JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذه المخطوطة، يتم توضيح الحقن تحت الملتحمة كطريقة صالحة لتوصيل النواقل لأنسجة العين في الفئران باستخدام نظام حقن يتكون من مضخة حقنة تسريب/سحب وحقنة قابلة للإزالة محكمة الإغلاق مقترنة بإبر الحقن المجهري. نظام الحقن هذا قابل للتكيف أيضا مع طرق إدارة العين الأخرى.

Abstract

تشمل أمراض العين مجموعة واسعة من الاضطرابات الوراثية والمكتسبة التي تعد أهدافا جذابة لتوصيل الأدوية المحلية نظرا لسهولة الوصول إليها نسبيا عبر طرق إدارة متعددة. توفر الحقن تحت الملتحمة (SCJ) مزايا مقارنة بطرق الإدارة داخل العين الأخرى لأنها بسيطة وآمنة وعادة ما يتم إجراؤها في العيادات الخارجية. عادة ما تتطلب حقن SCJ في الحيوانات الصغيرة مساعدة مجهر التشغيل بسبب حجم العين. أظهرت الأعمال السابقة أن حقن SCJ لأنماط مصلية محددة مرتبطة بالفيروس الغدي (AAV) هو استراتيجية صالحة لتوصيل الجينات للنقل المستهدف لسطح العين وعضلة العين والقرنية والعصب البصري ، مما يوفر نهجا محتملا لعلاج العديد من أمراض العين.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لحقن SCJ في نموذج الماوس باستخدام نظام حقن يتكون من مضخة حقنة قابلة للبرمجة / السحب (والتي تسمح بسرعة وضغط حقن متسقة ودقيقة) وحقنة قابلة للإزالة محكمة الغاز إلى جانب إبر الحقن المجهري. نظام الحقن قابل للتكيف أيضا مع طرق الإدارة الأخرى داخل العين مثل الحقن داخل اللحمة وداخل الكاميرا وداخل الجسم الزجاجي وتحت الشبكية في الحيوانات الصغيرة. على الرغم من وصف توصيل النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي لدراسات العلاج الجيني للعين ، يمكن أيضا تكييف البروتوكول هنا لمجموعة متنوعة من حلول العيون في نماذج الحيوانات الصغيرة. ستتم مناقشة الخطوات العملية الرئيسية في مسار الإدارة ، وإعداد منصة الحقن ، وإعداد الحقن ، ونصائح من التجربة المباشرة بالتفصيل. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم أيضا مناقشة تقنيات التحقق الشائعة لتأكيد تسليم AAV إلى الأنسجة المطلوبة بإيجاز.

Introduction

تشمل أمراض العين مجموعة واسعة من الاضطرابات الوراثية والمكتسبة. في عام 2015، كان ما يقدر بنحو 36 مليون شخص يعانون من العمى القانوني في جميع أنحاء العالم، ويعاني أكثر من مليار شخص من مستوى معين على الأقل من ضعف البصر، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى توسيع نطاق جهود التخفيف على جميع المستويات1. تشمل الطرق الرئيسية لتوصيل أدوية العين كلا من الإدارة الموضعية والمحلية ، مثل قطرات العين أو الحقن تحت الملتحمة (SCJ) ، والحقن داخل الكاميرا ، داخل الجسم الزجاجي ، وتحت الشبكية. على الرغم من أن العلاج الموضعي غير الباضع هو طريقة التوصيل الأكثر شيوعا لأدوية العيون ويستخدم على نطاق واسع للعديد من اضطرابات الجزء الأمامي ، فإن وجود حواجز تشريحية للقرنية يمثل تحديا للتوافر البيولوجي والتوزيع الحيوي وفعالية المواد المدارة موضعيا ، مما يشير إلى أنه قد لا يكون أفضل طريق علاج مرشح للعديد من أمراض العين الداخلية. من المرجح أن يكون الحقن الموضعي في حجرة العين المحددة المتأثرة بالمرض نهجا أكثر فعالية واستهدافالتوصيل الدواء 2. ومع ذلك ، فإن الآثار الضارة الناتجة عن الحقن المتكررة يمكن أن تعقد استراتيجيات الإدارة. من الناحية المثالية ، يجب أن يحافظ العلاج على فعالية علاجية طويلة الأجل بعد إدارة واحدة. وبالتالي ، يعد العلاج الجيني خيارا واعدا لتقليل عدد الحقن المطلوبة وتوفير تعبير جيني محوري مستدام لعلاج مرض العين 3,4.

