Somministrazione subcongiuntivale di vettori virali adeno-associati in modelli di piccoli animali

Riepilogo

In questo manoscritto, l'iniezione subcongiuntivale è dimostrata come un valido metodo di somministrazione vettoriale per i tessuti oculari nei topi utilizzando un sistema di iniezione costituito da una pompa a siringa per infusione/prelievo e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi di microiniezione. Questo sistema di iniezione è adattabile anche ad altre vie di somministrazione intraoculare.

Abstract

Le malattie oculari comprendono una vasta gamma di malattie genetiche ereditarie e acquisite che sono obiettivi interessanti per la somministrazione locale di farmaci a causa della loro relativa facilità di accessibilità attraverso più vie di somministrazione. Le iniezioni subcongiuntivali (SCJ) offrono vantaggi rispetto ad altre vie di somministrazione intraoculare in quanto sono semplici, sicure e di solito eseguite in un ambiente ambulatoriale. Le iniezioni di SCJ in piccoli animali di solito richiedono l'assistenza di un microscopio operatorio a causa delle dimensioni dell'occhio. Lavori precedenti hanno dimostrato che l'iniezione SCJ di specifici sierotipi di virus adeno-associati (AAV) è una valida strategia di consegna genica per la trasduzione mirata della superficie oculare, del muscolo oculare, della cornea e del nervo ottico, fornendo un potenziale approccio per il trattamento di molte malattie oculari.

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per le iniezioni di SCJ in un modello murino utilizzando un sistema di iniezione costituito da una pompa a siringa per infusione/prelievo programmabile (che consente velocità e pressione di iniezione costanti e precise) e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi per microiniezione. Il sistema di iniezione è adattabile anche per altre vie di somministrazione intraoculare come iniezioni intrastromali, intracamerali, intravitreali e sottoretiniche in piccoli animali. Sebbene sia descritto il rilascio di vettori virali adeno-associati per studi di terapia genica oculare, il protocollo qui contenuto può anche essere adattato per una varietà di soluzioni oftalmiche in piccoli modelli animali. I passaggi pratici chiave nel percorso di somministrazione, la configurazione per la piattaforma di iniezione, la preparazione dell'iniezione e i suggerimenti dall'esperienza diretta saranno discussi in dettaglio. Inoltre, saranno brevemente discusse anche le tecniche di convalida comuni per la conferma della consegna di AAV ai tessuti desiderati.

Introduzione

Le malattie oculari comprendono una vasta gamma di malattie sia genetiche che acquisite. Nel 2015, circa 36 milioni di persone erano legalmente cieche in tutto il mondo e oltre 1 miliardo di persone soffre di almeno un certo livello di disabilità visiva, evidenziando la necessità di aumentare gli sforzi di alleviamento a tutti i livelli¹. I principali metodi per la somministrazione di farmaci oculari includono sia la somministrazione topica che locale, come colliri o iniezioni subcongiuntivali (SCJ), intracamerali, intravitreali e sottoretiniche. Sebbene la terapia topica non invasiva sia il metodo di somministrazione più comune per i farmaci oftalmici e sia ampiamente utilizzata per molti disturbi del segmento anteriore, la presenza di barriere anatomiche corneali presenta una sfida per la biodisponibilità, la biodistribuzione e l'efficacia delle sostanze somministrate localmente, suggerendo che potrebbe non essere la migliore via di trattamento candidata per molte malattie dell'occhio interno. L'iniezione locale nello specifico compartimento oculare interessato dalla malattia è probabilmente un approccio di somministrazione del farmaco più efficace e mirato². Tuttavia, gli effetti avversi derivanti da iniezioni ripetute possono complicare le strategie di somministrazione. Idealmente, una terapia dovrebbe mantenere l'efficacia terapeutica a lungo termine dopo una singola somministrazione. Pertanto, la terapia genica è un'opzione promettente per ridurre al minimo il numero di iniezioni necessarie e fornire un'espressione transgenica sostenuta per il trattamento della malattia oculare ^3,4.

Numerosi vettori virali e non virali sono disponibili per la terapia genica; tuttavia, i vettori AAV sono di grande interesse a causa del loro eccellente profilo di sicurezza. AAV è un piccolo virus a DNA a singolo filamento e senza involucro che è stato inizialmente scoperto come contaminante di una preparazione di adenovirus nel 1965 da Atchison et ^al.5,6 AAV è stato successivamente progettato come un vettore virale efficiente per la consegna genica nel 1980 ed è diventato il vettore di terapia genica di scelta per molte malattie, compresi i disturbi oculari^, negli ultimi decenni. Il più notevole di questi è il primo farmaco di terapia genica disponibile in commercio, voretigene neparvovec, che è stato approvato dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti per trattare l'amaurosi congenita di Leber, una rara malattia dell'occhio posteriore. Sebbene voretigene neparvovec abbia superato con successo le barriere allo sviluppo clinico, permangono sfide per la commercializzazione di ulteriori terapie geniche oculari. Ad esempio, voretigene neparvovec viene somministrato a pazienti che conservano cellule retiniche vitali tramite iniezione sottoretinica. Pertanto, i pazienti con forme più avanzate della malattia che mancano di cellule retiniche vitali non sono eleggibili per il trattamento, in quanto non fornirebbe alcun beneficio clinico. Inoltre, sono state osservate complicanze note associate alla procedura di iniezione sottoretinica, tra cui infiammazione oculare, cataratta, lacrimazione della retina, maculopatia e dolore ^7,8. Altre preoccupazioni relative a questa procedura includono la possibilità di emorragia, distacco di retina, endoftalmite e revoca dello stato di privilegiato immunitario oculare attraverso la distruzione del tessuto oculare 9,10,11,12. Pertanto, gli sforzi per esplorare vie di consegna genica meno invasive come l'iniezione di SCJ sono diventati sempre più importanti 13,14,15,16,17.

La congiuntiva è una sottile membrana contenente 3-5 strati di cellule e che collega l'occhio anteriore alla palpebra interna. Le iniezioni di SCJ sono utilizzate clinicamente per la somministrazione di farmaci oftalmici sia ai segmenti anteriore che / o posteriore dell'occhio per il trattamento di malattie oculari come la degenerazione maculare legata all'età, il glaucoma, la retinite e l'uveite posteriore^18,19. Sono relativamente semplici da eseguire, impiegati di routine per la somministrazione di farmaci oftalmici in un ambiente ambulatoriale²⁰, in qualche modo indolori, non compromettono il privilegio immunitario oculare e consentono ai farmaci somministrati di diffondersi attraverso un'ampia regione periorbitale che comprende il nervo ottico. Pertanto, le iniezioni di SCJ sono una via di somministrazione interessante per le applicazioni di terapia genica AAV. I sierotipi naturali AAV somministrati tramite iniezione di SCJ nei topi sono stati precedentemente caratterizzati per sicurezza, efficienza di trasduzione, immunogenicità sierica, biodistribuzione e specificità tissutale^13,16,21. Questi dati hanno dimostrato che la consegna genica ai singoli tessuti oculari attraverso la somministrazione di SCJ è una possibilità formale.

Questo articolo descrive un protocollo semplice e adattabile per l'iniezione di SCJ per fornire vettori AAV in un modello murino. Per garantire la riproducibilità di questo approccio, viene descritto un sistema di iniezione costituito da uno stereomicroscopio, una pompa a siringa per infusione/prelievo programmabile (che consente velocità e pressione di iniezione costanti e precise) e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi di microiniezione. Questo sistema è adattabile per altre vie di somministrazione intraoculare come iniezioni intrastromali, intracamerali, intravitreali e sottoretiniche in piccoli animali. Inoltre, un colorante fluoresceina viene spesso utilizzato per consentire la visualizzazione del sito di iniezione AAV. I passaggi pratici chiave nel percorso di somministrazione, la configurazione per la piattaforma di iniezione, la preparazione dell'iniezione e i suggerimenti dall'esperienza diretta saranno discussi in dettaglio. Infine, verranno brevemente discusse le tecniche di validazione comuni per la conferma della somministrazione di AAV ai tessuti desiderati.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con i regolamenti del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill. L'uso di vettori AAV è un rischio di biosicurezza di livello 1. Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, tra cui un camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi quando si maneggia AAV. Per l'esperimento qui descritto, è stato utilizzato un vettore AAV ricombinante confezionato con il capside del sierotipo 8 e codificante un promotore generico del citomegalovirus ubiquitario (CMV) che controlla l'espressione della proteina di fluorescenza verde (GFP).

1. Gestione e archiviazione dei vettori AAV

1. Conservare il virus in un congelatore a -80 °C in aliquote da 100 μL in provette siliconate o microcentrifughe a bassa ritenzione.
2. Scongelare tutte le soluzioni vettoriali su ghiaccio prima dell'uso.
   NOTA: Coloranti come la soluzione di fluoresceina di sodio (ad una concentrazione finale dello 0,1-2%) sono spesso miscelati con i vettori AAV per visualizzare la soluzione iniettata. Inoltre, la visualizzazione delle soluzioni iniettate aiuta a rilevare bolle d'aria e monitorare la distribuzione di AAV e/o le perdite dopo l'iniezione.

2. Iniezione subcongiuntivale (SCJ)

1. Assemblare il sistema di iniezione.
   1. Per assemblare il sistema di iniezione, posizionare uno stereomicroscopio e una pompa a siringa in un armadio di biosicurezza.
      NOTA: è necessaria una pompa di infusione per eseguire iniezioni con alta precisione. Qui viene utilizzata una pompa a siringa programmabile standard per infusione/prelievo (vedere la tabella dei materiali), che include una presa ermetica e un morsetto per siringhe sicuro di volume compreso tra 0,5 μL e 60 ml. Questa pompa offre anche prestazioni di flusso migliorate con elevata precisione e portate regolari da 1,28 pl / min a 88,28 ml / min.
   2. Tagliare il tubo di polietilene ad una lunghezza di circa 50 cm (vedere la tabella dei materiali).
   3. Inserire l'estremità del mozzo di un ago da 36 G in una delle estremità del tubo.
      NOTA: Far scorrere l'estremità del mozzo dell'ago nel tubo per ~3 mm per assicurarsi che non si verifichino perdite. L'ago da 36 G viene utilizzato per la successiva iniezione di SCJ. Gli aghi compresi tra 32 G e 36 G sono le dimensioni più comunemente utilizzate per le iniezioni di SCJ. L'uso di un emostatico per assistere questo passaggio è altamente raccomandato per evitare il potenziale rischio di lesioni da taglio.
   4. Riempire una siringa monouso da 3 mL con acqua sterile; Inserire questa siringa monouso nel lato del tubo opposto all'ago e sciacquare l'acqua in tutto il tubo/ago. Ripeti questo passaggio con il 70% di alcol.
   5. Ripetere il passaggio 2.1.4 altre tre volte, alternando i risciacqui con acqua sterile e alcool al 70%, per disinfettare il tubo e assicurarsi che non si osservino perdite, intasamenti o danni in tutto il tubo.
   6. Utilizzare la siringa monouso da 3 mL per riempire il tubo con acqua sterile e lasciare il tubo attaccato alla siringa monouso.
   7. Posizionare un pezzo di parafilm sulla superficie del banco e aggiungere una pozza di acqua sterile (~ 1 ml). Immergere la porzione del tubo collegato all'ago nella piscina di acqua sterile. Estrarre la siringa monouso dall'apertura del tubo all'estremità opposta per evitare che l'aria entri nel sistema tubi/aghi dopo la rimozione della siringa. Lasciare la porzione del tubo collegata all'ago immersa nella pozza d'acqua.
      NOTA: Eseguire le procedure da 2.1.4 a 2.1.7 in una cappa laminare.
   8. Riempire una siringa/ago Hamilton da 10 μL con acqua sterile ed evitare l'aria nella siringa. Collegare la siringa/ago Hamilton all'estremità aperta rimanente del tubo immergendo il tubo e la punta dell'ago della siringa di Hamilton nella pozza di acqua sterile sul parafilm.
   9. Premere il pulsante di inversione rapida sullo schermo della pompa per spostare il blocco di spinta alla lunghezza approssimativa della siringa. Svitare le manopole di serraggio della staffa per allentare le staffe di fissaggio sullo spintore e sui blocchi del supporto della siringa. Caricare la siringa Hamilton sul blocco portasiringhe e fissare la siringa seguendo le istruzioni del produttore.
      NOTA: per fissare la siringa, il morsetto del cilindro della siringa deve essere stretto contro il cilindro della siringa; Tuttavia, non stringere eccessivamente, specialmente quando si usano siringhe di vetro. Lo stantuffo della siringa deve essere fissato dalla staffa di fissaggio del blocco spintore.
   10. Regolare i parametri nella schermata delle impostazioni della pompa.
       1. Premere il pulsante Force e impostare il livello di forza su 30%. Accettare le modifiche per tornare alla schermata delle impostazioni .
       2. Premere il pulsante di avvio rapido e selezionare Metodo | Infondere/ritirare.
       3. Per la siringa, selezionare Hamilton 1700, vetro, 10 μL. Selezionare la velocità di infusione e prelievo e il volume di iniezione.
          NOTA: Il livello di forza è impostato in base al tipo di siringa / materiale / capacità / produttori; Vedere le istruzioni del produttore di fabbrica per la forza suggerita per ogni siringa. La velocità di iniezione utilizzata in questo esperimento è stata di 200 nL/s. Le iniezioni di SCJ sono relativamente sicure e vi è meno preoccupazione per l'induzione di un'elevata pressione intraoculare (IOP) derivante dall'iniezione. Una velocità di iniezione più bassa è spesso auspicabile per alcune applicazioni per evitare il reflusso nell'ago e mantenere la coerenza nelle iniezioni tra gli animali.
   11. Espellere l'acqua dalla siringa di Hamilton ma lasciare il tubo e l'ago per iniezione pieni d'acqua. Tirare leggermente indietro la siringa di Hamilton premendo il pulsante Inverti per introdurre una piccola bolla d'aria nel tubo/ago.
       NOTA: La bolla d'aria fungerà da barriera tra l'acqua nel tubo e il farmaco terapeutico (in questo caso, AAV), garantendo l'accuratezza della dose somministrata.
   12. Prelevare il virus inserendo l'ago per iniezione in un'aliquota dello stock virale. Assicurarsi che una bolla d'aria visibile rimanga tra il virus e l'acqua nel tubo.
       NOTA: i vettori AAV possono legarsi al tubo di plastica e all'ago metallico, portando a una perdita di virus e/o regimi di dosaggio imprecisi. Pertanto, per garantire rigore, riproducibilità e una dose accurata di AAV, si consiglia di preverniciare le superfici che successivamente entrano in contatto con l'AAV. Per rivestire il sistema tubi/aghi con il virus, aspirare la soluzione del vettore virale nel tubo/ago e incubarla a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire la saturazione del legame del virus alla parete dell'ago e/o del tubo. Scartare il virus.
2. Iniezione di virus
   1. Anestetizzare il topo con anestesia inalatoria (isoflurano) o iniezione intraperitoneale di ketamina/xilazina/acepromazina. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia con una mancanza di risposta ai pizzichi delle dita dei piedi.
      NOTA: Utilizzare topi femmina e/o maschi C57BL/6J o BALB/c di almeno 6 settimane. Le dosi di ketamina / xilazina / acepromazina sono le seguenti: ketamina a 70 mg / kg, xilazina a 7 mg / kg e acepromazina a 1,5 mg / kg.
   2. Applicare l'anestesia topica all'occhio che riceverà l'iniezione.
      NOTA: Utilizzare una soluzione oftalmica allo 0,1% di proparacaina cloridrato e/o tetracaina cloridrato (0,5%) per l'anestesia topica.
   3. Applicare un unguento topico all'altro occhio che non riceverà un'iniezione per prevenire secchezza e lesioni.
   4. Posizionare il mouse sul palcoscenico microscopico ed esporre l'occhio del topo sotto lo stereomicroscopio.
   5. Posizionare due dita sulla palpebra e allontanarla leggermente dall'occhio del topo per esporre la congiuntiva, che è la membrana interna che collega la palpebra alla sclera.
   6. Prendi la congiuntiva con una pinza.
   7. Rilasciare la palpebra e tenere l'ago con la smussatura rivolta verso l'alto usando la mano dominante.
   8. Inserire l'ago nella congiuntiva. Inserire l'ago fino a quando la smussatura è completamente coperta dalla membrana congiuntivale. Appoggia l'ago contro il globo.
      NOTA: Poiché la congiuntiva è una membrana trasparente, la punta dell'ago / smussatura è facilmente visibile.
   9. Iniziare l'iniezione premendo il pulsante Start utilizzando l'interruttore a pedale.
      NOTA: Il movimento dell'aria e dello stantuffo di Hamilton sono sincronizzati; Qualsiasi ritardo indica un eccesso di aria nel sistema di iniezione o eventualmente una connessione allentata tra i componenti del tubo, dell'ago e/o della siringa.
   10. Al termine dell'iniezione, tenere l'ago in posizione per 10 secondi prima di prelevare l'ago dalla congiuntiva per ridurre le possibilità di riflusso.
       NOTA: È comune che un bleb compaia nel sito dell'iniezione di SCJ. Tali macchie normalmente si risolvono completamente entro poche ore dall'iniezione.
   11. Mettere una goccia di gel lubrificante topico sugli occhi del topo per prevenire secchezza / lesioni oculari, quindi posizionare il mouse su una piastra elettrica per recuperare.
   12. Eseguire esami oculari come la produzione di lacrime, IOP e l'esame della lampada a fessura in combinazione con la colorazione della fluoresceina corneale per valutare le anomalie oculari dopo l'iniezione.
       NOTA: La produzione di lacrime viene misurata da un test del filo rosso fenolo e un tonometro viene spesso utilizzato per esaminare la IOP dell'occhio del topo. È stato riportato che alcune iniezioni intraoculari, come le iniezioni intravitreali, potrebbero comportare un aumento significativo della IOP; tuttavia, le variazioni della IOP dopo l'iniezione di SCJ non sono evidenti ^13,22,23,24.
3. Esame dell'efficienza di biodistribuzione e trasduzione degli AAV dopo iniezione sottocongiuntivale
   1. Per studiare la biodistribuzione del genoma virale e/o il profilo di trasduzione dei vettori AAV veicolati tramite SCJ, eutanasia dei topi con il metodo approvato dall'AVMA.
      NOTA: In questo esperimento, i topi sono stati sacrificati 8 settimane dopo l'iniezione.
   2. Per la biodistribuzione e l'espressione transgenica in compartimenti oculari mirati, sezionare il tessuto rilevante di interesse come palpebre, cornea, congiuntiva, muscolo oculare, retina e nervo ottico. Congelare tutti i tessuti e conservare a -80 °C. Per esaminare la biodistribuzione AAV di tutto il corpo, raccogliere organi come i linfonodi sottomandibolari e il fegato, congelarli e conservarli a -80 ° C.
   3. Utilizzando un kit di estrazione DNA/RNA, raccogliere gDNA e RNA dallo stesso campione per esaminare rispettivamente l'espressione transgenica e la biodistribuzione AAV. Se si desidera solo la biodistribuzione vettoriale, utilizzare un kit di estrazione del DNA per estrarre il gDNA.
   4. Eseguire qPCR e RT-qPCR standard per determinare la biodistribuzione del vettore AAV e l'abbondanza di cDNA utilizzando primer/sonde vettori transgene-specifici^13,25.
   5. Per l'analisi istologica, fissare gli occhi, incorporarli in paraffina e sezionarli a uno spessore di 5 μm. Eseguire la colorazione standard con immunofluorescenza per rivelare l'espressione transgenica²⁶.

Risultati

La soluzione iniettata nello spazio subcongiuntivale si presenta come un bleb a seconda del volume di iniezione.
In questo esperimento, 7 μL di AAV (7 × 10⁹ genomi virali (vg)/occhio) miscelati con fluoresceina ad una concentrazione finale dello 0,1% sono stati iniettati con un ago da 36 G sotto uno stereomicroscopio e la velocità/pressione di iniezione è stata mantenuta costante utilizzando una pompa a siringa programmabile a 1 μL/s. Un bleb può apparire all'iniezione (freccia). Una ...

Discussione

La terapia genica mediata da AAV ha un grande potenziale per il trattamento delle malattie oculari. L'attuale terapia genica oculare si basa su due principali vie di somministrazione locale, iniezioni intravitreali e sottoretiniche. Sfortunatamente, entrambe le vie sono invasive e possono causare gravi complicazioni, tra cui il distacco della retina, la formazione di cataratta e l'endoftalmite. Pertanto, lo studio di vie relativamente meno invasive, come l'iniezione di SCJ, è di grande interesse.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
36 G NanoFil Needles	World Precision Instruments	NF36BV-2
AAV vector	University of North Carolina at Chapel Hill	/
Acepromazine	Henry Schein	NDC 11695-0079-8
anti-GFP antibody	AVES labs Inc.
Digital camera	Cannon	Cannon EOS T5i
DNA/RNA extraction kit	Qiagen	80204
Forceps	Fine Science Tools	F6521
Hamilton syringe	Hamilton	7654-01
India ink	StatLab	NC9903975
Ketamine hydrochloride injection solution	Henry Schein	NDC 0409-2051-05
Moisture-resistant film	Parafilm	807-6
Polyethylene tubing	Becton Dickinson and Company	427401
Proparacaine 0.1%	Bausch Health US	NDC 24208-730-06
Rebound tonometer	Tonovet	/
Sodium fluorescein solution	Sigma-Aldich	46960
Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Bioscience	70-4504
Stereo microscopye	Leica	Mz6
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%	Bausch and Lomb	Rx only
Topical ointment	GenTeal	NDC 0078-0429-47
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads	ZONE-QUICK	PO6448