولتر من الماء عالي النقاء للحصول على 0.5٪ HEC (w / v) يحتوي على 1x SYBR Green I.
- املأ الشعيرات الدموية بمخزن الفصل المحضر باستخدام مضخة تفريغ.
- أدخل جهد الحقن (800 فولت) ووقت الحقن (2.0 ثانية) على واجهة البرنامج ، وانقر فوق زر البدء ، وانتظر حتى يتم إدخال منتجات PCR كهروديناميكيا في الشعيرات الدموية عند 100 فولت / سم (2.0 ثانية).
ملاحظة: في هذه الخطوة ، يتم وضع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على القطب السالب ويتم وضع المخزن المؤقت على القطب الموجب. - أدخل جهد التيار المستمر (800 فولت) على واجهة البرنامج ، وانقر فوق زر البدء ، وقم بتشغيل الرحلان الكهربائي عند 100 فولت / سم من شدة المجال الكهربائي.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم وضع كل من الأقطاب الكهربائية الموجبة والسالبة مع المخزن المؤقت. - انقر فوق زر التوقف بعد فصل جميع أجزاء الحمض النووي (DNA) في الشعيرات الدموية.
- اغسل الشعيرات الدموية بالماء المعقم لمدة 1 دقيقة بعد كل تشغيل.
النتائج
يمثل الشكل 5 مخطط كهربية لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل وعلامات الحمض النووي. التتبع (الشكل 5A) هو نتيجة CE للمنتج المضخم CF-PCR ، والتتبع (الشكل 5B) هو نتيجة CE للمنتج المضخم بواسطة الدورة الحرارية ، والتتبع (الشكل 5C) هو نتيجة CE لسلم الحمض النوو...
Discussion
كل من PCR و CE هما تقنيتان حيويتان شائعتان في تحليل الأحماض النووية. تصف هذه الورقة تضخيم الإشريكية القولونية والكشف عن منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام أنظمة CF-PCR و CE ، وكلاهما مدمج داخليا. تم تضخيم الجين المستهدف من الإشريكية القولونية بنجاح في غضون 10 دقائق بسبب ارتفاع ?...
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل لجنة العلوم والتكنولوجيا التابعة لبلدية شنغهاي ، الصين (رقم 19ZR1477500 ورقم 18441900400). نعترف بامتنان بالدعم المالي من جامعة شنغهاي للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2017KJFZ049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  | Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. Continuous-flow thermal gradient PCR. Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved