작은 동물 모델에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 결막하 투여

요약

이 원고에서 결막 하 주사는 주입 / 회수 주사기 펌프와 미세 주입 바늘과 결합 된 기밀 제거 가능한 주사기로 구성된 주사 시스템을 사용하여 마우스의 안구 조직에 대한 유효한 벡터 전달 방법으로 입증됩니다. 이 주사 시스템은 다른 안내 내 투여 경로에도 적용 가능합니다.

초록

안구 질환에는 여러 투여 경로를 통한 접근성이 상대적으로 쉽기 때문에 지역 약물 전달의 매력적인 표적이 되는 광범위한 유전 유전 및 후천성 장애가 포함됩니다. 결막하(SCJ) 주사는 간단하고 안전하며 일반적으로 외래 환자 환경에서 수행되기 때문에 다른 안내 투여 경로에 비해 이점을 제공합니다. 작은 동물에서 SCJ 주사는 일반적으로 눈의 크기 때문에 수술 현미경의 도움이 필요합니다. 이전 연구는 특정 아데노 관련 바이러스(AAV) 혈청형의 SCJ 주사가 안구 표면, 눈 근육, 각막 및 시신경의 표적 형질도입을 위한 유효한 유전자 전달 전략임을 입증하여 많은 안구 질환 치료를 위한 잠재적인 접근 방식을 제공합니다.

여기에서, 프로그램가능한 주입/회수 주사기 펌프(일관되고 정확한 주입 속도 및 압력을 허용함) 및 미세주입 바늘과 결합된 기밀 제거 가능한 주사기로 구성된 주입 시스템을 사용하는 마우스 모델에서 SCJ 주입에 대한 상세한 프로토콜이 제시된다. 주사 시스템은 또한 작은 동물에서 기질내, 전방내, 유리체내 및 망막하 주사와 같은 다른 안구내 투여 경로에 적응할 수 있습니다. 안구 유전자 요법 연구를 위한 아데노-관련 바이러스 벡터의 전달이 기재되어 있지만, 본원의 프로토콜은 또한 작은 동물 모델에서 다양한 안과용 용액에 대해 적응될 수 있다. 관리 경로의 주요 실제 단계, 주입 플랫폼 설정, 주입 준비 및 직접 경험의 팁에 대해 자세히 설명합니다. 또한, 원하는 조직으로의 AAV 전달 확인을 위한 일반적인 검증 기술도 간략하게 논의될 것이다.

서문

안구 질환은 광범위한 유전 및 후천성 질환을 포함합니다. 2015년에는 전 세계적으로 약 3,600만 명이 법적으로 시각 장애가 있었고 10억 명이 넘는 사람들이 적어도 일정 수준의 시각 장애를 앓고 있어^{모든 수준에서 완화} 노력을 확대해야 할 필요성이 강조되었습니다1. 안구 약물을 전달하는 주요 방법에는 점안액 또는 결막하 (SCJ), 전방 내, 유리체 내 및 망막 하 주사와 같은 국소 및 국소 투여가 포함됩니다. 비침습적 국소 요법이 안과 약물의 가장 일반적인 전달 방법이며 많은 전방 분절 장애에 광범위하게 사용되지만, 각막 해부학적 장벽의 존재는 국소 투여 물질의 생체 이용률, 생체 분포 및 효능에 대한 도전을 제시하며, 이는 내안의 많은 질병에 대한 최상의 후보 치료 경로가 아닐 수 있음을 시사합니다. 질병의 영향을 받는 특정 안구 구획으로의 국소 주사는 보다 효과적이고 표적화된 약물^{전달 접근법일} 가능성이 높습니다2. 그러나 반복 주사로 인한 부작용은 투여 전략을 복잡하게 만들 수 있습니다. 이상적으로, 치료는 단일 투여 후 장기적인 치료 효능을 유지해야 합니다. 따라서, 유전자 요법은 필요한 주사의 수를 최소화하고 안구 질환 ^3,4의 치료를 위한 지속적인 전이유전자 발현을 제공하기 위한 유망한 옵션이다.

