בניית מוטנטים הומוזיגוטיים של ארבה נודד בטכנולוגיית CRISPR/Cas9

Summary

מחקר זה מספק הליך מותאם באופן שיטתי של בנייה מבוססת ריבונוקלאז CRISPR/Cas9 של מוטציות ארבה הומוזיגוטיות, כמו גם שיטה מפורטת לשימור בהקפאה והחייאת ביצי ארבה.

Abstract

הארבה הנודדת, Locusta migratoria, היא לא רק אחת מארבות המגפה העולמיים שגרמו הפסדים כלכליים עצומים לבני אדם, אלא גם מודל מחקרי חשוב למטמורפוזה של חרקים. מערכת CRISPR/Cas9 יכולה לאתר במדויק במיקום דנ"א ספציפי ולהיבקע בתוך אתר המטרה, ולהציג ביעילות הפסקות דו-גדיליות כדי לגרום לנוקאאוט של גן המטרה או לשלב מקטעי גנים חדשים בלוקוס הספציפי. עריכת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 היא כלי רב עוצמה להתמודדות עם שאלות בחקר הארבה, כמו גם טכנולוגיה מבטיחה להדברת ארבה. מחקר זה מספק פרוטוקול שיטתי לנוקאאוט גנים בתיווך CRISPR/Cas9 עם קומפלקס של חלבון Cas9 ורנ"א מנחה יחיד (sgRNAs) בארבה נודד. בחירת אתרי המטרה והעיצוב של sgRNA מתוארים בפירוט, ולאחר מכן סינתזת מבחנה ואימות של sgRNAs. הליכים מאוחרים יותר כוללים איסוף רפסודות ביצים והפרדת ביצים שזופות כדי להשיג מיקרו-הזרקה מוצלחת עם שיעור תמותה נמוך, תרבית ביצים, הערכה ראשונית של שיעור המוטציות, רבייה של ארבה וכן גילוי, שימור ומעבר של המוטנטים כדי להבטיח את יציבות האוכלוסייה של הארבה הערוך. שיטה זו יכולה לשמש כהפניה ליישומי עריכת גנים מבוססי CRISPR/Cas9 בארבה נודד כמו גם בחרקים אחרים.

Introduction

טכנולוגיות עריכת גנים יכולות לשמש להחדרת החדרות או מחיקות למוקד גנום ספציפי כדי לשנות באופן מלאכותי את גן המטרה למטרה¹. בשנים האחרונות, טכנולוגיית CRISPR/Cas9 התפתחה במהירות ויש לה היקף הולך וגדל של יישומים בתחומים שונים של מדעי החיים 2,3,4,5,6. מערכת CRISPR/Cas9 התגלתה עוד בשנת 1987⁷, ונמצאה באופן נרחב בחיידקים ובארכאה. מחקר נוסף הצביע על כך שמדובר במערכת חיסון פרוקריוטית נרכשת התלויה בנוקלאז מונחה RNA Cas9 כדי להילחם בפאגים⁸. מערכת CRISPR/Cas9 שעברה שינוי מלאכותי מורכבת בעיקר משני מרכיבים, RNA מנחה יחיד (sgRNA) וחלבון Cas9. ה-sgRNA מורכב מ-CRISPR RNA (crRNA) המשלים את רצף המטרה ומ-crRNA טרנסאקטיבי עזר (tracrRNA), שנשמר יחסית. כאשר מערכת CRISPR/Cas9 מופעלת, ה-sgRNA יוצר ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) עם חלבון Cas9 ומנחה את Cas9 לאתר המטרה שלו באמצעות זיווג הבסיס של אינטראקציות RNA-DNA. לאחר מכן, הדנ"א הדו-גדילי יכול להיבקע על ידי חלבון Cas9 וכתוצאה מכך, שבר הגדיל הכפול (DSB) מופיע ליד מוטיב הפרוטוספייסר הסמוך (PAM) של אתר המטרה 9,10,11,12. כדי למתן את הנזק שנגרם על ידי DSBs, תאים יפעילו תגובות מקיפות של נזק לדנ"א כדי לזהות ביעילות את הנזקים הגנומיים וליזום את הליך התיקון. ישנם שני מנגנוני תיקון נפרדים בתא: חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR). NHEJ הוא מסלול התיקון הנפוץ ביותר שיכול לתקן שברים דו-גדיליים של DNA במהירות ומונע אפופטוזיס של תאים. עם זאת, הוא מועד לטעויות בגלל השארת שברים קטנים של החדרות ומחיקות (indels) ליד DSBs, אשר בדרך כלל גורם לשינוי מסגרת קריאה פתוחה ולכן יכול להוביל להסתרת גנים. לעומת זאת, תיקון הומולוגי הוא אירוע נדיר למדי. בתנאי שיש תבנית תיקון עם רצפים הומולוגיים להקשר של DSB, תאים יתקנו מדי פעם את השבר הגנומי בהתאם לתבנית הסמוכה. התוצאה של HDR היא שה- DSB מתוקן במדויק. במיוחד, אם יש רצף נוסף בין הרצפים ההומולוגיים בתבנית, הם ישולבו בגנום באמצעות HDR, וכך ניתן יהיה לממש את החדרות הגנים הספציפיים¹³.

עם אופטימיזציה ופיתוח של מבני sgRNA וגרסאות חלבון Cas9, מערכת העריכה הגנטית מבוססת CRISPR/Cas9 יושמה בהצלחה גם במחקר של חרקים, כולל אך לא מוגבל Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella, ו Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ^,19. למיטב ידיעת המחברים, למרות ש-RNPs המורכבים מחלבון Cas9 ו-sgRNA משועתק במבחנה שימשו לעריכת גנום ארבה^20,21,22, פרוטוקול שיטתי ומפורט לבנייה בתיווך ריבונוקלאז CRISPR/Cas9 של מוטציות הומוזיגוטיות של הארבה הנודד עדיין חסר.

הארבה הנודד הוא מזיק חקלאי חשוב בעל תפוצה עולמית ומהווה איום ממשי על ייצור המזון, בהיותו מזיק במיוחד לצמחי גרמין כגון חיטה, תירס, אורז ודוחן²³. ניתוח תפקודי גנים המבוסס על טכנולוגיות עריכת גנום יכול לספק מטרות חדשות ואסטרטגיות חדשות להדברת ארבה נודד. מחקר זה מציע שיטה מפורטת להשמדת גנים נודדים של ארבה באמצעות מערכת CRISPR/Cas9, כולל בחירת אתרי מטרה ועיצוב sgRNAs, סינתזת מבחנה ואימות של sgRNAs, מיקרו-הזרקה ותרבית ביציות, הערכת שיעור המוטציות בשלב העוברי, איתור מוטנטים וכן מעבר ושימור של המוטציות. פרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת ייחוס בסיסית למניפולציה של הרוב המכריע של גני הארבה ויכול לספק הפניות יקרות ערך לעריכת גנום של חרקים אחרים.