Administración subconjuntival de vectores de virus adenoasociados en modelos de animales pequeños

Resumen

En este manuscrito, la inyección subconjuntival se demuestra como un método válido de administración de vectores para tejidos oculares en ratones utilizando un sistema de inyección que consiste en una bomba de jeringa de infusión/extracción y una jeringa extraíble hermética al gas acoplada con agujas de microinyección. Este sistema de inyección también es adaptable para otras vías de administración intraocular.

Resumen

Las enfermedades oculares incluyen una amplia gama de trastornos genéticos y adquiridos hereditarios que son objetivos atractivos para la administración local de fármacos debido a su relativa facilidad de acceso a través de múltiples vías de administración. Las inyecciones subconjuntivales (SCJ) ofrecen ventajas sobre otras vías de administración intraocular, ya que son simples, seguras y generalmente se realizan en un entorno ambulatorio. Las inyecciones de SCJ en animales pequeños generalmente requieren la asistencia de un microscopio quirúrgico debido al tamaño del ojo. Trabajos previos han demostrado que la inyección SCJ de serotipos específicos de virus adenoasociados (AAV) es una estrategia válida de administración de genes para la transducción dirigida de la superficie ocular, el músculo ocular, la córnea y el nervio óptico, proporcionando un enfoque potencial para el tratamiento de muchas enfermedades oculares.

En este documento, se presenta un protocolo detallado para las inyecciones de SCJ en un modelo de ratón utilizando un sistema de inyección que consiste en una bomba de jeringa de infusión/extracción programable (que permite una velocidad y presión de inyección consistentes y precisas) y una jeringa extraíble hermética al gas junto con agujas de microinyección. El sistema de inyección también es adaptable para otras vías de administración intraocular, como inyecciones intrastromales, intracamerales, intravítreas y subretinianas en animales pequeños. Aunque se describe la administración de vectores virales adenoasociados para estudios de terapia génica ocular, el protocolo aquí incluido también se puede adaptar para una variedad de soluciones oftálmicas en modelos de animales pequeños. Los pasos prácticos clave en la ruta de administración, la configuración de la plataforma de inyección, la preparación de la inyección y los consejos de la experiencia directa se discutirán en detalle. Además, también se discutirán brevemente las técnicas comunes de validación para la confirmación de la entrega de AAV a los tejidos deseados.

Introducción

Las enfermedades oculares abarcan una amplia gama de trastornos genéticos y adquiridos. En 2015, se estima que 36 millones de personas eran legalmente ciegas en todo el mundo, y más de 1.000 millones de personas sufren de al menos algún nivel de discapacidad visual, lo que destaca la necesidad de ampliar los esfuerzos de alivio en todos los niveles¹. Los principales métodos para administrar medicamentos oculares incluyen la administración tópica y local, como gotas para los ojos o inyecciones subconjuntivales (SCJ), intracamerales, intravítreas y subretinianas. Aunque la terapia tópica no invasiva es el método de administración más común para los fármacos oftálmicos y se usa ampliamente para muchos trastornos del segmento anterior, la presencia de barreras anatómicas corneales presenta un desafío para la biodisponibilidad, biodistribución y eficacia de las sustancias administradas tópicamente, lo que sugiere que puede no ser la mejor ruta de tratamiento candidata para muchas enfermedades del ojo interno. Es probable que la inyección local en el compartimiento ocular específico afectado por la enfermedad sea un enfoque de administración de fármacos más eficaz y dirigido². Sin embargo, los efectos adversos resultantes de las inyecciones repetidas pueden complicar las estrategias de administración. Idealmente, una terapia debe mantener la eficacia terapéutica a largo plazo después de una sola administración. Por lo tanto, la terapia génica es una opción prometedora para minimizar el número de inyecciones requeridas y proporcionar una expresión transgénica sostenida para el tratamiento de la enfermedad ocular ^3,4.

Numerosos vectores virales y no virales están disponibles para la terapia génica; sin embargo, los vectores AAV son de gran interés debido a su excelente perfil de seguridad. AAV es un virus de ADN pequeño, monocatenario y sin envoltura que fue descubierto inicialmente como contaminante de una preparación de adenovirus en 1965 por Atchison et ^al.5,6 AAV fue posteriormente diseñado como un vector viral eficiente para la entrega de genes en la década de 1980 y se ha convertido en el vector de terapia génica de elección para muchas enfermedades^, incluidos los trastornos oculares. en las últimas décadas. El más notable de ellos es el primer fármaco de terapia génica disponible comercialmente, voretigene neparvovec, que fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para tratar la amaurosis congénita de Leber, una rara enfermedad ocular posterior. Aunque voretigene neparvovec ha superado con éxito las barreras para el desarrollo clínico, sigue habiendo desafíos para la comercialización de terapias génicas oculares adicionales. Por ejemplo, voretigene neparvovec se administra a pacientes que retienen células retinianas viables mediante inyección subretiniana. Por lo tanto, los pacientes con formas más avanzadas de la enfermedad que carecen de células retinianas viables no son elegibles para el tratamiento, ya que no proporcionaría ningún beneficio clínico. Además, se observaron complicaciones conocidas asociadas con el procedimiento de inyección subretiniana, incluyendo inflamación ocular, cataratas, lagrimeo retiniano, maculopatía y dolor ^7,8. Otras preocupaciones relacionadas con este procedimiento incluyen la posibilidad de hemorragia, desprendimiento de retina, endoftalmitis y revocación del estado inmune privilegiado ocular a través de la destrucción del tejido ocular 9,10,11,12. Por lo tanto, los esfuerzos para explorar rutas de administración de genes menos invasivas, como la inyección de SCJ, se han vuelto cada vez más importantes 13,14,15,16,17.

La conjuntiva es una membrana delgada que contiene 3-5 capas de células y conecta el ojo anterior con el párpado interior. Las inyecciones de SCJ se utilizan clínicamente para la administración de fármacos oftálmicos a los segmentos anterior y/o posterior del ojo para el tratamiento de enfermedades oculares como la degeneración macular asociada a la edad, glaucoma, retinitis y uveítis posterior^18,19. Son relativamente simples de realizar, empleados rutinariamente para la administración de fármacos oftálmicos en un entorno ambulatorio²⁰, algo indoloros, no comprometen el privilegio inmune ocular y permiten que los fármacos administrados se propaguen a través de una gran región periorbitaria que abarca el nervio óptico. Por lo tanto, las inyecciones de SCJ son una vía de administración atractiva para las aplicaciones de terapia génica AAV. Los serotipos naturales de AAV administrados mediante inyección de SCJ en ratones han sido previamente caracterizados por su seguridad, eficiencia de transducción, inmunogenicidad sérica, biodistribución y especificidad tisular^13,16,21. Estos datos demostraron que la administración de genes a tejidos oculares individuales a través de la administración de SCJ es una posibilidad formal.

Este documento describe un protocolo simple y adaptable para la inyección de SCJ para entregar vectores AAV en un modelo de ratón. Para garantizar la reproducibilidad de este enfoque, se describe un sistema de inyección que consiste en un estereomicroscopio, una bomba de jeringa de infusión/extracción programable (que permite una velocidad y presión de inyección consistentes y precisas) y una jeringa extraíble hermética al gas junto con agujas de microinyección. Este sistema es adaptable para otras vías de administración intraocular como inyecciones intraestromales, intracamerales, intravítreas y subretinianas en animales pequeños. Además, a menudo se utiliza un tinte fluoresceína para permitir la visualización del sitio de inyección de AAV. Los pasos prácticos clave en la ruta de administración, la configuración de la plataforma de inyección, la preparación de la inyección y los consejos de la experiencia directa se discutirán en detalle. Finalmente, se discutirán brevemente las técnicas de validación comunes para la confirmación de la administración de AAV a los tejidos deseados.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. El uso de vectores AAV es un riesgo de riesgo biológico de nivel 1 de bioseguridad. Use el equipo de protección personal adecuado, incluida una bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras cuando manipule AAV. Para el experimento descrito en la presente invención, se utilizó un vector AAV recombinante empaquetado con la cápside del serotipo 8 y que codifica un promotor genérico de citomegalovirus ubicuo (CMV) que controla la expresión de la proteína de fluorescencia verde (GFP).

1. Manipulación y almacenamiento de vectores AAV

1. Conservar el virus en un congelador a -80 °C en alícuotas de 100 μL en tubos de microcentrífuga siliconados o de baja retención.
2. Descongele todas las soluciones madre vectoriales en hielo antes de usarlas.
   NOTA: Los colorantes como la solución de fluoresceína de sodio (a una concentración final de 0.1-2%) a menudo se mezclan con los vectores AAV para visualizar la solución inyectada. Además, la visualización de las soluciones inyectadas ayuda a detectar burbujas de aire y monitorear la distribución y / o fuga de AAV después de la inyección.

2. Inyección subconjuntival (SCJ)

1. Montar el sistema de inyección.
   1. Para montar el sistema de inyección, coloque un estereomicroscopio y una bomba de jeringa en un gabinete de bioseguridad.
      NOTA: Se necesita una bomba de infusión para realizar inyecciones con alta precisión. En este documento, se utiliza una bomba de jeringa programable de infusión/extracción estándar (consulte la Tabla de materiales), que incluye un agarre hermético y una abrazadera de jeringa segura para jeringas que varían en volumen de 0.5 μL a 60 ml. Esta bomba también ofrece un rendimiento de flujo mejorado con alta precisión y caudales suaves de 1,28 pl/min a 88,28 ml/min.
   2. Corte el tubo de polietileno a una longitud de aproximadamente 50 cm (consulte la Tabla de materiales).
   3. Inserte el extremo del cubo de una aguja de 36 G en uno de los extremos del tubo.
      NOTA: Deslice el extremo del cubo de la aguja en el tubo durante ~ 3 mm para asegurarse de que no se produzcan fugas. La aguja de 36 G se utiliza para la inyección posterior de SCJ. Las agujas que oscilan entre 32 G y 36 G son los tamaños más utilizados para las inyecciones de SCJ. El uso de un hemostático para ayudar a este paso es muy recomendable para evitar el riesgo potencial de lesiones por objetos cortopunzantes.
   4. Llene una jeringa desechable de 3 ml con agua estéril; Inserte esta jeringa desechable en el lado del tubo opuesto a la aguja y enjuague el agua por todo el tubo/aguja. Repita este paso con alcohol al 70%.
   5. Repita el paso 2.1.4 tres veces más, alternando descargas con agua estéril y alcohol al 70%, para desinfectar la tubería y asegurarse de que no se observen fugas, obstrucciones o daños en toda la tubería.
   6. Use la jeringa desechable de 3 ml para llenar el tubo con agua estéril y deje el tubo conectado a la jeringa desechable.
   7. Coloque un trozo de parafilm en la superficie del banco y agréguele un charco de agua estéril (~ 1 ml). Sumerja la porción del tubo conectada a la aguja en el charco de agua estéril. Saque la jeringa desechable de la abertura del tubo en el extremo opuesto para evitar que entre aire en el sistema de tubos/agujas al retirar la jeringa. Deje la parte del tubo conectada a la aguja sumergida en el charco de agua.
      NOTA: Realice los procedimientos 2.1.4 a 2.1.7 en una campana laminar.
   8. Llene una jeringa/aguja Hamilton de 10 μL con agua estéril y evite la entrada de aire en la jeringa. Conecte la jeringa/aguja Hamilton al extremo abierto restante del tubo sumergiendo el tubo y la punta de la aguja de la jeringa Hamilton en el charco de agua estéril del parafilm.
   9. Pulse el botón de retroceso rápido en la pantalla de la bomba para mover el bloque del empujador a la longitud aproximada de la jeringa. Desenrosque las perillas de sujeción del soporte para aflojar los soportes de retención en el empujador y los bloques del soporte de la jeringa. Cargue la jeringa Hamilton en el bloque del soporte de la jeringa y asegúrela siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Para asegurar la jeringa, la abrazadera del cilindro de la jeringa debe estar apretada contra el cilindro de la jeringa; Sin embargo, no apriete demasiado, especialmente cuando use jeringas de vidrio. El émbolo de la jeringa debe estar asegurado por el soporte de retención del bloque del empujador.
   10. Ajuste los parámetros en la pantalla de configuración de la bomba.
       1. Presione el botón Force y establezca el nivel de fuerza en 30%. Acepte los cambios para volver a la pantalla de configuración .
       2. Presione el botón de inicio rápido y seleccione Método | Infundir/retirar.
       3. Para la jeringa, seleccione Hamilton 1700, vidrio, 10 μL. Seleccione la velocidad de perfusión y extracción y el volumen de inyección.
          NOTA: El nivel de fuerza se establece en función del tipo de jeringa/material/capacidad/fabricantes; Consulte las instrucciones del fabricante de fábrica para conocer la fuerza sugerida para cada jeringa. La velocidad de inyección utilizada en este experimento fue de 200 nL/s. Las inyecciones de SCJ son relativamente seguras, y hay menos preocupación por la inducción de presión intraocular elevada (PIO) resultante de la inyección. Una velocidad de inyección más lenta es a menudo deseable para ciertas aplicaciones para evitar el reflujo en la aguja y mantener la consistencia en las inyecciones entre los animales.
   11. Expulse el agua de la jeringa Hamilton, pero deje el tubo y la aguja de inyección llenos de agua. Tire ligeramente hacia atrás de la jeringa Hamilton presionando el botón Reverse para introducir una pequeña burbuja de aire en el tubo/aguja.
       NOTA: La burbuja de aire servirá como barrera entre el agua en el tubo y el fármaco terapéutico (en este caso, AAV), asegurando la precisión de la dosis administrada.
   12. Retirar el virus colocando la aguja de inyección en una alícuota de la cepa de virus. Asegúrese de que quede una burbuja de aire visible entre el virus y el agua en el tubo.
       NOTA: Los vectores AAV pueden unirse al tubo de plástico y a la aguja de metal, lo que lleva a una pérdida de virus y / o regímenes de dosificación inexactos. Por lo tanto, para garantizar el rigor, la reproducibilidad y una dosis precisa de AAV, se recomienda prerecubrir las superficies que posteriormente entran en contacto con el AAV. Para recubrir el sistema tubo/aguja con el virus, extraiga la solución de vector viral en el tubo/aguja e incubarla a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la saturación del virus que se une a la pared de la aguja y/o tubo. Deseche el virus.
2. Inyección de virus
   1. Anestesiar al ratón con anestesia inhalada (isoflurano) o inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina/acepromazina. Confirme el plano quirúrgico de la anestesia por falta de respuesta a pellizcos firmes en los dedos del pie.
      NOTA: Use ratones hembra y/o macho C57BL/6J o BALB/c que tengan al menos 6 semanas de edad. Las dosis de ketamina/xilazina/acepromazina son las siguientes: ketamina a 70 mg/kg, xilazina a 7 mg/kg y acepromazina a 1,5 mg/kg.
   2. Aplique anestesia tópica en el ojo que recibirá la inyección.
      NOTA: Use clorhidrato de proparacaína al 0,1% y/o solución oftálmica de clorhidrato de tetracaína (0,5%) para anestesia tópica.
   3. Aplique ungüento tópico en el otro ojo que no recibirá una inyección para prevenir la sequedad y las lesiones.
   4. Coloque el ratón en el escenario microscópico y exponga el ojo del ratón bajo el microscopio estereoscópico.
   5. Coloque dos dedos en el párpado y aleje ligeramente el ojo del ratón para exponer la conjuntiva, que es la membrana interna que conecta el párpado con la esclerótica.
   6. Agarre la conjuntiva con fórceps.
   7. Suelte el párpado y sostenga la aguja con el bisel hacia arriba con la mano dominante.
   8. Inserte la aguja en la conjuntiva. Inserte la aguja hasta que el bisel esté completamente cubierto por la membrana conjuntival. Pon la aguja contra el globo.
      NOTA: Como la conjuntiva es una membrana transparente, la punta / bisel de la aguja es fácilmente visible.
   9. Inicie la inyección pulsando el botón Inicio con el pedal.
      NOTA: El movimiento del aire y el émbolo de Hamilton están sincronizados; Cualquier retraso indica exceso de aire en el sistema de inyección o posiblemente una conexión suelta entre los componentes del tubo, la aguja y/o la jeringa.
   10. Una vez finalizada la inyección, mantenga la aguja en su lugar durante 10 s antes de retirar la aguja de la conjuntiva para disminuir las posibilidades de reflujo.
       NOTA: Es común que aparezca una ampolla en el sitio de la inyección de SCJ. Tales ampollas normalmente se resuelven completamente dentro de unas pocas horas después de la inyección.
   11. Ponga una gota del gel lubricante tópico en los ojos del ratón para evitar la sequedad / lesión ocular, y luego coloque el mouse en una almohadilla térmica para recuperarse.
   12. Realice exámenes oculares como producción de lágrimas, PIO y examen con lámpara de hendidura junto con tinción de fluoresceína corneal para evaluar las anomalías oculares después de la inyección.
       NOTA: La producción de lágrimas se mide mediante una prueba de hilo rojo fenol, y a menudo se usa un tonómetro para examinar la PIO del ojo del ratón. Se informa que algunas inyecciones intraoculares, como las inyecciones intravítreas, podrían dar lugar a un aumento significativo de la PIO; sin embargo, los cambios en la PIO después de la inyección de SCJ no son evidentes ^13,22,23,24.
3. Examen de la biodistribución y la eficiencia de la transducción de AAV después de la inyección subconjuntival
   1. Para investigar la biodistribución del genoma viral y / o el perfil de transducción de los vectores AAV administrados a través de SCJ, eutanasia a los ratones por el método aprobado por AVMA.
      NOTA: En este experimento, los ratones fueron sacrificados 8 semanas después de la inyección.
   2. Para la biodistribución y la expresión transgénica en compartimentos oculares específicos, diseccionar el tejido relevante de interés, como los párpados, la córnea, la conjuntiva, el músculo ocular, la retina y el nervio óptico. Congelar rápidamente todos los tejidos y almacenar a -80 °C. Para examinar la biodistribución de AAV de cuerpo entero, recolecte órganos como los ganglios linfáticos submandibulares y el hígado, y congele rápidamente y guárdelos a -80 ° C.
   3. Usando un kit de extracción de ADN/ARN, recolecte ADNg y ARN de la misma muestra para examinar la expresión transgénica y la biodistribución de AAV, respectivamente. Si solo se desea la biodistribución del vector, use un kit de extracción de ADN para extraer el ADNg.
   4. Realizar qPCR y RT-qPCR estándar para determinar la biodistribución del vector AAV y la abundancia de ADNc utilizando cebadores/sondas específicos de transgenes vectoriales^13,25.
   5. Para el análisis histológico, fije los ojos, insértelos en parafina y seccionarlos a un grosor de 5 μm. Realizar tinción estándar de inmunofluorescencia para revelar la expresión transgénica²⁶.

Resultados

La solución inyectada en el espacio subconjuntival se presenta como una ampolla dependiendo del volumen de inyección.
En este experimento, 7 μL de AAV (7 × 10⁹ genomas virales (vg)/ojo) mezclados con fluoresceína a una concentración final de 0,1% se inyectaron con una aguja de 36 G bajo un microscopio estereoscópico, y la velocidad/presión de inyección se mantuvo constante utilizando una bomba de jeringa programable a 1 μL/s. Puede aparecer una ampolla al inyectarse (flecha). En l...

Discusión

La terapia génica mediada por AAV tiene un gran potencial para el tratamiento de enfermedades oculares. La terapia génica ocular actual se basa en dos vías principales de administración local, inyecciones intravítreas y subretinianas. Desafortunadamente, ambas rutas son invasivas y pueden causar complicaciones graves, como desprendimiento de retina, formación de cataratas y endoftalmitis. Por lo tanto, la investigación de rutas relativamente menos invasivas, como la inyección de SCJ, es de gran interés.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
36 G NanoFil Needles	World Precision Instruments	NF36BV-2
AAV vector	University of North Carolina at Chapel Hill	/
Acepromazine	Henry Schein	NDC 11695-0079-8
anti-GFP antibody	AVES labs Inc.
Digital camera	Cannon	Cannon EOS T5i
DNA/RNA extraction kit	Qiagen	80204
Forceps	Fine Science Tools	F6521
Hamilton syringe	Hamilton	7654-01
India ink	StatLab	NC9903975
Ketamine hydrochloride injection solution	Henry Schein	NDC 0409-2051-05
Moisture-resistant film	Parafilm	807-6
Polyethylene tubing	Becton Dickinson and Company	427401
Proparacaine 0.1%	Bausch Health US	NDC 24208-730-06
Rebound tonometer	Tonovet	/
Sodium fluorescein solution	Sigma-Aldich	46960
Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Bioscience	70-4504
Stereo microscopye	Leica	Mz6
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%	Bausch and Lomb	Rx only
Topical ointment	GenTeal	NDC 0078-0429-47
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads	ZONE-QUICK	PO6448