수많은 바이러스 및 비바이러스 벡터가 유전자 치료에 사용할 수 있습니다. 그러나 AAV 벡터는 우수한 안전성 프로파일로 인해 높은 관심을 받고 있습니다. AAV는 1965년 Atchison et ^al.5,6에 의해 아데노바이러스 제제의 오염 물질로 처음 발견된 작은 단일 가닥의 비외피 DNA 바이러스입니다. AAV는 이후 1980년대에 유전자 전달을 위한 효율적인 바이러스 벡터로 설계되었으며 안구 질환을 포함한 많은 질병에 대해 선택되는 유전자 치료 벡터가 되었습니다. 지난 수십 년 동안. 이들 중 가장 주목할만한 것은 희귀 후방 안과 질환 인 Leber의 선천성 Amaurosis를 치료하기 위해 미국 식품의 약국 (FDA)의 승인을 받은 최초의 상업적으로 이용 가능한 유전자 치료 약물 인 voretigene neparvovec입니다. 보레티진 네파보벡이 임상 개발의 장벽을 성공적으로 극복했지만 추가적인 안구 유전자 요법의 상용화에 대한 과제가 남아 있습니다. 예를 들어, voretigene neparvovec은 망막 하 주사를 통해 생존 가능한 망막 세포를 보유하는 환자에게 투여됩니다. 따라서 생존 가능한 망막 세포가 부족한 더 진행된 형태의 질병을 가진 환자는 임상 적 이점을 제공하지 않기 때문에 치료를받을 자격이 없습니다. 또한 눈 염증, 백내장, 망막 파열, 황반 병증 및 통증 ^7,8을 포함하여 망막 하 주사 절차와 관련된 알려진 합병증이 관찰되었습니다. 이 절차와 관련된 다른 우려 사항으로는 출혈, 망막 박리, 안구 내염 및 안구 조직 파괴를 통한 안구 면역 특권 상태의 취소 가능성이 있습니다 9,10,11,12. 따라서, SCJ 주사와 같은 덜 침습적인 유전자 전달 경로를 탐구하려는 노력이 점점 더 중요해지고 있다 13,14,15,16,17.

결막은 3-5 층의 세포를 포함하고 앞쪽 눈을 내부 눈꺼풀에 연결하는 얇은 막입니다. SCJ 주사는 연령 관련 황반 변성, 녹내장, 망막염 및 후방 포도막염과 같은 안구 질환의 치료를 위해 눈의 전방 및/또는 후방 부분 모두에 안과 약물 전달을 위해 임상적으로 사용됩니다^18,19. 이들은 수행하기가 비교적 간단하고, 외래 환자 환경(²⁰)에서 안과 약물 전달을 위해 일상적으로 사용되며, 다소 통증이 없고, 안구 면역 특권을 손상시키지 않으며, 투여된 약물이 시신경을 둘러싸는 넓은 안와 주위 영역을 통해 확산되도록 한다. 따라서 SCJ 주사는 AAV 유전자 치료 응용 분야에 매력적인 투여 경로입니다. 마우스에서 SCJ 주사를 통해 투여된 천연 AAV 혈청형은 이전에 안전성, 형질도입 효율, 혈청 면역원성, 생체분포 및 조직 특이성^13,16,21에 대해 특성화되었다. 이러한 데이터는 SCJ 투여를 통한 개별 안구 조직으로의 유전자 전달이 공식적인 가능성임을 입증했습니다.

이 백서에서는 마우스 모델에서 AAV 벡터를 전달하기 위한 SCJ 주입을 위한 간단하고 적응 가능한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 접근법의 재현성을 보장하기 위해 실체 현미경, 프로그래밍 가능한 주입/회수 주사기 펌프(일관되고 정확한 주입 속도 및 압력 허용) 및 미세 주입 바늘과 결합된 기밀 제거 가능한 주사기로 구성된 주입 시스템이 설명됩니다. 이 시스템은 작은 동물의 기질 내, 전방 내, 유리체 내 및 망막 하 주사와 같은 다른 안내 내 투여 경로에 적용 할 수 있습니다. 또한, 플루오레세인 염료는 종종 AAV 주사 부위의 시각화를 허용하기 위해 활용된다. 관리 경로의 주요 실제 단계, 주입 플랫폼 설정, 주입 준비 및 직접 경험의 팁에 대해 자세히 설명합니다. 마지막으로, 원하는 조직으로의 AAV 전달을 확인하기 위한 일반적인 검증 기술에 대해 간략하게 논의할 것이다.

프로토콜

모든 동물 절차는 채플 힐에있는 노스 캐롤라이나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 규정에 따라 수행되었습니다. AAV 벡터의 사용은 생물안전 레벨 1 생물학적 위험 위험입니다. AAV를 취급할 때는 실험실 코트, 장갑 및 고글을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 본원에 기재된 실험을 위해, 혈청형 8 캡시드로 패키징되고 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 조절하는 일반적인 유비쿼터스 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 코딩하는 재조합 AAV 벡터를 활용하였다.

1. AAV 벡터 처리 및 저장

1. 바이러스를 -80°C 냉동고의 100μL 분취량으로 실리콘화 또는 저머무름 미세 원심분리 튜브에 보관하십시오.
2. 사용하기 전에 모든 벡터 스톡 용액을 얼음에서 해동하십시오.
   참고: 나트륨 플루오레세인 용액(최종 농도 0.1-2%)과 같은 염료는 종종 주입된 용액을 시각화하기 위해 AAV 벡터와 혼합됩니다. 또한 주입된 용액의 시각화는 기포를 감지하고 주입 후 AAV 분포 및/또는 누출을 모니터링하는 데 도움이 됩니다.

2. 결막하 (SCJ) 주사

1. 사출 시스템을 조립하십시오.
   1. 주입 시스템을 조립하려면 실체 현미경과 주사기 펌프를 생물 안전 캐비닛에 넣으십시오.
      알림: 주입 펌프는 높은 정밀도로 주입을 수행하는 데 필요합니다. 여기에서는 0.5μL에서 60mL 범위의 주사기를 위한 단단한 그립과 안전한 주사기 클램프를 포함하는 표준 주입/회수 프로그래밍 가능한 주사기 펌프( 재료 표 참조)가 사용됩니다. 이 펌프는 또한 1.28 pl / min에서 88.28 ml / min까지 높은 정확도와 부드러운 유량으로 향상된 유량 성능을 제공합니다.
   2. 폴리에틸렌 튜브를 약 50cm 길이로 자릅니다 ( 재료 표 참조).
   3. 36G 바늘의 허브 끝을 튜브의 끝 중 하나에 삽입합니다.
      알림: 누출이 발생하지 않도록 니들 허브 끝을 ~3mm 동안 튜브에 밀어 넣습니다. 36G 바늘은 후속 SCJ 주사에 사용됩니다. 32G에서 36G 사이의 바늘은 SCJ 주사에 가장 일반적으로 사용되는 크기입니다. 날카로운 부상의 잠재적 위험을 피하기 위해 이 단계를 돕기 위해 지혈제를 사용하는 것이 좋습니다.
   4. 일회용 3mL 주사기에 멸균수를 채웁니다. 이 일회용 주사기를 바늘 반대쪽 튜브 측면에 삽입하고 튜브/바늘 전체에 물을 씻어냅니다. 70 % 알코올로이 단계를 반복하십시오.
   5. 2.1.4단계를 세 번 더 반복하여 멸균수와 70% 알코올로 번갈아 씻어 튜브를 소독하고 튜브 전체에 누출, 막힘 또는 손상이 관찰되지 않도록 합니다.
   6. 일회용 3mL 주사기를 사용하여 튜브에 멸균수를 채우고 튜브를 일회용 주사기에 부착된 상태로 둡니다.
   7. 벤치 표면에 파라필름 조각을 놓고 멸균수 풀(~1mL)을 추가합니다. 바늘에 연결된 튜브 부분을 멸균 수 웅덩이에 담그십시오. 주사기를 제거할 때 공기가 튜브/바늘 시스템으로 들어가는 것을 방지하기 위해 반대쪽 끝에 있는 튜브 구멍에서 일회용 주사기를 당겨 빼냅니다. 바늘에 연결된 튜브 부분을 물 웅덩이에 잠긴 상태로 두십시오.
      주: 층류 후드에서 2.1.4 - 2.1.7 절차를 수행하십시오.
   8. 10μL 해밀턴 주사기/바늘에 멸균수를 채우고 주사기 내부의 공기를 피하십시오. 해밀턴 주사기의 튜브와 바늘 끝을 파라필름의 멸균수 풀에 담그어 해밀턴 주사기/바늘을 튜브의 나머지 열린 끝에 연결합니다.
   9. 펌프 화면의 빠른 역방향 버튼을 눌러 푸셔 블록을 주사기의 대략적인 길이로 이동합니다. 브래킷 클램핑 손잡이를 풀어 푸셔와 주사기 홀더 블록의 고정 브래킷을 풉니다. Hamilton 주사기를 주사기 홀더 블록에 넣고 제조업체의 지침에 따라 주사기를 고정합니다.
      알림: 주사기를 고정하려면 주사기 배럴 cl이 cl을 조여야합니다.amp 주사기 배럴에 밀착해야합니다. 그러나 특히 유리 주사기를 사용할 때는 과도하게 조이지 마십시오. 주사기 플런저는 푸셔 블록 고정 브래킷으로 고정해야 합니다.
   10. 펌프 설정 화면에서 매개변수를 조정합니다.
       1. 힘 버튼을 누르고 힘 수준을 30%로 설정합니다. 변경 사항을 수락하여 설정 화면으로 돌아갑니다.
       2. 빠른 시작 버튼을 누르고 방법 | 선택합니다. 주입/철회.
       3. 주사기의 경우 Hamilton 1700, 유리, 10 μL를 선택합니다. 주입 및 회수 속도와 주입량을 선택합니다.
          알림: 힘 수준은 주사기 유형/재료/용량/제조업체에 따라 설정됩니다. 각 주사기에 대한 제안된 힘에 대해서는 공장 제조업체 지침을 참조하십시오. 이 실험에 사용된 사출 속도는 200nL/s였습니다. SCJ 주사는 비교적 안전하며 주사로 인한 안압 상승(IOP) 유도에 대한 우려가 적습니다. 더 느린 주입 속도는 종종 바늘로의 역류를 피하고 동물 사이의 주사의 일관성을 유지하기 위해 특정 응용 분야에서 바람직합니다.
   11. 해밀턴 주사기에서 물을 배출하되 튜브와 주사 바늘에 물을 가득 채운 상태로 두십시오. 역방향 버튼을 눌러 해밀턴 주사기를 약간 뒤로 당겨 튜브/바늘에 작은 기포를 넣습니다.
       알림: 기포는 튜브의 물과 치료 약물(이 경우 AAV) 사이의 장벽 역할을 하여 투여된 용량의 정확성을 보장합니다.
   12. 주사 바늘을 바이러스 스톡의 분취량에 넣어 바이러스를 회수하십시오. 바이러스와 튜브의 물 사이에 눈에 보이는 기포가 남아 있는지 확인하십시오.
       알림: AAV 벡터는 플라스틱 튜브 및 금속 바늘에 결합하여 바이러스 손실 및/또는 부정확한 투여 요법을 초래할 수 있습니다. 따라서 AAV의 엄격함, 재현성 및 정확한 투여량을 보장하기 위해 이후에 AAV와 접촉하는 표면을 사전 코팅하는 것이 좋습니다. 튜브/바늘 시스템을 바이러스로 코팅하려면 바이러스 벡터 용액을 튜브/바늘에 넣고 바늘 및/또는 튜브의 벽에 바이러스 결합이 포화되도록 실온에서 10분 동안 배양합니다. 바이러스를 폐기하십시오.
2. 바이러스 주입
   1. 흡입 마취 (이소 플루 란) 또는 케타민 / 자일 라진 / 아세프로 마진의 복강 주사로 마우스를 마취하십시오. 단단한 발가락 핀치에 대한 반응이 부족하여 마취의 수술 평면을 확인하십시오.
      참고: 최소 6주 된 암컷 및/또는 수컷 C57BL/6J 또는 BALB/c 마우스를 사용하십시오. 케타민 / 자일 라진 / 아세 프로 마진 용량은 다음과 같습니다 : 케타민 70mg / kg, 자일 라진 7mg / kg, 아세프로 마진 1.5mg / kg.
   2. 주사를받을 눈에 국소 마취를 적용하십시오.
      알림: 국소 마취에는 0.1% 프로파라카인 염산염 및/또는 테트라카인 염산염 안액(0.5%)을 사용하십시오.
   3. 건조와 부상을 방지하기 위해 주사를받지 않는 다른 쪽 눈에 국소 연고를 바르십시오.
   4. 마우스를 현미경 스테이지에 놓고 실체 현미경 아래에 마우스 눈을 노출시킵니다.
   5. 눈꺼풀에 두 손가락을 대고 마우스 눈에서 약간 당겨 눈꺼풀과 공막을 연결하는 내막 인 결막을 노출시킵니다.
   6. 집게로 결막을 잡으십시오.
   7. 눈꺼풀을 풀고 주로 사용하는 손을 사용하여 경사가 위쪽을 향하도록 바늘을 잡습니다.
   8. 바늘을 결막에 삽입하십시오. 경사가 결막막으로 완전히 덮일 때까지 바늘을 삽입하십시오. 지구에 바늘을 대십시오.
      알림: 결막은 투명한 막이므로 바늘 끝 / 경사가 쉽게 보입니다.
   9. 풋스위치를 사용하여 시작 버튼을 눌러 주입을 시작합니다.
      알림: 공기의 움직임과 해밀턴 플런저가 동기화됩니다. 지연은 주입 시스템의 과도한 공기 또는 튜브, 바늘 및/또는 주사기 구성 요소 간의 느슨한 연결을 나타냅니다.
   10. 주사가 끝나면 결막에서 바늘을 빼기 전에 바늘을 10 초 동안 제자리에 고정하여 역류 가능성을 줄입니다.
       알림: SCJ 주사 부위에 블렙이 나타나는 것이 일반적입니다. 이러한 블렝은 일반적으로 주사 후 몇 시간 이내에 완전히 해결됩니다.
   11. 국소 윤활제 젤을 마우스의 눈에 떨어뜨려 안구 건조/부상을 예방한 다음 마우스를 가열 패드에 올려 회복시킵니다.
   12. 주사 후 안구 이상을 평가하기 위해 각막 플루오레세인 염색과 함께 눈물 생성, IOP 및 슬릿 램프 검사와 같은 안구 검사를 수행합니다.
       알림: 눈물 생성은 페놀 레드 스레드 테스트로 측정되며 안압계는 종종 마우스 눈의 IOP를 검사하는 데 사용됩니다. 유리체 내 주사와 같은 일부 안내 주사는 안압의 상당한 증가를 초래할 수 있다고보고되었습니다. 그러나, SCJ 주입 후의 IOP 변화는 명백하지 않다 ^13,22,23,24.
3. 결막하 주사 후 AAV 생체분포 및 형질도입 효율 검사
   1. SCJ를 통해 전달된 AAV 벡터의 바이러스 게놈 생물분포 및/또는 형질도입 프로파일을 조사하기 위해, AVMA 승인 방법으로 마우스를 안락사시킨다.
      참고: 이 실험에서, 마우스는 주사 후 8주 동안 희생되었다.
   2. 표적 안구 구획에서 생체 분포 및 전이 유전자 발현을 위해 눈꺼풀, 각막, 결막, 눈 근육, 망막 및 시신경과 같은 관련 관심 조직을 해부합니다. 모든 조직을 급속 동결하고 -80°C에서 보관한다. 전신 AAV 생체 분포를 검사하려면 턱밑 림프절 및 간과 같은 장기를 수집하고 급속 동결하여 -80 ° C에서 보관하십시오.
   3. DNA/RNA 추출 키트를 사용하여 동일한 샘플에서 gDNA와 RNA를 수집하여 각각 전이유전자 발현과 AAV 생체분포를 검사합니다. 벡터 생체 분포만 필요한 경우 DNA 추출 키트를 사용하여 gDNA를 추출하십시오.
   4. 벡터 전이유전자 특이적 프라이머/프로브^13,25를 사용하여 AAV 벡터 생체분포 및 cDNA 풍부도를 결정하기 위해 표준 qPCR 및 RT-qPCR을 수행합니다.
   5. 조직학 분석을 위해 눈을 고정하고 파라핀에 삽입하고 5μm 두께로 절편하십시오. 표준 면역형광 염색을 수행하여 전이유전자 발현²⁶을 밝혀냅니다.

