Costruzione di mutanti omozigoti di locuste migratorie utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9

Riepilogo

Questo studio fornisce una procedura sistematicamente ottimizzata di costruzione basata sulla ribonucleasi CRISPR / Cas9 di mutanti di locuste omozigoti, nonché un metodo dettagliato per la crioconservazione e la rianimazione delle uova di locuste.

Abstract

La locusta migratrice, Locusta migratoria, non è solo una delle locuste della peste in tutto il mondo che ha causato enormi perdite economiche agli esseri umani, ma anche un importante modello di ricerca per la metamorfosi degli insetti. Il sistema CRISPR / Cas9 può localizzare con precisione un locus specifico del DNA e fendere all'interno del sito bersaglio, introducendo in modo efficiente rotture a doppio filamento per indurre il knockout del gene bersaglio o integrare nuovi frammenti di geni nel locus specifico. L'editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9 è un potente strumento per affrontare le domande incontrate nella ricerca sulle locuste e una tecnologia promettente per il controllo delle locuste. Questo studio fornisce un protocollo sistematico per il knockout genico mediato da CRISPR / Cas9 con il complesso della proteina Cas9 e RNA guida singola (sgRNA) nelle locuste migratorie. La selezione dei siti target e la progettazione degli sgRNA sono descritte in dettaglio, seguite dalla sintesi in vitro e dalla verifica degli sgRNA. Le procedure successive includono la raccolta della zattera delle uova e la separazione delle uova conciate per ottenere una microiniezione di successo con basso tasso di mortalità, coltura delle uova, stima preliminare del tasso di mutazione, allevamento delle locuste, nonché rilevamento, conservazione e passaggio dei mutanti per garantire la stabilità della popolazione delle locuste modificate. Questo metodo può essere utilizzato come riferimento per applicazioni di editing genetico basate su CRISPR / Cas9 nelle locuste migratorie e in altri insetti.

Introduzione

Le tecnologie di modifica genetica potrebbero essere utilizzate per introdurre inserzioni o delezioni in uno specifico locus del genoma per modificare artificialmente il gene bersaglio sullo scopo¹. Negli ultimi anni, la tecnologia CRISPR / Cas9 si è sviluppata rapidamente e ha un crescente ambito di applicazioni in vari campi delle scienze della vita 2,3,4,5,6. Il sistema CRISPR / Cas9 è stato scoperto nel 1987⁷ e ampiamente trovato in batteri e archei. Ulter....