تتوفر العديد من النواقل الفيروسية وغير الفيروسية للعلاج الجيني. ومع ذلك ، فإن ناقلات AAV ذات أهمية كبيرة بسبب ملف تعريف السلامة الممتاز. AAV هو فيروس DNA صغير ، تقطعت به السبل ، غير مغلف تم اكتشافه في البداية كملوث لإعداد الفيروس الغدي في عام 1965 بواسطة Atchison et al.5,6 تم تصميم AAV لاحقا كناقل فيروسي فعال لتوصيل الجينات في 1980s وأصبح ناقل العلاج الجيني المفضل للعديد من الأمراض ، بما في ذلك اضطرابات العين ، على مدى العقود القليلة الماضية. أبرزها هو أول دواء للعلاج الجيني متاح تجاريا ، voretigene neparvovec ، والذي تمت الموافقة عليه من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية لعلاج داء ليبر الخلقي ، وهو مرض نادر في العين الخلفية. على الرغم من أن voretigene neparvovec قد تغلب بنجاح على الحواجز التي تحول دون التطوير السريري ، إلا أنه لا تزال هناك تحديات أمام تسويق علاجات جينية إضافية للعين. على سبيل المثال ، يتم إعطاء voretigene neparvovec للمرضى الذين يحتفظون بخلايا شبكية قابلة للحياة عن طريق الحقن تحت الشبكية. وبالتالي ، فإن المرضى الذين يعانون من أشكال أكثر تقدما من المرض والذين يفتقرون إلى خلايا شبكية قابلة للحياة غير مؤهلين للعلاج ، لأنه لن يوفر أي فائدة سريرية. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت مضاعفات معروفة مرتبطة بإجراء الحقن تحت الشبكية ، بما في ذلك التهاب العين ، إعتام عدسة العين ، تمزق الشبكية ، اعتلال البقعة ، والألم 7,8. تشمل المخاوف الأخرى المتعلقة بهذا الإجراء إمكانية حدوث نزيف ، وانفصال الشبكية ، والتهاب باطن المقلة ، وإلغاء حالة امتياز المناعة العينية من خلال تدمير أنسجة العين9،10،11،12. وبالتالي ، أصبحت الجهود المبذولة لاستكشاف طرق توصيل الجينات الأقل توغلا مثل حقن SCJ ذات أهمية متزايدة13،14،15،16،17.

الملتحمة عبارة عن غشاء رقيق يحتوي على 3-5 طبقات من الخلايا ويربط العين الأمامية بالجفن الداخلي. تستخدم حقن SCJ سريريا لتوصيل أدوية العيون إلى كل من الأجزاء الأمامية و / أو الخلفية من العين لعلاج أمراض العين مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، والزرق ، والتهاب الشبكية ، والتهاب القزحية الخلفي18,19. إنها بسيطة نسبيا في الأداء ، وتستخدم بشكل روتيني لتوصيل أدوية العيون في العيادات الخارجية20 ، غير مؤلمة إلى حد ما ، ولا تضر بامتياز المناعة العينية ، وتسمح للأدوية المعطاة بالانتشار عبر منطقة كبيرة حول الحجاج تشمل العصب البصري. وبالتالي ، فإن حقن SCJ هي طريقة جذابة للإعطاء لتطبيقات العلاج الجيني AAV. تم سابقا وصف الأنماط المصلية الطبيعية AAV التي يتم إعطاؤها عن طريق حقن SCJ في الفئران من أجل السلامة وكفاءة النقل ومناعة المصل والتوزيع الحيوي وخصوصية الأنسجة13،16،21. أظهرت هذه البيانات أن توصيل الجينات إلى أنسجة العين الفردية عن طريق إدارة SCJ هو احتمال رسمي.

تصف هذه الورقة بروتوكولا بسيطا وقابلا للتكيف لحقن SCJ لتقديم متجهات AAV في نموذج ماوس. لضمان استنساخ هذا النهج ، تم وصف نظام حقن يتكون من مجهر مجسم ، ومضخة حقنة قابلة للبرمجة بالتسريب / السحب (والتي تسمح بسرعة وضغط حقن متسقة ودقيقة) ، وحقنة قابلة للإزالة محكمة الغلق مقترنة بإبر الحقن المجهري. هذا النظام قابل للتكيف مع طرق الإدارة داخل العين الأخرى مثل الحقن داخل اللحمة وداخل الكاميرا وداخل الجسم الزجاجي وتحت الشبكية في الحيوانات الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يتم استخدام صبغة الفلوريسئين للسماح بتصور موقع حقن AAV. ستتم مناقشة الخطوات العملية الرئيسية في مسار الإدارة ، وإعداد منصة الحقن ، وإعداد الحقن ، ونصائح من التجربة المباشرة بالتفصيل. أخيرا ، ستتم مناقشة تقنيات التحقق الشائعة لتأكيد تسليم AAV إلى الأنسجة المطلوبة بإيجاز.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للوائح لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل. استخدام نواقل AAV هو خطر بيولوجي من المستوى 1 للسلامة البيولوجية. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية عند التعامل مع AAV. بالنسبة للتجربة الموصوفة هنا ، تم استخدام ناقل AAV مؤتلف معبأ مع قفيصة النمط المصلي 8 وترميز محفز عام للفيروس المضخم للخلايا في كل مكان (CMV) يتحكم في التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP).

1. معالجة ناقلات AAV وتخزينها

  1. قم بتخزين الفيروس في مجمد -80 درجة مئوية في حصص 100 ميكرولتر في أنابيب طرد مركزي دقيقة من السيليكون أو منخفضة الاحتفاظ.
  2. قم بإذابة جميع محاليل مخزون المتجهات على الجليد قبل الاستخدام.
    ملاحظة: غالبا ما يتم خلط الأصباغ مثل محلول فلوريسئين الصوديوم (بتركيز نهائي 0.1-2٪) مع ناقلات AAV لتصور المحلول المحقون. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد تصور المحاليل المحقونة في اكتشاف فقاعات الهواء ومراقبة توزيع AAV و / أو التسرب بعد الحقن.

2. حقن تحت الملتحمة (SCJ)

