Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توفر هذه الدراسة إجراء محسنا بشكل منهجي للبناء القائم على الريبونوكلياز CRISPR / Cas9 لمتحولات الجراد متماثل الزيجوت بالإضافة إلى طريقة مفصلة للحفظ بالتبريد وإنعاش بيض الجراد.

Abstract

الجراد المهاجر ، Locusta migratoria ، ليس فقط أحد جراد الطاعون في جميع أنحاء العالم الذي تسبب في خسائر اقتصادية هائلة للبشر ولكنه أيضا نموذج بحثي مهم لتحول الحشرات. يمكن لنظام CRISPR / Cas9 تحديد موقع دقيق في موضع معين من الحمض النووي والالتصاق داخل الموقع المستهدف ، مما يؤدي بكفاءة إلى إدخال فواصل مزدوجة الخيوط للحث على خروج الضربة القاضية للجين المستهدف أو دمج شظايا جينية جديدة في موضع معين. يعد تحرير الجينوم بوساطة كريسبر / كاس 9 أداة قوية لمعالجة الأسئلة التي تتم مواجهتها في أبحاث الجراد بالإضافة إلى تقنية واعدة لمكافحة الجراد. توفر هذه الدراسة بروتوكولا منهجيا للضربة القاضية الجينية بوساطة كريسبر / كاس 9 مع مركب بروتين Cas9 والحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNAs) في الجراد المهاجر. يتم وصف اختيار المواقع المستهدفة وتصميم sgRNA بالتفصيل ، يليه التوليف في المختبر والتحقق من sgRNAs. تشمل الإجراءات اللاحقة جمع طوف البيض وفصل البيض المدبوغ لتحقيق الحقن المجهري الناجح مع معدل وفيات منخفض ، وزراعة البيض ، والتقدير الأولي لمعدل الطفرة ، وتكاثر الجراد ، وكذلك اكتشاف وحفظ ومرور الطفرات لضمان استقرار أعداد الجراد المحرر. يمكن استخدام هذه الطريقة كمرجع لتطبيقات تحرير الجينات القائمة على كريسبر / كاس 9 في الجراد المهاجر وكذلك في الحشرات الأخرى.

Introduction

يمكن استخدام تقنيات تحرير الجينات لإدخال عمليات الإدراج أو الحذف في موضع جينوم معين لتعديل الجين المستهدف بشكل مصطنع عن الغرض1. في السنوات الماضية ، تطورت تقنية CRISPR / Cas9 بسرعة ولديها نطاق متزايد من التطبيقات في مختلف مجالات علوم الحياة2،3،4،5،6. تم اكتشاف نظام CRISPR / Cas9 في عام 19877 ، ويوجد على نطاق واسع في البكتيريا والعتائق. أشارت الأبحاث الإضافية إلى أنه كان نظاما مناعيا تكيفيا بدائيات النواة يعتمد على النيوكلياز الموجه بالحمض النووي الريبي Cas9 لمحاربة العاثيات8. يتكون نظام CRISPR / Cas9 المعدل صناعيا بشكل أساسي من مكونين ، RNA موجه واحد (sgRNA) وبروتين Cas9. يتكون sgRNA من CRISPR RNA (crRNA) مكمل للتسلسل المستهدف و crRNA مساعد منشط (tracrRNA) ، والذي يتم حفظه نسبيا. عندما يتم تنشيط نظام CRISPR / Cas9 ، يشكل sgRNA بروتين نووي ريبي (RNP) مع بروتين Cas9 ويوجه Cas9 إلى موقعه المستهدف عبر الاقتران الأساسي لتفاعلات الحمض النووي الريبي والحمض النووي. بعد ذلك ، يمكن شق الحمض النووي المزدوج الخيط بواسطة بروتين Cas9 ونتيجة لذلك ، يظهر كسر الشريط المزدوج (DSB) بالقرب من الشكل المجاور للفضاء الأولي (PAM) للموقع المستهدف9،10،11،12. للتخفيف من الضرر الناجم عن DSBs ، ستقوم الخلايا بتنشيط استجابات تلف الحمض النووي الشاملة للكشف بكفاءة عن الأضرار الجينومية وبدء إجراء الإصلاح. هناك آليتان متميزتان للإصلاح في الخلية: الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) والإصلاح الموجه بالتماثل (HDR). NHEJ هو مسار الإصلاح الأكثر شيوعا الذي يمكنه إصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة بسرعة ويمنع موت الخلايا المبرمج. ومع ذلك ، فهو عرضة للخطأ بسبب ترك أجزاء صغيرة من عمليات الإدراج والحذف (indels) بالقرب من DSBs ، مما يؤدي عادة إلى تحول إطار قراءة مفتوح وبالتالي يمكن أن يؤدي إلى خروج الجينات بالضربة القاضية. في المقابل ، يعد الإصلاح المتماثل حدثا نادرا جدا. بشرط وجود قالب إصلاح بتسلسلات متماثلة مع سياق DSB ، تقوم الخلايا أحيانا بإصلاح الكسر الجينومي وفقا للقالب القريب. نتيجة HDR هي أن DSB يتم إصلاحه بدقة. على وجه الخصوص ، إذا كان هناك تسلسل إضافي بين التسلسلات المتماثلة في القالب ، دمجها في الجينوم من خلال HDR ، وبهذه الطريقة ، يمكن تحقيق إدخالات الجينات المحددة13.

مع تحسين وتطوير هياكل sgRNA ومتغيرات بروتين Cas9 ، تم أيضا تطبيق نظام التحرير الجيني القائم على CRISPR / Cas9 بنجاح في أبحاث الحشرات ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، الزاعجة المصرية ، بومبيكس موري ، هليكوفيرا أرميجيرا ، بلوتيلا زيلوستيلا ، والجراد المهاجر14،15،16،17،18، 19. على حد علم المؤلفين ، على الرغم من استخدام RNPs التي تتكون من بروتين Cas9 و sgRNA المنسوخ في المختبر لتحرير جينوم الجراد20،21،22 ، لا يزال هناك بروتوكول منهجي ومفصل للبناء بوساطة CRISPR / Cas9 ribonuclease للطفرات متماثلة الزيجوت للجراد المهاجر.

الجراد المهاجر هو آفة زراعية مهمة لها توزيع عالمي وتشكل تهديدات كبيرة لإنتاج الغذاء ، كونها ضارة بشكل خاص بالنباتات الجرامينية ، مثل القمح والذرة والأرز والدخن23. يمكن أن يوفر تحليل وظائف الجينات القائم على تقنيات تحرير الجينوم أهدافا جديدة واستراتيجيات جديدة لمكافحة الجراد المهاجر. تقترح هذه الدراسة طريقة مفصلة لضرب جينات الجراد المهاجر عبر نظام CRISPR / Cas9 ، بما في ذلك اختيار المواقع المستهدفة وتصميم sgRNAs ، والتوليف في المختبر والتحقق من sgRNAs ، والحقن المجهري وثقافة البيض ، وتقدير معدل الطفرات في المرحلة الجنينية ، والكشف عن الطفرات وكذلك مرور الطفرات والحفاظ عليها. يمكن استخدام هذا البروتوكول كمرجع أساسي لمعالجة الغالبية العظمى من جينات الجراد ويمكن أن يوفر مراجع قيمة لتحرير الجينوم للحشرات الأخرى.

Protocol

1. اختيار الموقع المستهدف وتصميم sgRNA

  1. اجمع أكبر قدر ممكن من معلومات التسلسل للجين محل الاهتمام من خلال البحث في الأدبيات و / أو البحث عن mRNA أو ترميز تسلسل الحمض النووي (CDS) للجين في قاعدة بيانات NCBI والجراد24.
  2. قارن تتابع الجين المعني بتتابع الحمض النووي الجينومي الخاص به لتمييز منطقتي إكسون وإنترون.
  3. حدد منطقة مرشحة لتصميم الموقع المستهدف بناء على الغرض من البحث. صمم أزواجا أولية لتضخيم جزء المنطقة المرشحة والتحقق من تسلسلها من النوع البري عن طريق تحليل تسلسل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    ملاحظة: هناك استراتيجيات مختلفة لاختيار المنطقة المستهدفة المرشحة. على سبيل المثال ، في معظم أبحاث وظائف الجينات / البروتين ، استخدم جزء الإكسون بالقرب من كودون البداية كمنطقة مرشحة لضمان فقدان وظيفة البروتين / الحمض النووي الريبي بالكامل بعد تحرير الجينوم (أي خروج المغلوب الجيني). أثناء تحليل وظيفة مجال معين ، حدد المنطقة المرشحة في بداية (أو كلا الطرفين) للمجال.
  4. استخدم الموارد عبر الإنترنت مثل E-CRISP Design25 للبحث عن المواقع المستهدفة المحتملة في المنطقة المستهدفة المرشحة.
    1. حدد "Drosophila melanogaster BDGP6" (أو أي حشرة أخرى) في القائمة المنسدلة للجينومات المرجعية واختر "الإدخال هو تسلسل FASTA" متبوعا بلصق تسلسل المنطقة المستهدفة في مربع النص (بتنسيق FASTA).
    2. ابدأ التطبيق بالضغط على "بدء بحث sgRNA" باستخدام "متوسط" و "تصميم فردي" للحصول على المواقع المستهدفة المحتملة. حدد 1-3 أهداف محتملة من النتائج بناء على درجاتها المتوقعة وصمم sgRNAs المقابلة وفقا لذلك.
      ملاحظة: هناك العديد من المنصات عبر الإنترنت لتصميم CRISPR ، مثل CRISPOR و CHOP و CRISPRdirect و ZiFiT وما إلى ذلك (انظر جدول المواد). بعضها لديه وظيفة التحقق من الخصوصية للأنواع التي توجد بيانات التسلسل الجيني الخاصة بها في قواعد بياناتها. ومع ذلك ، لم يتم العثور على التسلسل الجيني للجراد على أي موقع على الإنترنت. من الأفضل استخدام أكثر من أداة عبر الإنترنت لتصميم كريسبر في الجراد. بشكل شامل ، ضع في اعتبارك النتائج من مواقع الويب المختلفة وحدد sgRNA من النتائج على مبدأ أعلى خصوصية وأعلى كفاءة وأقل معدل عدم تطابق (الشكل 1 أ ، ب).

2. توليف والتحقق من sgRNA في المختبر

  1. توليف sgRNA باستخدام مجموعات تخليق sgRNA وفقا لدليل الشركة المصنعة (جدول المواد). يتضمن هذا الإجراء عادة ثلاث خطوات: تضخيم قالب الحمض النووي ، والنسخ في المختبر ، وتنقية sgRNA21. قم بتخفيف sgRNA المركب بالماء الخالي من النيوكلياز إلى تركيز تخزين 300 نانوغرام / ميكرولتر لمزيد من الاستخدام.
  2. تضخيم وتنقية جزء الجين المستهدف ليكون بمثابة الركيزة لمقايسة الانقسام في المختبر لنظام CRISPR / Cas9. قم بتنفيذ هذه الخطوات باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  3. قم بتخفيف بروتين Cas9 الذي تم شراؤه إلى 300 نانوغرام / ميكرولتر بالماء الخالي من النيوكلياز. احتضان 1 ميكرولتر من sgRNA (300 نانوغرام / ميكرولتر) و 1 ميكرولتر من بروتين Cas9 (300 نانوغرام / ميكرولتر) مع 200 نانوغرام من الجزء المستهدف المنقى في المخزن المؤقت للانقسام عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (10 ميكرولتر من الحجم الكلي ؛ انظر الجدول 1). تقدير كفاءة انشقاق Cas9 الناجم عن sgRNA بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز (الشكل 1C). حدد sgRNAs ذات النشاط العالي للحقن المجهري التالي.
    ملاحظة: يمكن تحويل نتائج الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز إلى صور ذات تدرج رمادي باستخدام برنامج معالجة الصور ويتم تقدير كفاءة الانقسام وفقا للتدرج الرمادي لنطاقات الأحجام المتوقعة.

