Амплификация кишечной палочки в микрофлюидном чипе непрерывной ПЦР и ее детектирование с помощью системы капиллярного электрофореза

Резюме

В этом протоколе описывается, как построить систему непрерывной полимеразной цепи на основе микрофлюидного чипа и как построить систему капиллярного электрофореза в лаборатории. В ней представлен простой метод анализа нуклеиновых кислот в лабораторных условиях.

Аннотация

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это традиционный метод, используемый для амплификации гена-мишени, который играет важную роль в биомолекулярной диагностике. Тем не менее, традиционная ПЦР занимает очень много времени из-за эффективности низкотемпературных вариаций. В данной работе предложена система непрерывной ПЦР (МФ-ПЦР) на основе микрофлюидного чипа. Время амплификации можно значительно сократить, запустив раствор ПЦР в микроканал, размещенный на нагревателях, настроенных на различные температуры. Более того, поскольку капиллярный электрофорез (КЭ) является идеальным способом дифференциации положительных и ложноположительных продуктов ПЦР, была создана система КЭ для достижения эффективного разделения фрагментов ДНК. В данной работе описан процесс амплификации Escherichia coli (E. coli) собственной системой CF-PCR и детектирования продуктов ПЦР с помощью КЭ. Результаты показывают, что ген-мишень E. coli был успешно амплифицирован в течение 10 минут, что указывает на то, что эти две системы могут быть использованы для быстрой амплификации и обнаружения нуклеиновых кислот.

Введение

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод молекулярной биологии, используемый для амплификации определенных фрагментов ДНК, тем самым амплифицируя следовые количества ДНК в сотни миллионов раз. Он широко используется в клинической диагностике, медицинских исследованиях, безопасности пищевых продуктов, судебно-медицинской идентификации и других областях. Процесс ПЦР в основном состоит из трех этапов: денатурация при 90-95 °C, отжиг при 50-60 °C и растяжение при 72-77 °C. Термоциклирование является важной частью процесса ПЦР; однако традиционный ПЦР-амплификатор не только громоздкий, но и неэффективный, ему требуется около 40 минут для завершения 25 циклов. Для преодоления этих ограничений была создана собственная система непрерывной ПЦР (CF-PCR) на основе микрофлюидного чипа. CF-PCR может значительно сэкономить время, загоняя раствор ПЦР в микроканалы, размещенные на нагревателях при различных температурах 1,2,3,4,5.

Поскольку капиллярный электрофорез (КЭ) имеет много преимуществ, таких как высокое разрешение, высокая скорость и отличная воспроизводимость 6,7,8,9,10,11^, он стал популярным инструментом в лаборатории для анализа нуклеиновых кислот и белков. Однако большинство лабораторий, особенно в развивающихся странах, не могут позволить себе эту технологию из-за высокой цены прибора CE. В этой статье мы описали протоколы изготовления микрофлюидного чипа CF-PCR и создания универсальной системы CE в лаборатории. Мы также демонстрируем процесс амплификации E. coli с помощью этой системы CF-PCR и обнаружения продуктов ПЦР с помощью системы CE. Следуя процедурам, описанным в этом протоколе, пользователи должны иметь возможность изготавливать микрофлюидные чипы, готовить растворы для ПЦР, создавать систему CF-PCR для амплификации нуклеиновых кислот и настраивать простую систему CE даже с ограниченными ресурсами для разделения фрагментов ДНК.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, реагентам и оборудованию, используемым в этом протоколе.