결과

결막 하 공간에 주입 된 용액은 주입 부피에 따라 bleb으로 나타납니다.
본 실험에서는 최종 농도 0.1%의 플루오레세인과 혼합된 AAV(7 × 10^{9 바이러스} 게놈(vg)/눈) 7μL를 실체현미경으로 36G 바늘로 주입하고, 프로그래밍 가능한 주사기 펌프를 사용하여 주입 속도/압력을 1μL/s로 일정하게 유지하였다. 주입시 블렙이 나타날 수 있습니다 (화살표). 뮤린 SCJ 구획에 투여된 AAV 벡터의...

토론

AAV 매개 유전자 치료는 안구 질환 치료에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 현재의 안구 유전자 치료는 두 가지 주요 국소 투여 경로인 유리체내 및 망막하 주사에 의존합니다. 불행히도 두 경로 모두 침습적이며 망막 박리, 백내장 형성 및 안구내염을 포함한 심각한 합병증을 유발할 수 있습니다. 따라서 SCJ 주사와 같이 상대적으로 덜 침습적 인 경로에 대한 조사는 큰 관심사입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
36 G NanoFil Needles	World Precision Instruments	NF36BV-2
AAV vector	University of North Carolina at Chapel Hill	/
Acepromazine	Henry Schein	NDC 11695-0079-8
anti-GFP antibody	AVES labs Inc.
Digital camera	Cannon	Cannon EOS T5i
DNA/RNA extraction kit	Qiagen	80204
Forceps	Fine Science Tools	F6521
Hamilton syringe	Hamilton	7654-01
India ink	StatLab	NC9903975
Ketamine hydrochloride injection solution	Henry Schein	NDC 0409-2051-05
Moisture-resistant film	Parafilm	807-6
Polyethylene tubing	Becton Dickinson and Company	427401
Proparacaine 0.1%	Bausch Health US	NDC 24208-730-06
Rebound tonometer	Tonovet	/
Sodium fluorescein solution	Sigma-Aldich	46960
Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Bioscience	70-4504
Stereo microscopye	Leica	Mz6
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%	Bausch and Lomb	Rx only
Topical ointment	GenTeal	NDC 0078-0429-47
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads	ZONE-QUICK	PO6448