3. الحقن المجهري وزراعة البيض

  1. تحضير إبر الحقن عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية مع مجتذب micropipette (جدول المواد). اضبط المعلمات على النحو التالي: الحرارة إلى 588 ، والسحب إلى 90 ، والسرعة إلى 60 ، والوقت إلى 40. طحن طرف إبرة الحقن مع طاحونة صغيرة (جدول المواد).
    ملاحظة: أطراف الإبرة المثالية مفتوحة وحادة الحواف (الشكل 2 أ). يوصى بشدة بإعداد إبر إضافية للتجارب لأن الإبر يتم حظرها أحيانا أو كسرها عن طريق الخطأ أثناء الحقن.
  2. امزج 1 ميكرولتر من بروتين Cas9 (300 نانوغرام / ميكرولتر) مع 1 ميكرولتر من sgRNA الذي تم التحقق منه (300 نانوغرام / ميكرولتر) معا للحصول على RNPs للحقن. أضف 8 ميكرولتر من الماء المعقم الخالي من RNase لجعل الحجم النهائي للخليط يصل إلى 10 ميكرولتر. امزج المحلول جيدا واحتفظ به على الجليد.
    ملاحظة: يمكن تحسين التركيزات النهائية لبروتين Cas9 و sgRNAs وفقا لنتائج التحرير. تجنب التجميد المتكرر وذوبان محلول RNP المحضر ويوصى بالاستخدام الفوري.
  3. قم بتربية ذكور وإناث الجراد البالغ معا عند 30 درجة مئوية مع فترة ضوئية 16 (خفيفة): 8 (داكنة) وزودهم بشتلات القمح الطازج الكافية كغذاء. راقب هذا الجراد يوميا وضع وعاء وضع البيض (إناء زهور بلاستيكي أو كوب مملوء بالرمل المعقم الرطب) في قفص التربية لوضع البيض بمجرد تزاوج الجراد.
    ملاحظة: عادة ما يكون 100 زوج من الجراد البالغ الذي يتم تربيته في قفص تربية (40 سم × 40 سم × 40 سم) كافيا لتوليد بيض لضرب جين واحد. استزرع أزواج الجراد الإضافية إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من البيض.
  4. اجمع قرون البيض الطازجة من وعاء وضع البيض وانتظر حوالي 30 دقيقة لدباغة البيض. اعزل البيض برفق عن قرون البيض في الماء باستخدام فرشاة ناعمة واغسلها بالماء المعقم ثلاث مرات. احتفظ بالبيض في طبق بتري وأضف الماء المعقم للحفاظ على رطوبته.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي دباغة البيض الذي تم وضعه حديثا إلى تحسين كفاءة الطفرة بشكل كبير21.
  5. املأ إبرة الحقن بمحلول RNP المحضر وقم بتحميله إلى المعالج الدقيق (جدول المواد).
    1. اضبط معلمات الحقن المجهري على النحو التالي: 300 hPa من ضغط الحقن (pi) ، 0.5 ثانية من وقت الحقن (ti) ، و 25 hPa من ضغط التعويض (pc).
    2. اضغط على الدواسة لتقييم حجم المحلول المحقون. اضبط ضغط الحقن ووقت الحقن للتأكد من أن حجم الحقن حوالي 50-100 نانولتر.
      ملاحظة: استنفاد الهواء المتبقي في الإبرة لجعل محلول الحقن مستمرا ويمكن التحكم فيه قدر الإمكان. يجب أن يكون اتصال الإبرة والمعالج الدقيق ضيقا.
  6. رتب البويضات المعقمة بانتظام على وسادة الحقن (الشكل 2 ب ، ج) وضع الوسادة على طاولة الكائن في المجهر (الشكل 3 أ). اضبط تكبير المجهر حتى يتم ملاحظة البيض. اضبط إبرة الحقن المجهري تحت المجهر حتى يمكن رؤية طرف الحقن وضعه بالقرب من البويضة المراد حقنها.
  7. ابدأ الحقن على ارتفاع مناسب وزاوية 30-45 درجة. أدخل الطرف في البيضة بعناية بالقرب من ميكروبايل البيضة (الشكل 3 ب) واضغط على الدواسة لإنجاز الحقن. اسحب الإبرة بسرعة وحرك وسادة الحقن لحقن البويضة التالية.
    ملاحظة: يجب ملاحظة توسع طفيف في البويضة أثناء الحقن المجهري. كمية صغيرة من تسرب السيتوبلازم في الثقب مقبولة. استبدل إبرة الحقن بإبرة جديدة أو اضبط زاوية الحقن إذا كان تدفق السائل أكثر من اللازم.
  8. انقل البيض المحقون إلى طبق استزراع (طبق بتري مع قطعة من ورق الترشيح الرطب) ، وضعه في حاضنة على حرارة 30 درجة مئوية.
    ملاحظة: سوف يستغرق الأمر حوالي 13-14 يوما حتى تفقس الحوريات من هذه البويضات المحقونة (بشرط ألا تؤثر طفرة الجين المستهدف على تطور الأجنة) (الشكل 3C). حقن ما لا يقل عن 100 بيضة لضمان كمية كافية من الفقس و eclosion لضرب جين معين.

4. تقدير معدل الطفرات وفحص الطفرات

  1. تحقق من تطور البيض المحقون كل يوم بعد الحقن. انقل البيض المحقون إلى طبق استزراع جديد كل 24 ساعة في أول 5 أيام.
  2. فياليوم السادس (أو في وقت لاحق) بعد الحقن ، اختر ونقل 10 بيضات بشكل عشوائي إلى أنبوب وطحن البيض بشكل كاف باستخدام كرتين فولاذيتين عند 60 هرتز لمدة 6 دقائق باستخدام مطحنة (انظر جدول المواد). أعد تعليق الحطام ب 1 مل من PBS. انقل 5 ميكرولتر من الخليط إلى 45 ميكرولتر من 50 مللي مول هيدروكسيد الصوديوم وتحلل عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أضف 5 ميكرولتر من 1 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 8.0) إلى نظام التحلل لإنهاء تفاعل التحلل القلوي.
    ملاحظة: يمكن قطف البيض للتحلل القلوي في أي يوم بعد النقل الأخير ويمكن استخدام بويضات متعددة كعينة واحدة اعتمادا على حالة نموها (على سبيل المثال ، يمكن استخدام خمسة أجنة عمرها 6 أيام كعينة واحدة ، ويمكن استخدام جنينين بعمر 10 أيام كعينة واحدة). في بعض الأحيان ، لا يكون من الممكن الحصول على الحمض النووي الجينومي للبيض باستخدام طريقة التحلل القلوي. يمكن استخدام مجموعات استخراج الحمض النووي الجينومي التجارية كطريقة بديلة لعزل الحمض النووي الجينومي من البيض.
  3. خذ 1 ميكرولتر من منتج التحلل كقالب PCR لتضخيم جزء الجين المستهدف (الجدول 2 والجدول 3) وإرسال منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للتسلسل. قارن نتائج التسلسل مع تسلسل النوع البري لتقييم مبدئي ما إذا كان نظام CRISPR / Cas9 قد شق الجين المستهدف في الجسم الحي (الشكل 4A). السماح لبقية البيض للتطور اللاحق بشرط أن يتم الكشف عن indels في المرحلة الجنينية.
    ملاحظة: بهذه الطريقة ، يمكن تقدير معدل الطفرة بشكل مبدئي في مرحلة الجنين. إذا لم يتم العثور على indels في هذه الخطوة ، فقم بإعداد بعض sgRNAs الجديدة للجين المستهدف وكرر بروتوكول خروج المغلوب من الخطوة 2.1.
  4. نقل الحوريات المفرغة إلى قفص تربية واستزراعها كما هو موضح في الخطوة 3.3. عندما تطورت الحوريات إلى المرحلة الخامسة ، افصلها بأكواب الثقافة البلاستيكية (1 حورية / كوب).
    ملاحظة: عادة ما يستغرق الأمر حوالي 25-35 يوما حتى تتطور الحوريات إلى الجزء الخامس من الطور والنمط الظاهري الأكثر وضوحا هو أن براعم الجناح تمتد إلى الجزء الرابع أو الخامس من البطن. علاوة على ذلك ، يوصى بتسجيل الأنماط الظاهرية للحوريات الميتة للتنبؤ بالعلاقة بين الجين المستهدف والأنماط الظاهرية في مزيد من البحث.
  5. قطع حوالي 2 مم طول الهوائيات مع مقص تشريح وتحليلها باستخدام طريقة التحلل القلوي (الخطوة 4.2). قم بتحليل تسلسل جزء الجين المستهدف لهذه الحوريات كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4.3) لتحديد طفرات G0 (الشكل 4B).
    ملاحظة: يمكن أن يكون قطع الهوائيات للتحلل أطول قليلا وطحن الهوائيات أو فرمها مفيد للتحلل على الرغم من أنه يمكن هضم الهوائيات مباشرة. يتم تحديد الأفراد الذين لديهم قمم متعددة بالقرب من الموقع المستهدف في نتيجة التسلسل على أنهم طفرات إيجابية ويسمح لهم بالتطور والتزاوج اللاحق.

5. إنشاء وتمرير خطوط متحولة

  1. إجراء التهجين باستخدام طفرات G0 والجراد البري (الشكل 4B). اجمع البويضات واحتضن هذه البويضات بشكل منفصل عند 30 درجة مئوية. استخدم 3-6 بويضات مطورة في كل كيس بويضة للكشف عن الطفرات كما هو موضح في الخطوتين 4.2 و 4.3. احتفظ بالبويضات إيجابية الطفرة للتطور اللاحق والتخلي عن البويضات السلبية الطفرة.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي تقدير معدل الطفرة في المرحلة الجنينية إلى تسريع فحص طفرات G1 بشكل كبير. عادة ، يمكن خلط 3-6 بويضات مطورة كعينة واحدة للتنميط الجيني بوساطة تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح أعلاه.
  2. قم بإرجاع حوريات G1 كما هو موضح في الخطوة 4.4. قطع حوالي 2 مم من طول الهوائيات لإجراء التنميط الجيني القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في الخطوة 4.5 للكشف عن G1 متغاير الزيجوت. قم بإجراء استنساخ TA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) لتحديد طفراتها. أداء في التقاطع باستخدام G1 متغاير الزيجوت مع نفس الطفرات للحصول على G2 الحوريات.
    ملاحظة: يمكن أن يوفر تسلسل سانجر لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل معلومات فقط لمعرفة الزيجوتات غير المتجانسة ، ولكن ليس معلومات كافية لتحديد الطفرات الدقيقة. وبالتالي ، فإن استنساخ TA باستخدام منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل مطلوب لتحديد الطفرات بوضوح ويمكن أن يعزز إنشاء خطوط متحولة مستقرة.
  3. قم بتربية حوريات G2 حتى نجمها الخامس. استخدم التنميط الجيني القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل الموصوف في الخطوة 5.2 لتحديد الزيجوت المتماثل و / أو الزيجوتات غير المتجانسة المناسبة لمزيد من البحث والمرور المستقر (الشكل 4 ب).
    ملاحظة: انتبه لتجنب خلط الزيجوت المتماثل والزيجوت. يوصى بإجراء التنميط الجيني القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل في كل جيل لتأكيد الزيجوت المتماثل و / أو تغاير الزيجوت لكل مجموعة سكانية. يعتمد عدد الجراد المستخدم في هذا الفحص على حجم السكان. علاوة على ذلك ، يمكن توسيع أعداد الجراد من خلال استراتيجية الصليب.