  1. تجميع نظام الحقن.
    1. لتجميع نظام الحقن ، ضع مجهرا مجسما ومضخة حقنة في خزانة السلامة البيولوجية.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى مضخة ضخ لإجراء الحقن بدقة عالية. هنا ، يتم استخدام مضخة حقنة قياسية قابلة للبرمجة (انظر جدول المواد) ، والتي تتضمن قبضة محكمة ومشبك حقنة آمن للمحاقن يتراوح حجمها من 0.5 ميكرولتر إلى 60 مل. توفر هذه المضخة أيضا أداء تدفق محسن بدقة عالية ومعدلات تدفق سلسة من 1.28 بيكولتر / دقيقة إلى 88.28 مل / دقيقة.
    2. قطع أنابيب البولي ايثيلين بطول حوالي 50 سم (انظر جدول المواد).
    3. أدخل طرف المحور لإبرة 36 G في أحد طرفي الأنبوب.
      ملاحظة: حرك نهاية محور الإبرة في الأنبوب لمدة ~ 3 مم لضمان عدم حدوث تسرب. يتم استخدام إبرة 36 G لحقن SCJ اللاحق. الإبر التي تتراوح بين 32 جم و 36 جم هي الأحجام الأكثر استخداما لحقن SCJ. يوصى بشدة باستخدام مرقئ للمساعدة في هذه الخطوة لتجنب المخاطر المحتملة لإصابة الأدوات الحادة.
    4. املأ حقنة 3 مل يمكن التخلص منها بالماء المعقم ؛ أدخل هذه المحقنة التي تستخدم لمرة واحدة في جانب الأنبوب المقابل للإبرة واغسل الماء في جميع أنحاء الأنبوب / الإبرة. كرر هذه الخطوة مع 70٪ كحول.
    5. كرر الخطوة 2.1.4 ثلاث مرات أخرى ، بالتناوب مع الشطف بالماء المعقم و 70٪ كحول ، لتطهير الأنبوب وضمان عدم ملاحظة أي تسرب أو انسداد أو تلف في جميع أنحاء الأنبوب.
    6. استخدم المحقنة سعة 3 مل التي تستخدم لمرة واحدة لملء الأنبوب بالماء المعقم واترك الأنبوب متصلا بالمحقنة التي تستخدم لمرة واحدة.
    7. ضع قطعة من البارافيلم على سطح المقعد وأضف بركة من الماء المعقم إليها (~ 1 مل). اغمر جزء الأنبوب المتصل بالإبرة في بركة الماء المعقم. اسحب المحقنة التي تستخدم لمرة واحدة من فتحة الأنبوب في الطرف المقابل لمنع أي هواء من دخول نظام الأنابيب / الإبرة عند إزالة المحقنة. اترك جزء الأنبوب متصلا بالإبرة المغمورة في بركة الماء.
      ملاحظة: قم بتنفيذ الإجراءات من 2.1.4 إلى 2.1.7 في غطاء رقائقي.
    8. املأ حقنة / إبرة هاملتون سعة 10 ميكرولتر بالماء المعقم وتجنب الهواء في المحقنة. قم بتوصيل حقنة / إبرة هاملتون بالطرف المفتوح المتبقي من الأنبوب عن طريق غمر الأنبوب وطرف الإبرة في حقنة هاملتون في بركة المياه المعقمة على البارافيلم.
    9. اضغط على الزر العكسي السريع على شاشة المضخة لتحريك كتلة الدفع إلى الطول التقريبي للمحقنة. قم بفك مقابض تثبيت الدعامة لفك الأقواس المحتجزة على الدافع وكتل حامل المحقنة. قم بتحميل حقنة هاملتون على كتلة حامل المحقنة وقم بتأمين المحقنة باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: لتأمين المحقنة ، يجب أن يكون مشبك برميل المحقنة محكما ضد برميل المحقنة ؛ ومع ذلك ، لا تفرط في التشديد ، خاصة عند استخدام المحاقن الزجاجية. يجب تأمين مكبس المحقنة بواسطة قوس الاحتفاظ بكتلة دافع.
    10. اضبط المعلمات في شاشة إعدادات المضخة.
      1. اضغط على زر القوة ، واضبط مستوى القوة على 30٪. اقبل التغييرات للعودة إلى شاشة الإعدادات .
      2. اضغط على زر البدء السريع وحدد الطريقة | لبث / سحب.
      3. بالنسبة للمحقنة ، حدد Hamilton 1700 ، زجاج ، 10 ميكرولتر. حدد معدل التسريب والسحب وحجم الحقن.
        ملاحظة: يتم ضبط مستوى القوة وفقا لنوع المحقنة / المادة / السعة / الشركات المصنعة ؛ راجع تعليمات الشركة المصنعة للمصنع لمعرفة القوة المقترحة لكل حقنة. كانت سرعة الحقن المستخدمة في هذه التجربة 200 nL / s. حقن SCJ آمنة نسبيا ، وهناك قلق أقل لتحريض ضغط العين المرتفع (IOP) الناتج عن الحقن. غالبا ما تكون سرعة الحقن البطيئة مرغوبة لبعض التطبيقات لتجنب الارتداد إلى الإبرة والحفاظ على الاتساق في الحقن بين الحيوانات.
    11. أخرج الماء من حقنة هاملتون ولكن اترك الأنبوب وإبرة الحقن مليئة بالماء. اسحب حقنة هاملتون قليلا عن طريق الضغط على الزر العكسي لإدخال فقاعة هواء صغيرة في الأنبوب / الإبرة.
      ملاحظة: ستكون فقاعة الهواء بمثابة حاجز بين الماء في الأنبوب والدواء العلاجي (في هذه الحالة ، AAV) ، مما يضمن دقة الجرعة المعطاة.
    12. سحب الفيروس عن طريق وضع إبرة الحقن في حصص من مخزون الفيروس. تأكد من بقاء فقاعة هواء مرئية بين الفيروس والماء في الأنبوب.
      ملاحظة: يمكن أن ترتبط ناقلات AAV بالأنابيب البلاستيكية والإبرة المعدنية ، مما يؤدي إلى فقدان الفيروس و / أو أنظمة الجرعات غير الدقيقة. وبالتالي ، لضمان الدقة والتكرار وجرعة دقيقة من AAV ، يوصى بالطلاء المسبق للأسطح التي تتلامس لاحقا مع AAV. لتغليف نظام الأنبوب / الإبرة بالفيروس ، ارسم محلول الناقل الفيروسي في الأنبوب / الإبرة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح بتشبع ارتباط الفيروس بجدار الإبرة و / أو الأنبوب. تخلص من الفيروس.
  2. حقن الفيروس
    1. تخدير الفأر بالتخدير المستنشق (إيزوفلوران) أو الحقن داخل الصفاق من الكيتامين / الزيلازين / الأسيبرومازين. تأكد من المستوى الجراحي للتخدير من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم الثابت.
      ملاحظة: استخدم إناث و / أو ذكور الفئران C57BL / 6J أو BALB / c التي يبلغ عمرها 6 أسابيع على الأقل. جرعات الكيتامين / الزيلازين / الأسيبرومازين هي كما يلي: الكيتامين عند 70 ملغم / كغم ، الزيلازين عند 7 ملغ / كغ ، والأسيبرومازين عند 1.5 ملغ / كغ.
    2. تطبيق التخدير الموضعي على العين التي ستتلقى الحقن.
      ملاحظة: استخدم 0.1٪ بروباراكائين هيدروكلوريد و / أو محلول تتراكائين هيدروكلوريد للعيون (0.5٪) للتخدير الموضعي.
    3. ضع مرهما موضعيا على العين الأخرى التي لن تتلقى حقنة لمنع الجفاف والإصابة.
    4. ضع الماوس على المسرح المجهري وفضح عين الفأر تحت المجهر المجسم.
    5. ضع إصبعين على الجفن واسحبه قليلا بعيدا عن عين الفأر لكشف الملتحمة ، وهي الغشاء الداخلي الذي يربط الجفن بالصلبة.
    6. الاستيلاء على الملتحمة مع ملقط.
    7. حرر الجفن وأمسك الإبرة بحيث تكون الشطبة متجهة لأعلى باستخدام اليد المهيمنة.
    8. أدخل الإبرة في الملتحمة. أدخل الإبرة حتى يتم تغطية شطبة بالكامل بواسطة غشاء الملتحمة. ضع الإبرة على الكرة الأرضية.
      ملاحظة: نظرا لأن الملتحمة عبارة عن غشاء شفاف ، فإن طرف الإبرة / شطبة يمكن رؤيته بسهولة.
    9. ابدأ الحقن بالضغط على زر البدء باستخدام مفتاح القدم.
      ملاحظة: تتم مزامنة حركة الهواء ومكبس هاملتون ؛ يشير أي تأخير إلى وجود هواء زائد في نظام الحقن أو ربما اتصال فضفاض بين مكونات الأنبوب و / أو الإبرة و / أو المحقنة.
    10. بعد الانتهاء من الحقن ، ثبت الإبرة في مكانها لمدة 10 ثوان قبل سحب الإبرة من الملتحمة لتقليل فرص التدفق العكسي.
      ملاحظة: من الشائع أن تظهر فقاعة في موقع حقن SCJ. عادة ما يتم حل هذه الفقاعات تماما في غضون ساعات قليلة بعد الحقن.
    11. ضع قطرة من جل التشحيم الموضعي على عيني الفأر لمنع جفاف / إصابة العين ، ثم ضع الماوس على وسادة تدفئة للتعافي.
    12. قم بإجراء فحوصات العين مثل إنتاج الدموع ، IOP ، وفحص المصباح الشقي بالتزامن مع تلطيخ القرنية بالفلوريسئين لتقييم تشوهات العين بعد الحقن.
      ملاحظة: يتم قياس إنتاج الدموع عن طريق اختبار خيط الفينول الأحمر ، وغالبا ما يستخدم مقياس توتر العين لفحص IOP لعين الفأر. وتفيد التقارير أن بعض الحقن داخل العين، مثل الحقن داخل الجسم الزجاجي، قد تؤدي إلى زيادة كبيرة في IOP. ومع ذلك ، فإن تغييرات IOP بعد حقن SCJ ليست واضحة13،22،23،24.
  3. AAV التوزيع الحيوي وفحص كفاءة النقل بعد الحقن تحت الملتحمة
    1. للتحقيق في التوزيع الحيوي للجينوم الفيروسي و / أو ملف تعريف النقل لنواقل AAV التي يتم تسليمها عبر SCJ ، قم بالقتل الرحيم للفئران بالطريقة المعتمدة من AVMA.
      ملاحظة: في هذه التجربة ، تم التضحية بالفئران بعد 8 أسابيع من الحقن.
    2. للتوزيع الحيوي والتعبير عن الجينات المحورة في مقصورات العين المستهدفة ، قم بتشريح الأنسجة ذات الصلة ذات الأهمية مثل الجفون والقرنية والملتحمة وعضلة العين والشبكية والعصب البصري. قم بتجميد جميع المناديل الورقية وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية. لفحص التوزيع الحيوي لكامل الجسم AAV ، قم بجمع الأعضاء مثل الغدد الليمفاوية تحت الفك السفلي والكبد ، وقم بتجميدها وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
    3. باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، اجمع gDNA و RNA من نفس العينة لفحص التعبير الجيني المحوري والتوزيع الحيوي AAV ، على التوالي. إذا كان التوزيع الحيوي للناقل فقط مطلوبا ، فاستخدم مجموعة استخراج الحمض النووي لاستخراج gDNA.
    4. قم بإجراء qPCR القياسي و RT-qPCR لتحديد التوزيع الحيوي لنvector AAV ووفرة cDNA باستخدام بادئات / مجسات خاصة بالجينات المحورة 13,25.
    5. لتحليل الأنسجة ، قم بإصلاح العينين ، وتضمينهما في البارافين ، وقسمهما بسمك 5 ميكرومتر. إجراء تلطيخ المناعي القياسي للكشف عن التعبير الجينيالمحورة 26.

النتائج

يظهر المحلول المحقون في الفضاء تحت الملتحمة على شكل فقاعة اعتمادا على حجم الحقن.
في هذه التجربة ، تم حقن 7 ميكرولتر من AAV (7 × 109 جينومات فيروسية (vg) / عين) مختلطة مع الفلوريسئين بتركيز نهائي قدره 0.1٪ بإبرة 36 G تحت مجهر مجسم ، وتم الحفاظ على سرعة الحقن / الضغط ثابتا باستخدام مضخة ح...

Discussion

يحمل العلاج الجيني بوساطة AAV إمكانات كبيرة لعلاج أمراض العين. يعتمد العلاج الجيني العيني الحالي على طريقين رئيسيين للإدارة المحلية ، الحقن داخل الجسم الزجاجي وتحت الشبكية. لسوء الحظ ، كلا الطريقين غازيان ويمكن أن يسببان مضاعفات خطيرة ، بما في ذلك انفصال الشبكية وتشكيل إعتام عدسة العين وا?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون Vector Core في جامعة نورث كارولينا على توفير ناقلات scAAV8-GFP المستخدمة في هذه الدراسة ، و CGIBD Coistology Core ، ومختبر الدكتور Brian C. Gilger لمساعدتهم في جوانب التقييم السريري لهذه الدراسة. تم دعم هذه الدراسة من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه المتميزة في Pfizer-NC Biotech وجائزة التطوير الوظيفي من الجمعية الأمريكية للعلاج الجيني والخلوي ومؤسسة التليف الكيسي. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للجمعية الأمريكية للعلاج الجيني والخلوي أو مؤسسة التليف الكيسي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
36 G NanoFil NeedlesWorld Precision InstrumentsNF36BV-2
AAV vector  University of North Carolina at Chapel Hill  /
AcepromazineHenry ScheinNDC 11695-0079-8
anti-GFP antibodyAVES labs Inc.
Digital cameraCannonCannon EOS T5i
DNA/RNA extraction kitQiagen80204
 ForcepsFine Science ToolsF6521
Hamilton syringeHamilton7654-01
India inkStatLabNC9903975
Ketamine hydrochloride injection solutionHenry ScheinNDC 0409-2051-05
Moisture-resistant filmParafilm807-6
Polyethylene tubingBecton Dickinson and Company427401
Proparacaine 0.1%Bausch Health USNDC 24208-730-06
Rebound tonometerTonovet/
Sodium fluorescein solutionSigma-Aldich46960
Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe PumpHarvard Bioscience70-4504
Stereo microscopyeLeicaMz6
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%Bausch and LombRx only
Topical ointmentGenTealNDC 0078-0429-47
XylazineAkornNDC 59399-110-20
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 ThreadsZONE-QUICKPO6448

References

  1. Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
  2. Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
  3. Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
  4. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  5. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  6. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
  7. Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
  8. Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
  9. Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
  10. Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
  11. Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
  12. Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
  13. Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
  14. Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
  15. Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
  16. Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
  17. Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
  18. Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. Ocular drug delivery. AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).
  19. Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
  20. Stevens, S. Administering a subconjunctival injection. Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).
  21. Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
  22. de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
  23. Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
  24. Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
  25. Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
  26. Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
  27. Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
  28. Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
  29. Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
  30. Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181 AAV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved