Amplifikation von Escherichia coli in einem Continuous-Flow-PCR-Mikrofluidik-Chip und deren Detektion mit einem Kapillarelektrophorese-System

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie man ein Continuous-Flow-Polymerase-Kettensystem auf der Basis eines Mikrofluidik-Chips aufbaut und wie man ein Kapillarelektrophoresesystem im Labor aufbaut. Es stellt eine einfache Methode für die Analyse von Nukleinsäuren im Labor vor.

Zusammenfassung

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine traditionelle Methode zur Amplifikation eines Zielgens, die in der biomolekularen Diagnostik eine wichtige Rolle gespielt hat. Die herkömmliche PCR ist jedoch aufgrund der Effizienz bei niedrigen Temperaturschwankungen sehr zeitaufwändig. In dieser Arbeit wird ein Continuous-Flow-PCR (CF-PCR)-System vorgeschlagen, das auf einem mikrofluidischen Chip basiert. Die Amplifikationszeit kann stark verkürzt werden, indem die PCR-Lösung in einen Mikrokanal geleitet wird, der auf Heizgeräten mit unterschiedlichen Temperaturen platziert ist. Da die Kapillarelektrophorese (CE) ein idealer Weg zur Unterscheidung von positiven und falsch-positiven PCR-Produkten ist, wurde ein CE-System entwickelt, um eine effiziente Trennung der DNA-Fragmente zu erreichen. In dieser Arbeit wird der Prozess der Amplifikation von Escherichia coli (E. coli) durch das hauseigene CF-PCR-System und der Nachweis der PCR-Produkte durch CE beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, dass das Zielgen von E. coli innerhalb von 10 Minuten erfolgreich amplifiziert wurde, was darauf hindeutet, dass diese beiden Systeme für die schnelle Amplifikation und den Nachweis von Nukleinsäuren verwendet werden können.

Einleitung

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine molekularbiologische Technik, die zur Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente verwendet wird, wodurch Spuren von DNA hundertmillionenfach vervielfältigt werden. Es wurde häufig in der klinischen Diagnose, der medizinischen Forschung, der Lebensmittelsicherheit, der forensischen Identifizierung und anderen Bereichen eingesetzt. Der PCR-Prozess besteht im Wesentlichen aus drei Schritten: Denaturierung bei 90-95 °C, Glühen bei 50-60 °C und Verlängerung bei 72-77 °C. Thermozyklen sind ein wichtiger Bestandteil des PCR-Prozesses. Der herkömmliche PCR-Thermocycler ist jedoch nicht nur sperrig, sondern auch ineffizient und benötigt etwa 40 Minuten, um 25 Zyklen abzuschließen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde im eigenen Haus ein Continuous-Flow-PCR-System (CF-PCR) entwickelt, das auf einem Mikrofluidik-Chip basiert. Die CF-PCR kann erheblich Zeit sparen, indem die PCR-Lösung in Mikrokanäle getrieben wird, die bei unterschiedlichen Temperaturen^auf Heizgeräten platziert werden 1,2,3,4,5.

Da die Kapillarelektrophorese (CE) viele Vorteile hat, wie z. B. hohe Auflösung, hohe Geschwindigkeit und hervorragende Reproduzierbarkeit 6,7,8,9,10,11^, ist sie zu einem beliebten Werkzeug im Labor für die Analyse von Nukleinsäuren und Proteinen geworden. Die meisten Labore, insbesondere Labore in Entwicklungsländern, können sich diese Technologie jedoch aufgrund des hohen Preises des CE-Instruments nicht leisten. Hier haben wir Protokolle für die Herstellung des CF-PCR-Mikrofluidik-Chips und den Aufbau eines vielseitigen CE-Systems im Labor skizziert. Wir demonstrieren auch den Prozess der Amplifikation von E. coli durch dieses CF-PCR-System und den Nachweis der PCR-Produkte durch das CE-System. Durch die Befolgung der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren sollten Benutzer in der Lage sein, mikrofluidische Chips herzustellen, PCR-Lösungen herzustellen, ein CF-PCR-System für die Nukleinsäureamplifikation aufzubauen und ein einfaches CE-System einzurichten, auch mit begrenzten Ressourcen, um DNA-Fragmente zu trennen.

Protokoll

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Herstellung eines CF-PCR-Mikrofluidik-Chips

1. Erhitzen Sie den Siliziumwafer 25 Minuten lang bei 200 °C, um die Feuchtigkeit zu entfernen.
2. Geben Sie 1 ml SU-8-2075 Fotolack pro Zoll des Wafers ab. Drehen Sie es auf dem Siliziumwafer mit einem Spin Coater bei 500 U/min für 5-10 s mit einer Beschleunigung von 100 U/min und dann bei 2.000 U/min für 30 s mit einer Beschleunigung von 500 U/min/s.
3. Die Siliziumwaffel wird bei 65 °C für 3 Minuten weich gebacken, dann bei 95 °C für 15 Minuten.
4. Stellen Sie 150 - 215 mJ/cm² als Belichtungsenergie für das Fotolithographiegerät ein und gravieren Sie das entworfene Muster mit einer Fotolithographiemaske auf den Fotolack. Legen Sie den Siliziumwafer und die Maske für die Belichtung bereit.
5. Nach der Belichtung wird der Siliziumwafer 2 Minuten lang bei 65 °C und dann 7 Minuten lang bei 95 °C gebacken.
6. Tauchen Sie den Siliziumwafer in eine Entwicklerlösung, um überschüssigen Fotolack zu entfernen, und nehmen Sie ihn heraus, wenn die Mikrokanäle sichtbar sind (Abbildung 1). Verwenden Sie Isopropanol, um die restliche Entwicklerlösung abzuspülen.
7. Mischen Sie das Prepolymer Polydimethylsiloxan (PDMS) und den Härter im Verhältnis 10:1. Gießen Sie die gemischte PDMS-Lösung in die Replikationsform und erstarren Sie sie bei 80 °C für 60 min.
8. Kleben Sie den mikrofluidischen PDMS-Chip nach der Aktivierung mit einem Plasmakereiniger auf einen Objektträger und verfestigen Sie ihn so schnell wie möglich bei 80 °C für 30 Minuten (Abbildung 2).
   HINWEIS: Die Außenmaße des Chips betragen 80,0 mm × 30,0 mm × 0,4 mm. Im Mikrofluidik-Chip befinden sich 40 Serpentinenkanäle (100 μm × 1,46 mm × 100 μm, Breite × Länge × Tiefe).

2. Herstellung der PCR-Lösung

1. Tauen Sie die Reagenzien vor der Konfiguration vollständig auf. Verwenden Sie einen Vortex-Mischer und eine Zentrifuge, um sicherzustellen, dass die Reagenzien gut gemischt sind.
2. Bereiten Sie ein Zentrifugenröhrchen vor und fügen Sie die folgenden Komponenten in dieser Reihenfolge hinzu: 33,75 μl Wasser, 1,0 μl DNA-Template, 0,5 μl Primer, 5,0 μl Puffer, 4,0 μl dNTP-Mischung, 1,5 μl Tween 20, 3,5 μl PVP und schließlich 0,25 μl DNA-Polymerase.
   HINWEIS: Hier ist die verwendete DNA-Vorlage E. coli. Die Primer für E. coli und die Bestandteile der PCR-Lösung sind in Tabelle 1 bzw. Tabelle 2 aufgeführt.
3. Mischen Sie die Lösung durch Vortexing.

3. Aufbau des CF-PCR-Systems

1. Bereiten Sie zwei Keramikheizungen mit positivem Temperaturkoeffizienten (PTC), zwei Halbleiterrelais, zwei PID-Temperaturregler, zwei Temperatursensoren und ein Netzkabel vor.
   HINWEIS: Die Größe der PTC-Keramikheizungen hängt von der Größe des Mikrofluidik-Chips ab. die Länge sollte größer sein als die Länge des Chips - die Länge-Breite-Höhe der hier verwendeten PTC-Keramikheizungen beträgt 10 cm x 2 cm x 0,4 cm.
2. Schließen Sie die Heizung an das Halbleiterrelais an.
3. Schließen Sie das Halbleiterrelais an den PID-Temperaturregler an.
4. Befestigen Sie den Temperaturfühler an der Unterseite der beiden Heizungen und verbinden Sie die Klemme mit dem PID-Temperaturregler.
5. Schalten Sie zwei Halbleiterrelais in Reihe und schließen Sie das Netzkabel an.
6. Drucken Sie einen Schlitz für die beiden Heizungen in 3D und halten Sie die Heizungen auf derselben Ebene (siehe Ergänzungsdatei 1 für STL-Dateien, die für den 3D-Druck erforderlich sind).
   HINWEIS: Lassen Sie einen Luftspalt von 12 mm zwischen den beiden Heizungen.
7. Platzieren Sie den Mikrofluidik-Chip auf den beiden Heizungen.
8. Bereiten Sie eine Spritzenpumpe und eine Spritze vor, befestigen Sie die Spritze an der Spritzenpumpe, verbinden Sie einen Silikonschlauch (0,8 mm Innendurchmesser [ID]) mit einer Spritze und schließen Sie eine Stahlnadel (0,7 mm ID) an der Oberseite des Silikonschlauchs an (Abbildung 3).
9. Führen Sie die Stahlnadel in den Einlass des Mikrofluidik-Chips ein.
10. Platzieren Sie eine Pipettenspitze am Ausgang des Chips, um die PCR-Produkte aufzufangen.

4. Aufbau des CE-Systems

1. Verwenden Sie ein Hochspannungsnetzteil, um ein elektrisches Feld mit gepulstem Feld zu erzeugen. Beachten Sie die positiven und negativen Elektroden.
2. Verwenden Sie eine Quecksilberlampe als Lichtquelle und filtern Sie die Anregungswellenlänge der Quecksilberlampe durch einen Filter.
3. Platzieren Sie die Kapillare auf dem Mikroskoptisch.
4. Sammeln Sie die Fluoreszenzemission mit dem Objektiv und detektieren Sie sie dann mit einer R928-Photomultiplier-Röhre (PMT). Beobachten Sie das Mikroskop und die Kapillare. Schalten Sie das Licht unter dunklen Raumbedingungen ein; Das Anregungslicht wird vom Objektiv gesammelt.
5. Verwenden Sie die selbst entwickelte Software LABVIEW, um die Stromversorgung zu steuern und die Datenerfassung abzuschließen (beschrieben in den Schritten 6.3-6.6). Siehe https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
   HINWEIS: Alle Experimente wurden in einem dunklen Raum durchgeführt, und das Schema des CE-Systems ist in Abbildung 4 dargestellt.

5. Führen Sie die PCR-Lösung aus

1. Stellen Sie die Temperatur der Heizungen des CF-PCR-Systems auf 65 °C und 95 °C ein.
2. Platzieren Sie den Mikrofluidik-Chip auf den beiden Heizblöcken.
3. Führen Sie die Spitze des Silikonröhrchens in ein Zentrifugenröhrchen ein, das 50 μl der PCR-Lösung enthält (aus Schritt 2.3). Ziehen Sie am Kolben der Spritze, um die Lösung langsam herauszuziehen. Befestigen Sie die Spritze auf einer Spritzenpumpe. Führen Sie die Stahlnadel in den Einlass des Mikrofluidik-Chips ein.
4. Stellen Sie die Durchflussrate der Pumpe auf 10 μl/min ein und drücken Sie die Starttaste , um die Lösung in den Mikrokanal am Einlass des Mikrochips zu drücken.
5. Sammeln Sie die PCR-Produkte am Ausgang des Mikrofluidik-Chips.
   HINWEIS: Spülen Sie den Kanal vor und nach der PCR mit Reinstwasser, um Verunreinigungen zu entfernen.

6. Nachweis der PCR-Produkte durch dieses selbst gebaute CE-System

1. Bereiten Sie eine Kapillare mit einer Gesamtlänge von 8 cm und einer effektiven Länge von 6 cm vor.
2. Bereiten Sie den Trennpuffer vor, indem Sie 100 μl 1%ige Hydroxyethylcellulose (HEC, w/v), 2 μl 100x SYBR Green I und 98 μl Reinstwasser mischen, um 0,5 % HEC (w/v) mit 1x SYBR Green I zu erhalten.
3. Füllen Sie die Kapillare mit dem vorbereiteten Trennpuffer unter Verwendung einer Vakuumpumpe.
4. Geben Sie die Injektionsspannung (800 V) und die Injektionszeit (2,0 s) auf der Softwareoberfläche ein, klicken Sie auf die Startschaltfläche und warten Sie, bis die PCR-Produkte mit 100 V/cm (2,0 s) elektrodynamisch in die Kapillare eingebracht werden.
   HINWEIS: In diesem Schritt werden die PCR-Produkte auf die negative Elektrode und der Puffer auf die positive Elektrode gelegt.
5. Geben Sie die Gleichspannung (800 V) auf der Softwareoberfläche ein, klicken Sie auf die Starttaste und führen Sie die Elektrophorese mit einer elektrischen Feldstärke von 100 V/cm durch.
   HINWEIS: In diesem Schritt werden sowohl die positive als auch die negative Elektrode mit Puffer platziert.
6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp , nachdem alle DNA-Fragmente in der Kapillare getrennt wurden.
7. Spülen Sie die Kapillare nach jedem Lauf 1 Minute lang mit sterilisiertem Wasser.

Ergebnisse

Abbildung 5 zeigt das Elektropherogramm der PCR-Produkte und der DNA-Marker. Trace (Abbildung 5A) ist das CE-Ergebnis des CF-PCR-amplifizierten Produkts, Trace (Abbildung 5B) ist das CE-Ergebnis des durch Thermozyklen amplifizierten Produkts und Trace (Abbildung 5C) ist das CE-Ergebnis der 100 bp DNA-Leiter. Wir haben zunächst das Zielgen von E. coli im CF-PCR-System amplifiziert; Die PCR-Lös...

Diskussion

Sowohl PCR als auch CE sind zwei beliebte Biotechnologien in der Analyse von Nukleinsäuren. Dieser Artikel beschreibt die Amplifikation von E. coli und den Nachweis der PCR-Produkte mit den CF-PCR- und CE-Systemen, die beide im eigenen Haus entwickelt wurden. Das Zielgen von E. coli wurde aufgrund der hohen Wärmeübertragungsraten innerhalb von 10 min erfolgreich amplifiziert. Die DNA-Fragmente, die kleiner als 1.500 bp waren, wurden innerhalb von 8 Minuten getrennt (Abbildung 5

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp DNA ladder	Takara Bio Inc.	3422A
10x Fast Buffer I	Takara Bio Inc.	RR070A
10x TBE	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1051
developer solution	Alfa Aesar, USA	L15459
dNTP mixture (2.5 μM)	Takara Bio Inc.	RR070A
EC-F	Sangon Biotech, Shanghai, China
EC-R	Sangon Biotech, Shanghai, China
HEC,1300K	Sigma-Aldrich, USA	9004-62-0
isopropanol	Aladdin, Shanghai, China	67-63-0
microscope	Olympus, Japan	BX51
photolithography	SUSS MicroTec, Germany	MJB4
photomultiplier tube	Hamamatsu Photonics, Japan	R928
photoresist	MicroChem, USA	SU-8 2075
PID temperature controllers	Shanghai, China	XH-W2023
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G-2
polyvinyl pyrrolidone (PVP)	Aladdin, Shanghai, China	P110608
pump	Harvard Apparatus	PHD2000
silicone tubing	BIO-RAD,USA	7318210
solid-state relays	KZLTD, China	KS1-25LA
SpeedSTAR HS DNA Polymerase	Takara Bio Inc.	RR070A
steel needle	zhongxinqiheng,Suzhou,China
SYBR GREEN	Solarbio, Beijing, China	SY1020
temperature sensors	EasyShining Technology, Chengdu, China	TCM-M207
Template (E. coli)	Takara Bio Inc.	AK601
Tween 20	Aladdin, Shanghai, China	T104863
voltage power supply	Medina, NY, USA	TREK MODEL 610E