1. Изготовление микрофлюидного чипа CF-PCR

1. Нагрейте кремниевую пластину до 200 °C в течение 25 минут, чтобы удалить влагу.
2. Дозируйте 1 мл фоторезиста SU-8-2075 на дюйм пластины. Отжим его на кремниевой пластине с помощью машины для нанесения отжима при 500 об/мин в течение 5-10 с ускорением 100 об/мин, а затем при 2 000 об/мин в течение 30 с ускорением 500 об/с.
3. Выпекайте кремниевую пластину при температуре 65 °C в течение 3 минут, затем при температуре 95 °C в течение 15 минут.
4. Установите 150 - 215 мДж/см² в качестве энергии экспозиции для фотолитографического аппарата и выгравируйте разработанный рисунок на фоторезисте с помощью фотолитографической маски. Поместите кремниевую пластину и маску, готовые к экспонированию.
5. После выдержки выпекайте кремниевую пластину при температуре 65 °C в течение 2 минут, а затем при температуре 95 °C в течение 7 минут.
6. Погрузите кремниевую пластину в раствор проявителя, чтобы удалить излишки фоторезиста, и выньте его, когда микроканалы станут видны (рис. 1). Используйте изопропанол, чтобы смыть остатки раствора проявителя.
7. Смешайте преполимер полидиметилсилоксана (ПДМС) и отвердитель в соотношении 10:1. Вылейте смешанный раствор PDMS в реплику формы и затвердейте при 80 °C в течение 60 минут.
8. Приклейте микрофлюидный чип PDMS к предметному стеклу после активации с помощью плазменного очистителя и как можно скорее затвердейте при 80 °C в течение 30 минут (рис. 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внешние размеры чипа составляют 80,0 мм × 30,0 мм × 0,4 мм. В микрофлюидном чипе имеется 40 змеевидных каналов (100 мкм × 1,46 мм × 100 мкм, ширина × длина × глубина).

2. Приготовление ПЦР-раствора

1. Полностью разморозьте реагенты перед конфигурацией. Используйте вихревой смеситель и центрифугу, чтобы убедиться, что реагенты хорошо перемешаны.
2. Подготовьте центрифужную пробирку, добавив следующие компоненты в следующем порядке: 33,75 мкл воды, 1,0 мкл матрицы ДНК, 0,5 мкл праймера, 5,0 мкл буфера, 4,0 мкл смеси dNTP, 1,5 мкл Tween 20, 3,5 мкл PVP и, наконец, 0,25 мкл ДНК-полимеразы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется матрица ДНК E. coli. Праймеры для E. coli и компоненты ПЦР-раствора перечислены в таблице 1 и таблице 2 соответственно.
3. Перемешайте раствор путем вихряния.

3. Построение системы CF-PCR

1. Подготовьте два керамических нагревателя с положительным температурным коэффициентом (PTC), два твердотельных реле, два ПИД-регулятора температуры, два датчика температуры и шнур питания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер керамических нагревателей PTC зависит от размера микрофлюидной стружки; длина должна быть больше, чем длина стружки - длина-ширина-высота используемых здесь керамических нагревателей PTC составляет 10 см x 2 см x 0,4 см.
2. Подключите нагреватель к твердотельному реле.
3. Подключите твердотельное реле к ПИД-регулятору температуры.
4. Прикрепите датчик датчика температуры к нижней части двух нагревателей и подсоедините клемму к ПИД-регулятору температуры.
5. Соедините два твердотельных реле последовательно и подключите шнур питания.
6. Напечатайте на 3D-принтере паз для двух нагревателей и держите нагреватели в одной плоскости (см. Дополнительный файл 1 для файлов STL, необходимых для 3D-печати).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте воздушный зазор 12 мм между двумя нагревателями.
7. Поместите микрофлюидный чип на два нагревателя.
8. Подготовьте шприцевой насос и шприц, закрепите шприц на шприцевом насосе, соедините силиконовую трубку (внутренний диаметр 0,8 мм [ID]) со шприцем и подсоедините стальную иглу (внутренний диаметр 0,7 мм) к верхней части силиконовой трубки (рисунок 3).
9. Вставьте стальную иглу во входное отверстие микрофлюидной стружки.
10. Поместите наконечник пипетки на выходе чипа для сбора продуктов ПЦР.

4. Построение системы CE

1. Использовать высоковольтный источник питания для создания электрического поля импульсного поля; Обратите внимание на положительный и отрицательный электроды.
2. Используйте ртутную лампу в качестве источника света и отфильтруйте длину волны возбуждения от ртутной лампы через фильтр.
3. Поместите капилляр на предметный столик микроскопа.
4. Соберите флуоресцентное излучение с помощью объектива, а затем зафиксируйте его с помощью фотоумножителя R928 (ФЭУ). Наблюдайте за микроскопом и капилляром. Включайте свет в условиях темного помещения; Возбуждающий свет собирается объективом.
5. Используйте программное обеспечение LABVIEW собственной разработки для управления источником питания и завершения сбора данных (описано в шагах 6.3-6.6). Смотрите https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводились в темной комнате, а схема системы CE показана на рисунке 4.

5. Запустите ПЦР-раствор

1. Предварительно установите температуру нагревателей системы CF-PCR на уровне 65 °C и 95 °C.
2. Поместите микрофлюидный чип на два нагревательных блока.
3. Вставьте кончик силиконовой пробирки в центрифужную пробирку, содержащую 50 мкл раствора ПЦР (с шага 2.3). Потяните за поршень шприца, чтобы медленно извлечь раствор. Зафиксируйте шприц на шприцевом насосе. Вставьте стальную иглу во входное отверстие микрофлюидной стружки.
4. Установите расход насоса на 10 мкл/мин и нажмите кнопку запуска , чтобы протолкнуть раствор в микроканале на входе микрочипа.
5. Соберите продукты ПЦР на выходе из микрофлюидного чипа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Промойте канал сверхчистой водой до и после ПЦР для удаления примесей.

6. Обнаружение продуктов ПЦР с помощью собственной системы CE

1. Подготовьте капилляр общей длиной 8 см и эффективной длиной 6 см.
2. Приготовьте разделительный буфер, смешав 100 мкл 1% гидроксиэтилцеллюлозы (HEC, w/v), 2 мкл 100x SYBR Green I и 98 мкл сверхчистой воды для получения 0,5% HEC (w/v), содержащего 1x SYBR Green I.
3. Заполните капилляр подготовленным буфером сепарации с помощью вакуумного насоса.
4. Введите напряжение впрыска (800 В) и время впрыска (2,0 с) в программном интерфейсе, нажмите кнопку запуска и дождитесь электродинамического введения продуктов ПЦР в капилляр при 100 В/см (2,0 с).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе продукты ПЦР помещаются на отрицательный электрод, а буфер помещается на положительный электрод.
5. Введите напряжение постоянного тока (800 В) в программном интерфейсе, нажмите кнопку запуска и запустите электрофорез при напряженности электрического поля 100 В/см.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе как положительные, так и отрицательные электроды помещаются с буфером.
6. Нажмите кнопку «стоп » после того, как все фрагменты ДНК будут разделены в капилляре.
7. Промывайте капилляр стерилизованной водой в течение 1 мин после каждого запуска.

Результаты

На рисунке 5 представлена электроферограмма продуктов ПЦР и ДНК-маркеров. След (Рисунок 5А) – это результат КЭ амплифицированного продукта МФ-ПЦР, след (Рисунок 5В) – результат КЭ продукта, амплифицированного путем термоциклирования, а след (Рисунок 5С) –

Обсуждение

И ПЦР, и КЭ являются двумя популярными биотехнологиями в анализе нуклеиновых кислот. В данной статье описывается амплификация E. coli и выявление продуктов ПЦР с помощью систем CF-PCR и CE, разработанных собственными силами. Ген-мишень E. coli был успешно амплифицирован в течение 10 мин ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp DNA ladder	Takara Bio Inc.	3422A
10x Fast Buffer I	Takara Bio Inc.	RR070A
10x TBE	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1051
developer solution	Alfa Aesar, USA	L15459
dNTP mixture (2.5 μM)	Takara Bio Inc.	RR070A
EC-F	Sangon Biotech, Shanghai, China
EC-R	Sangon Biotech, Shanghai, China
HEC,1300K	Sigma-Aldrich, USA	9004-62-0
isopropanol	Aladdin, Shanghai, China	67-63-0
microscope	Olympus, Japan	BX51
photolithography	SUSS MicroTec, Germany	MJB4
photomultiplier tube	Hamamatsu Photonics, Japan	R928
photoresist	MicroChem, USA	SU-8 2075
PID temperature controllers	Shanghai, China	XH-W2023
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G-2
polyvinyl pyrrolidone (PVP)	Aladdin, Shanghai, China	P110608
pump	Harvard Apparatus	PHD2000
silicone tubing	BIO-RAD,USA	7318210
solid-state relays	KZLTD, China	KS1-25LA
SpeedSTAR HS DNA Polymerase	Takara Bio Inc.	RR070A
steel needle	zhongxinqiheng,Suzhou,China
SYBR GREEN	Solarbio, Beijing, China	SY1020
temperature sensors	EasyShining Technology, Chengdu, China	TCM-M207
Template (E. coli)	Takara Bio Inc.	AK601
Tween 20	Aladdin, Shanghai, China	T104863
voltage power supply	Medina, NY, USA	TREK MODEL 610E