6. حفظ البيض بالتبريد والإنعاش

  1. اغسل البيض المراد حفظه بالماء المعقم واحتضانه في طبق استزراع كما هو موضح أعلاه (الخطوة 3.8) لمدة 5-6 أيام. اجمع هذه البيض معا في طبق الاستزراع وقم بتغطيتها بشظايا ورق الترشيح. لف طبق الثقافة بأكمله بفيلم البارافين.
  2. احفظ الطبق على حرارة 25 درجة مئوية لمدة يومين متبوعا بيومين آخرين عند درجة حرارة منخفضة نسبيا (13-16 درجة مئوية). ثم انقلي الطبق إلى ثلاجة على حرارة 6 درجات مئوية. أضف الماء إليه كل 2 أسابيع لتوفير بيئة رطبة للبيض (الشكل 5 أ).
    ملاحظة: يعتقد أن الأجنة في مرحلة القطاتريبسيس بعد تطورها لمدة 5-6 أيام عند 30 درجة مئوية26. التبريد المتدرج مفيد للحفظ بالتبريد للبيض (الجدول 5).
  3. لإنعاش البيض المحفوظ بالتبريد ، أخرج طبق بتري من الثلاجة واحتفظ به عند 25 درجة مئوية لمدة يومين. ضع هذه البيض في حاضنة 30 درجة مئوية حتى تفقس الحوريات (الشكل 5 ب).
    ملاحظة: من الضروري وضع البيض المحفوظ بالتبريد عند 25 درجة مئوية قبل نقله إلى حاضنة 30 درجة مئوية. يمكن حفظ الأجنة بالتبريد لمدة خمسة أشهر على الأقل على الرغم من أن معدل الفقس ومعدل الاختزال يمكن أن ينخفض بسبب الحفظ بالتبريد (الجدول 5).

النتائج

يحتوي هذا البروتوكول على الخطوات التفصيلية لتوليد طفرات متماثلة الزيجوت من الجراد المهاجر مع RNP الذي يتكون من بروتين Cas9 و sgRNA المركب في المختبر . فيما يلي بعض النتائج التمثيلية للضربة القاضية الجينية المستهدفة بوساطة كريسبر / كاس9 في الجراد ، بما في ذلك اختيار الهدف ، وتوليف sgRNA والتحق?...

Discussion

كان الجراد من بين أكثر الآفات تدميرا للزراعة منذ حضارةالبشر 23. تعد تقنية تحرير الجينوم القائمة على كريسبر / كاس 9 أداة قوية لتوفير معرفة أفضل بالآليات البيولوجية في الجراد بالإضافة إلى استراتيجية واعدة لمكافحة الآفات. وبالتالي ، من المفيد جدا تطوير طريقة فعالة وسهلة الاستخدا?...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32070502 ، 31601697 ، 32072419 ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2020M672205).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10×NEBuffer r3.1New England BiolabsB7030S The buffer of  in vitro Cas9 cleavage assays
2xEs Taq MasterMix (Dye)CwbioCW0690For gene amplification
2xPfu MasterMix (Dye)CwbioCW0686For gene amplification
CHOPCHOPOnline website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/.
CRISPOROnline website for designing sgRNAs, http://crispor.org.
CRISPRdirectOnline website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/.
Electrophoresis power supplyLIUYI BIOLOGYDYY-6DSeparation of nucleic acid molecules of different sizes
Eppendorf TubeEppendorf30125177For sample collection, etc.
Fine brushesAnnigoni1235For cleaning and isolating eggs. Purchased online.
Flaming/brown micropipette pullerSutter InstrumentP97For making the microinjection needles
Gel Extraction KitCwbioCW2302DNA recovery and purification
Gel Imaging Analysis SystemOLYMPUSGel Doc XRObserve the electrophoresis results
GeneTouch PlusBioerB-48DAFor gene amplification
Glass electrode capillaryGairdnerGD-102For making injection needles with a micropipette Puller
IncubatorMEMMERTINplus55For migratory locust embryo culture
Metal bathTIANGENAJ-800For heating the sample
Micro autoinjectorEppendorf5253000068Microinjection of embryos early in development
Micro centrifugeAllshengMTV-1Used for mixing reagents
MicrogrinderNARISHIGEEG-401To ground the tip of injection needle
MicroloaderEppendorf5242956003For loading solutions into the injection needles.
Micromanipulation systemEppendorfTransferMan 4rAn altinative manipulation system for microinjection
MicroscopecnoptecSZ780For microinjection
Motor-drive ManipulatorNARISHIGEMM-94For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure
Multi-Sample Tissue GrinderjingxinTissuelyser-64Grind and homogenize the eggs
ovipisition potChangShengYuanYiCS-11Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online.
ParafilmParafilmMPM996For wrapping the petri dishes.
pEASY-T3 Cloning KitTransGen BiotechCT301-01For TA cloning
Petri dishNEST752001For culture and preservation of  the eggs.
PipettorEppendorfResearch®plus For sample loading
plastic culture cupFor rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online.
Precision gRNA Synthesis KitThermoA29377For sgRNA synthesis
Primer PremierPREMIER BiosoftPrimer Premier 5.00For primer design
SnapGeneInsightful ScienceSnapGene®4.2.4For analyzing  sequences
Steel ballsHuaXinGangQiuHXGQ60For sample grinding.Purchased online.
TipsbioleafD781349 For sample loading
Trans DNA Marker IITransGen BiotechBM411-01Used to determine gene size
TrueCut Cas9 Protein v2ThermoA36496Cas9 protein
UniversalGen DNA KitCwbioCWY004For genomic DNA extraction
VANNAS ScissorsElectron Microscopy Sciences72932-01For cutting off the antennae
WheatTo generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers.
ZiFiTOnline website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.

References

  1. Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
  2. van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology. 38 (7), 845-855 (2020).
  3. McCarty, N. S., Graham, A. E., Studena, L., Ledesma-Amaro, R. Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation. Nature Communications. 11 (1), 1281 (2020).
  4. Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: Methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).
  5. Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
  6. Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
  7. Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology. 169 (12), 5429-5433 (1987).
  8. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  9. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  10. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
  11. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
  14. Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa Armigera (Hubner). Journal of Visualized Experiments: JoVE1. (173), e62068 (2021).
  15. Huang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of the abdominal-A homeotic gene in the global pest, diamondback moth (Plutella xylostella). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 75, 98-106 (2016).
  16. Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
  17. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
  18. Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
  19. Xu, X., et al. BmHpo mutation induces smaller body size and late stage larval lethality in the silkworm, Bombyx mori. Insect Science. 25 (6), 1006-1016 (2018).
  20. Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 60 (2018).
  21. Zhang, T., et al. Egg tanning improves the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated mutant locust production by enhancing defense ability after microinjection. Journal of Integrative Agriculture. 20 (10), 2716-2726 (2021).
  22. Guo, X., et al. 4-Vinylanisole is an aggregation pheromone in locusts. Nature. 584 (7822), 584-588 (2020).
  23. Zhang, L., Lecoq, M., Latchininsky, A., Hunter, D. Locust and grasshopper management. Annual Review of Entomology. 64, 15-34 (2019).
  24. Pétavy, G. Origin and development of the vitellophags during embryogenesis of the migratory locust, Locusta migratoria L. (Orthoptera : Acrididae). International Journal of Insect Morphology and Embryology. 14 (6), 361-379 (1985).
  25. Barry, S. K., et al. Injecting Gryllus bimaculatus eggs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59726 (2019).
  26. Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome editing in the cricket, Gryllus bimaculatus. Methods in Molecular Biology. 1630, 219-233 (2017).
  27. Du, M. H., et al. Suppression of Laccase 2 severely impairs cuticle tanning and pathogen resistance during the pupal metamorphosis of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae). Parasites & Vectors. 10 (1), 171 (2017).
  28. Eisner, T., Shepherd, J., Happ, G. M. Tanning of grasshopper eggs by an exocrine secretion. Science. 152 (3718), 95-97 (1966).
  29. Ho, K., Dunin-Borkowski, O. M., Akam, M. Cellularization in locust embryos occurs before blastoderm formation. Development. 124 (14), 2761-2768 (1997).
  30. Wang, X., et al. Interactive effect of photoperiod and temperature on the induction and termination of embryonic diapause in the migratory locust. Pest Managment Science. 77 (6), 2854-2862 (2021).
  31. Jarwar, A. R., et al. Comparative transcriptomic analysis reveals molecular profiles of central nervous system in maternal diapause induction of Locusta migratoria. G3-Genes Genomes Genetics. 9 (10), 3287-3296 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181 9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved