Administração Subconjuntival de Vetores de Vírus Adenoassociados em Modelos de Pequenos Animais

Resumo

Neste manuscrito, a injeção subconjuntival é demonstrada como um método de entrega vetorial válido para tecidos oculares em camundongos usando um sistema de injeção que consiste em uma bomba de seringa de infusão/retirada e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. Este sistema de injeção também é adaptável para outras vias de administração intraocular.

Resumo

As doenças oculares incluem uma ampla gama de distúrbios genéticos e adquiridos hereditários que são alvos atraentes para a administração local de medicamentos devido à sua relativa facilidade de acessibilidade através de várias vias de administração. As injeções subconjuntivais (SCJ) oferecem vantagens em relação a outras vias de administração intraocular, pois são simples, seguras e geralmente realizadas em ambiente ambulatorial. As injeções de SCJ em pequenos animais geralmente requerem a assistência de um microscópio cirúrgico devido ao tamanho do olho. Trabalhos anteriores demonstraram que a injeção de SCJ de sorotipos específicos de vírus adenoassociados (AAV) é uma estratégia válida de entrega de genes para transdução direcionada da superfície ocular, músculo ocular, córnea e nervo óptico, fornecendo uma abordagem potencial para o tratamento de muitas doenças oculares.

Neste documento, um protocolo detalhado é apresentado para injeções SCJ em um modelo de camundongo usando um sistema de injeção que consiste em uma bomba de seringa de infusão/retirada programável (que permite velocidade e pressão de injeção consistentes e precisas) e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. O sistema de injeção também é adaptável para outras vias de administração intraocular, como injeções intraestromais, intracamerais, intravítreas e sub-retinianas em pequenos animais. Embora a entrega de vetores virais adenoassociados para estudos de terapia gênica ocular seja descrita, o protocolo aqui também pode ser adaptado para uma variedade de soluções oftálmicas em pequenos modelos animais. As principais etapas práticas na via de administração, configuração para a plataforma de injeção, preparação da injeção e dicas da experiência direta serão discutidas em detalhes. Além disso, técnicas comuns de validação para a confirmação da entrega de AAV aos tecidos desejados também serão brevemente discutidas.

Introdução

As doenças oculares abrangem uma ampla gama de distúrbios genéticos e adquiridos. Em 2015, estima-se que 36 milhões de pessoas eram legalmente cegas em todo o mundo e mais de 1 bilhão de pessoas sofrem de pelo menos algum nível de deficiência visual, destacando a necessidade de ampliar os esforços de alívio em todos os níveis¹. Os principais métodos para a administração de medicamentos oculares incluem administração tópica e local, como colírios ou injeções subconjuntivais (SCJ), intracamerais, intravítreas e sub-retinianas. Embora a terapia tópica não invasiva seja o método de administração mais comum para drogas oftálmicas e seja amplamente utilizada para muitos distúrbios do segmento anterior, a presença de barreiras anatômicas da córnea apresenta um desafio para a biodisponibilidade, biodistribuição e eficácia de substâncias administradas topicamente, sugerindo que pode não ser a melhor via de tratamento candidata para muitas doenças do olho interno. A injeção local no compartimento ocular específico afetado pela doença provavelmente será uma abordagem de liberação de medicamentos mais eficaz e direcionada². No entanto, os efeitos adversos resultantes de injeções repetidas podem complicar as estratégias de administração. Idealmente, uma terapia deve manter a eficácia terapêutica a longo prazo após uma única administração. Assim, a terapia gênica é uma opção promissora para minimizar o número de injeções necessárias e proporcionar expressão transgênica sustentada para o tratamento da doença ocular ^3,4.

Numerosos vetores virais e não virais estão disponíveis para terapia gênica; no entanto, os vetores AAV são de alto interesse devido ao seu excelente perfil de segurança. O AAV é um vírus de DNA pequeno, de fita simples e não envelopado, que foi inicialmente descoberto como contaminante de uma preparação de adenovírus em 1965 por Atchison et ^{al.5,6 O} AAV foi posteriormente modificado como um vetor viral eficiente para a entrega de genes na década de 1980 e tornou-se o vetor de terapia gênica de escolha para muitas doenças, incluindo distúrbios oculares, ao longo das últimas décadas. O mais notável deles é o primeiro medicamento de terapia genética comercialmente disponível, o voretigene neparvovec, que foi aprovado pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos para tratar a Amaurose Congênita de Leber, uma doença ocular posterior rara. Embora o voretigene neparvovec tenha superado com sucesso as barreiras ao desenvolvimento clínico, ainda existem desafios para a comercialização de terapias genéticas oculares adicionais. Por exemplo, o voretigene neparvovec é administrado a doentes que retêm células viáveis da retina através de injeção sub-retiniana. Assim, pacientes com formas mais avançadas da doença que não possuem células retinianas viáveis não são elegíveis para o tratamento, pois não proporcionaria nenhum benefício clínico. Além disso, complicações conhecidas associadas ao procedimento de injeção sub-retiniana foram observadas, incluindo inflamação ocular, catarata, lacrimejamento da retina, maculopatia e dor ^7,8. Outras preocupações relacionadas a esse procedimento incluem a possibilidade de hemorragia, descolamento de retina, endoftalmite e revogação do estado imune privilegiado ocular por meio da destruição do tecido ocular 9,10,11,12. Assim, os esforços para explorar rotas de entrega de genes menos invasivas, como a injeção de SCJ, têm se tornado cada vez mais importantes 13,14,15,16,17.

A conjuntiva é uma membrana fina contendo 3-5 camadas de células e conectando o olho anterior à pálpebra interior. As injeções de SCJ são usadas clinicamente para a administração oftálmica de drogas nos segmentos anterior e/ou posterior do olho para o tratamento de doenças oculares, como degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, retinite e uveíte posterior^18,19. Eles são relativamente simples de serem realizados, empregados rotineiramente para a administração de medicamentos oftálmicos em ambiente ambulatorial²⁰, um pouco indolores, não comprometem o privilégio imunológico ocular e permitem que os medicamentos administrados se espalhem por uma grande região periorbital que engloba o nervo óptico. Assim, as injeções de SCJ são uma via atraente de administração para aplicações de terapia gênica AAV. Os sorotipos naturais de AAV administrados por injeção de SCJ em camundongos foram previamente caracterizados quanto à segurança, eficiência de transdução, imunogenicidade sérica, biodistribuição e especificidade tecidual^13,16,21. Estes dados demonstraram que a entrega de genes a tecidos oculares individuais através da administração de SCJ é uma possibilidade formal.

Este artigo descreve um protocolo simples e adaptável para injeção de SCJ para fornecer vetores AAV em um modelo de camundongo. Para garantir a reprodutibilidade desta abordagem, é descrito um sistema de injeção constituído por um estereomicroscópio, uma bomba de seringa de infusão/retirada programável (que permite uma velocidade e pressão de injeção consistentes e precisas) e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. Este sistema é adaptável para outras vias de administração intraocular, como injeções intraestromais, intracamerais, intravítreas e sub-retinianas em pequenos animais. Além disso, um corante fluoresceína é frequentemente utilizado para permitir a visualização do local de injeção de AAV. As principais etapas práticas na via de administração, configuração para a plataforma de injeção, preparação da injeção e dicas da experiência direta serão discutidas em detalhes. Finalmente, técnicas comuns de validação para confirmação da entrega de AAV aos tecidos desejados serão brevemente discutidas.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com os regulamentos do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill. O uso de vetores AAV é um risco de biossegurança Nível 1. Use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo um jaleco, luvas e óculos de proteção ao manusear o AAV. Para o experimento aqui descrito, foi utilizado um vetor AAV recombinante embalado com o capsídeo do sorotipo 8 e codificando um promotor genérico de citomegalovírus ubíquo (CMV) controlando a expressão da proteína de fluorescência verde (GFP).

1. Manuseio e armazenamento de vetores AAV

1. Conservar o vírus num congelador de -80 °C em alíquotas de 100 μL em tubos de microcentrífuga siliconizados ou de baixa retenção.
2. Descongelar todas as soluções de estoque vetoriais no gelo antes do uso.
   NOTA: Corantes como a solução de fluoresceína de sódio (a uma concentração final de 0,1-2%) são frequentemente misturados com os vetores AAV para visualizar a solução injetada. Além disso, a visualização de soluções injetadas ajuda a detectar bolhas de ar e monitorar a distribuição e/ou vazamento de AAV após a injeção.

2. Injeção subconjuntival (SCJ)

1. Monte o sistema de injeção.
   1. Para montar o sistema de injeção, coloque um estereomicroscópio e uma bomba de seringa em um gabinete de biossegurança.
      NOTA: Uma bomba de infusão é necessária para realizar injeções com alta precisão. Aqui, uma bomba de seringa programável padrão de infusão/retirada é utilizada (consulte a Tabela de Materiais), que inclui uma aderência apertada e uma braçadeira de seringa segura para seringas que variam em volume de 0,5 μL a 60 mL. Esta bomba também oferece desempenho de fluxo aprimorado com alta precisão e taxas de fluxo suaves de 1,28 pl / min a 88,28 ml / min.
   2. Corte a tubulação de polietileno a um comprimento de aproximadamente 50 cm (consulte a Tabela de Materiais).
   3. Insira a extremidade do cubo de uma agulha 36 G em uma das extremidades da tubulação.
      NOTA: Deslize a extremidade do cubo da agulha para o tubo por ~3 mm para garantir que não ocorra vazamento. A agulha 36 G é usada para a injeção SCJ subsequente. Agulhas que variam entre 32 G e 36 G são os tamanhos mais comumente usados para injeções SCJ. O uso de um hemostato para auxiliar esta etapa é altamente recomendado para evitar o risco potencial de lesão por perfurocortantes.
   4. Encha uma seringa descartável de 3 ml com água estéril; insira esta seringa descartável no lado do tubo oposto à agulha e lave a água em toda a tubulação/agulha. Repita este passo com álcool a 70%.
   5. Repita o passo 2.1.4 mais três vezes, alternando as descargas com água estéril e álcool a 70%, para desinfetar a tubulação e garantir que não sejam observados vazamentos, entupimentos ou danos em toda a tubulação.
   6. Use a seringa descartável de 3 mL para encher a tubulação com água estéril e deixe a tubulação presa à seringa descartável.
   7. Coloque um pedaço de parafilme na superfície do banco e adicione uma piscina de água estéril a ele (~ 1 mL). Submerja a parte da tubulação conectada à agulha na piscina de água estéril. Puxe a seringa descartável para fora da abertura do tubo na extremidade oposta para evitar que qualquer ar entre no sistema de tubos/agulhas após a remoção da seringa. Deixe a parte da tubulação conectada à agulha submersa na piscina de água.
      NOTA: Executar os procedimentos 2.1.4 a 2.1.7 num exaustor laminar.
   8. Encha uma seringa/agulha Hamilton de 10 μL com água estéril e evite ar na seringa. Ligue a seringa/agulha Hamilton à extremidade aberta restante da tubagem, submergindo a tubulação e a ponta da agulha da seringa Hamilton na piscina de água estéril no parafilme.
   9. Pressione o botão de marcha-atrás rápida na tela da bomba para mover o bloco do empurrador para o comprimento aproximado da seringa. Desparafuse os botões de fixação do suporte para soltar os suportes de retenção no empurrador e os blocos do suporte da seringa. Carregue a seringa Hamilton no bloco do suporte da seringa e prenda a seringa de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: Para fixar a seringa, a braçadeira do tambor da seringa deve estar apertada contra o tambor da seringa; no entanto, não aperte demais, especialmente ao usar seringas de vidro. O êmbolo da seringa deve ser fixado pelo suporte de retenção do bloco do empurrador.
   10. Ajuste os parâmetros na tela de configurações da bomba.
       1. Pressione o botão Força e defina o nível de força em 30%. Aceite as alterações para voltar à tela de configurações.
       2. Pressione o botão de início rápido e selecione Método | Infundir/retirar.
       3. Para a seringa, selecione Hamilton 1700, vidro, 10 μL. Selecione a perfusão e a taxa de retirada e o volume de injeção.
          NOTA: O nível de força é definido dependendo do tipo/material/capacidade/fabricantes da seringa; consulte as instruções do fabricante de fábrica para obter a força sugerida para cada seringa. A velocidade de injeção utilizada neste experimento foi de 200 nL/s. As injeções de SCJ são relativamente seguras, e há menos preocupação com a indução de pressão intraocular (PIO) elevada resultante da injeção. Uma velocidade de injeção mais lenta é muitas vezes desejável para certas aplicações para evitar o refluxo para a agulha e manter a consistência nas injeções entre os animais.
   11. Ejete a água da seringa Hamilton, mas deixe a tubulação e a agulha de injeção cheias de água. Puxe ligeiramente para trás a seringa Hamilton pressionando o botão Reverter para introduzir uma pequena bolha de ar na tubulação/agulha.
       NOTA: A bolha de ar servirá como uma barreira entre a água no tubo e a droga terapêutica (neste caso, AAV), garantindo a precisão da dose administrada.
   12. Retirar o vírus colocando a agulha de injeção numa alíquota da reserva do vírus. Certifique-se de que uma bolha de ar visível permaneça entre o vírus e a água na tubulação.
       NOTA: Os vetores AAV podem se ligar ao tubo de plástico e à agulha de metal, levando a uma perda de vírus e / ou regimes de dosagem imprecisos. Assim, para garantir rigor, reprodutibilidade e uma dose precisa de AAV, recomenda-se o pré-revestimento das superfícies que posteriormente entram em contato com o AAV. Para revestir o sistema tubo/agulha com o vírus, retire a solução vectorial viral para o tubo/agulha e incube-a à temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir a saturação da ligação do vírus à parede da agulha e/ou tubo. Descartar o vírus.
2. Injeção de vírus
   1. Anestesiar o rato com anestesia inalatória (isoflurano) ou injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina/acepromazina. Confirme o plano cirúrgico da anestesia por falta de resposta a beliscões firmes do dedo do pé.
      NOTA: Use camundongos C57BL/6J ou BALB/c fêmeas e/ou machos com pelo menos 6 semanas de idade. As doses de cetamina/xilazina/acepromazina são as seguintes: cetamina a 70 mg/kg, xilazina a 7 mg/kg e acepromazina a 1,5 mg/kg.
   2. Aplique anestesia tópica no olho que receberá a injeção.
      NOTA: Use cloridrato de proparacaína a 0,1% e/ou solução oftálmica de cloridrato de tetracaína (0,5%) para anestesia tópica.
   3. Aplique pomada tópica no outro olho que não receberá uma injeção para evitar ressecamento e lesões.
   4. Posicione o rato no estágio microscópico e exponha o olho do rato sob o estereomicroscópio.
   5. Coloque dois dedos na pálpebra e puxe-a ligeiramente para longe do olho do rato para expor a conjuntiva, que é a membrana interna que liga a pálpebra à esclera.
   6. Pegue a conjuntiva com fórceps.
   7. Solte a pálpebra e segure a agulha com o bisel voltado para cima usando a mão dominante.
   8. Insira a agulha na conjuntiva. Insira a agulha até que o bisel esteja completamente coberto pela membrana conjuntival. Coloque a agulha contra o globo.
      NOTA: Como a conjuntiva é uma membrana clara, a ponta/chanfro da agulha é facilmente visível.
   9. Inicie a injeção pressionando o botão Iniciar usando o botão de pé.
      NOTA: O movimento do ar e do êmbolo de Hamilton estão sincronizados; qualquer atraso indica excesso de ar no sistema de injeção ou possivelmente uma conexão solta entre os componentes da tubulação, agulha e/ou seringa.
   10. Após o término da injeção, mantenha a agulha no lugar por 10 s antes de retirar a agulha da conjuntiva para diminuir as chances de refluxo.
       NOTA: É comum que uma bolha apareça no local da injeção de SCJ. Tais bolhas normalmente se resolvem completamente dentro de algumas horas após a injeção.
   11. Coloque uma gota do gel lubrificante tópico nos olhos do rato para evitar a secura ocular / lesão e, em seguida, coloque o rato em uma almofada de aquecimento para se recuperar.
   12. Realize exames oculares, como produção de lágrimas, PIO e exame com lâmpada de fenda em conjunto com a coloração de fluoresceína da córnea para avaliar as anormalidades oculares após a injeção.
       NOTA: A produção de lágrimas é medida por um teste de fio vermelho de fenol, e um tonômetro é frequentemente usado para examinar a PIO do olho do rato. É relatado que algumas injeções intraoculares, como injeções intravítreas, podem resultar em um aumento significativo da PIO; no entanto, as alterações da PIO após a injeção de SCJ não são óbvias ^13,22,23,24.
3. Exame da biodistribuição e eficiência de transdução do AAV após injeção subconjuntival
   1. Para investigar a biodistribuição do genoma viral e/ou o perfil de transdução de vetores AAV entregues via SCJ, eutanasiar os camundongos pelo método aprovado pela AVMA.
      NOTA: Neste experimento, os ratos foram sacrificados 8 semanas após a injeção.
   2. Para biodistribuição e expressão transgênica em compartimentos oculares direcionados, disseque o tecido relevante de interesse, como as pálpebras, córnea, conjuntiva, músculo ocular, retina e nervo óptico. Congelar rapidamente todos os tecidos e conservar a -80 °C. Para examinar a biodistribuição do AAV de corpo inteiro, coletar órgãos como os gânglios linfáticos submandibulares e o fígado, e congelar rapidamente e armazená-los a -80 °C.
   3. Usando um kit de extração de DNA/RNA, colete gDNA e RNA da mesma amostra para examinar a expressão transgênica e a biodistribuição do AAV, respectivamente. Se apenas a biodistribuição vetorial for desejada, use um kit de extração de DNA para extrair gDNA.
   4. Realizar qPCR e RT-qPCR padrão para determinar a biodistribuição vetorial AAV e a abundância de cDNA usando primers/sondas específicos de transgenes vetoriais^13,25.
   5. Para análise histológica, fixe os olhos, incorpore-os em parafina e separe-os a uma espessura de 5 μm. Realizar coloração por imunofluorescência padrão para revelar a expressão transgênica²⁶.

Resultados

A solução injetada no espaço subconjuntival apresenta-se como uma bolha dependendo do volume de injeção.
Neste experimento, 7 μL de AAV (7 × 10⁹ genomas virais (vg)/olho) misturados com fluoresceína na concentração final de 0,1% foram injetados com uma agulha de 36 G sob estereomicroscópio, e a velocidade/pressão de injeção foi mantida constante usando uma bomba de seringa programável a 1 μL/s. Uma bolha pode aparecer após a injeção (seta). Uma visão microscópica da adm...

Discussão

A terapia genética mediada por AAV tem um grande potencial para o tratamento de doenças oculares. A terapia genética ocular atual depende de duas vias principais de administração local, injeções intravítreas e sub-retinianas. Infelizmente, ambas as vias são invasivas e podem causar sérias complicações, incluindo descolamento de retina, formação de catarata e endoftalmite. Assim, a investigação de vias relativamente menos invasivas, como a injeção de SCJ, é de grande interesse.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
36 G NanoFil Needles	World Precision Instruments	NF36BV-2
AAV vector	University of North Carolina at Chapel Hill	/
Acepromazine	Henry Schein	NDC 11695-0079-8
anti-GFP antibody	AVES labs Inc.
Digital camera	Cannon	Cannon EOS T5i
DNA/RNA extraction kit	Qiagen	80204
Forceps	Fine Science Tools	F6521
Hamilton syringe	Hamilton	7654-01
India ink	StatLab	NC9903975
Ketamine hydrochloride injection solution	Henry Schein	NDC 0409-2051-05
Moisture-resistant film	Parafilm	807-6
Polyethylene tubing	Becton Dickinson and Company	427401
Proparacaine 0.1%	Bausch Health US	NDC 24208-730-06
Rebound tonometer	Tonovet	/
Sodium fluorescein solution	Sigma-Aldich	46960
Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Bioscience	70-4504
Stereo microscopye	Leica	Mz6
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%	Bausch and Lomb	Rx only
Topical ointment	GenTeal	NDC 0078-0429-47
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads	ZONE-QUICK	PO6448