基于CRISPR/Cas9技术构建迁徙蝗虫纯合突变体

摘要

本研究为基于CRISPR/Cas9核糖核酸酶构建纯合蝗虫突变体提供了系统优化的程序，以及蝗虫卵冷冻保存和复苏的详细方法。

摘要

迁徙 蝗虫Locusta migratoria，不仅是给人类造成巨大经济损失的世界性瘟疫蝗虫之一，也是昆虫的重要研究模型。CRISPR/Cas9系统可以准确地定位特定的DNA位点并在靶位点内切割，有效地引入双链断裂以诱导靶基因敲除或将新的基因片段整合到特定位点中。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑是解决蝗虫研究中遇到的问题的有力工具，也是蝗虫控制的一种有前途的技术。本研究为迁徙蝗虫中具有Cas9蛋白和单向导RNA（sgRNA）复合物的CRISPR / Cas9介导基因敲除提供了系统方案。详细描述了sgRNA靶位点的选择和设计，然后是sgRNA的 体外 合成和验证。后续程序包括卵筏采集和鞣卵分离，以实现低死亡率的成功显微注射、卵培养、突变率的初步估计、蝗虫繁殖以及突变体的检测、保存和传代，以确保编辑的蝗虫种群稳定。该方法可作为基于CRISPR/Cas9的基因编辑在迁徙蝗虫和其他昆虫中的参考应用。

引言

基因编辑技术可用于将插入或缺失引入特定的基因组位点，以人工修改目标基因^的目的1。在过去的几年中，CRISPR/Cas9技术发展迅速，在生命科学的各个领域的应用范围越来越大2，³，⁴，^5，6。CRISPR / Cas9系统于1987年发现^7，并广泛存在于细菌和古细菌中。进一步的研究表明，它是一种原核适应性免疫系统，依赖于RNA引导的核酸酶Cas9来对抗噬菌体⁸。人工修饰的CRISPR/Cas9系统主要由两种组分组成，即单一向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白。sgRNA由与靶序列互补的CRISPR RNA（crRNA）和相对保守的辅助反式激活crRNA（tracrRNA）组成。当CRISPR/Cas9系统被激活时，sgRNA与Cas9蛋白形成核糖核蛋白（RNP），并通过RNA-DNA相互作用的碱基配对将Cas9引导到其靶位点。然后，双链DNA可以被Cas9蛋白切割，结果，双链断裂（DSB）出现在靶位点⁹，¹⁰，^11，12的原间隔相邻基序（PAM）附近。为了减轻DSB造成的损伤，细胞将激活全面的DNA损伤反应，以有效地检测基因组损伤并启动修复程序。细胞中有两种不同的修复机制:非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。NHEJ是最常见的修复途径，可以快速修复DNA双链断裂并防止细胞凋亡。然而，它容易出错，因为在DSB附近留下了插入和缺失（插入缺失）的小片段，这通常会导致开放的阅读帧偏移，从而导致基因敲除。相比之下，同源修复是相当罕见的事件。在存在序列与DSB上下文同源的修复模板的情况下，细胞偶尔会根据附近的模板修复基因组断裂。HDR的结果是DSB被精确修复。特别是，如果模板中的同源序列之间存在额外的序列，它们将通过HDR整合到基因组中，这样可以实现特定的基因插入¹³。

随着sgRNA结构和Cas9蛋白变异体的优化和发展，基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统也已成功应用于昆虫研究，包括但不限于黑腹果蝇、埃及伊蚊、森邦比克斯、阿米格拉螺旋藻、木星蝇和蝗虫迁徙¹⁴，^15，16，^17，18，19.据作者所知，尽管由Cas9蛋白和体外转录sgRNA组成的RNP已被用于蝗虫基因组编辑²⁰，^21，22，但仍然缺乏CRISPR / Cas9核糖核酸酶介导的迁徙蝗虫纯合突变体构建的系统性和详细的方案。

迁徙蝗虫是一种重要的农业害虫，分布全球，对粮食生产构成重大威胁，对小麦、玉米、水稻和小米等禾本科植物尤其有害²³。基于基因组编辑技术的基因功能分析可为控制迁徙蝗虫提供新的靶点和新策略。本研究提出了通过CRISPR/Cas9系统 敲 除迁徙蝗虫基因的详细方法，包括靶位点的选择和sgRNA的设计，sgRNA的体外合成和验证，卵子的显微注射和培养，胚胎期突变率的估计，突变体的检测以及突变 体 的传代和保存。该方案可作为操纵绝大多数蝗虫基因的基础参考，可为其他昆虫的基因组编辑提供有价值的参考。

研究方案

1. 靶点选择和sgRNA设计

1. 通过在NCBI和蝗虫数据库²⁴上通过文献研究和/或搜索基因的mRNA或编码DNA序列（CDS）收集尽可能多的目标基因的序列信息。
2. 将感兴趣的基因序列与其基因组DNA序列进行比较，以区分外显子和内含子区域。
3. 根据研究目的选择目标站点设计的候选区域。设计引物对以扩增候选区域片段，并通过PCR产物的测序分析验证其野生型序列。
   注意:选择候选目标区域有不同的策略。例如，在大多数基因/蛋白质功能研究中，使用靠近其起始密码子的外显子片段作为候选区域，以确保整个蛋白质/RNA功能在基因组编辑（即基因敲除）后丢失。对于特定域的功能分析，请选择域开头（或两端）的候选区域。
4. 使用E-CRISP Design²⁵ 等在线资源在候选目标区域中搜索潜在的目标位点。
   1. 在参考基因组下拉列表中选择"黑腹果蝇BDGP6"（或任何其他昆虫），然后选择"输入是FASTA序列"，然后将目标区域的序列粘贴到文本框中（FASTA格式）。
   2. 通过按"培养基"和"单一设计"的"开始sgRNA搜索"来启动应用程序，以获得可能的靶位点。根据预测分数从结果中选择1-3个潜在靶标，并相应地设计相应的sgRNA。
      注意:CRISPR设计还有更多的在线平台，如CRISPOR，CHOPCHOP，CRISPRdirect，ZiFiT等（见 材料表）。其中一些具有对基因组序列数据在其数据库中的物种进行特异性检查的功能。然而，在任何在线网站上都没有找到蝗虫的基因组序列。最好使用多个在线工具进行蝗虫的CRISPR设计。综合考虑不同网站的结果，并根据最高特异性、最高效率和最小错配率的原则从结果中选择sgRNA（图1A，B）。

2. sgRNA体外的合成与验证

1. 根据制造商手册（材料表）使用 sgRNA 合成试剂盒合成 sgRNA。该过程通常包括三个步骤:DNA模板扩增， 体外 转录和sgRNA纯化²¹。用无核酸酶水将合成的 sgRNA 稀释至 300 ng/μL 的储存浓度以供进一步使用。
2. 扩增和纯化靶基因片段，作为 CRISPR/Cas9 系统 体外 切割测定的底物。按照制造商的说明执行以下步骤。
3. 用无核酸酶水将购买的 Cas9 蛋白稀释至 300 ng/μL。在 37 °C 的切割缓冲液中将 1 μL sgRNA （300 ng/μL） 和 1 μL Cas9 蛋白 （300 ng/μL） 与 200 ng 纯化的目标片段孵育 1 小时（总体积为 10 μL;参见 表 1）。通过琼脂糖凝胶电泳估计sgRNA诱导的Cas9切割的效率（图1C）。选择具有高活性的sgRNA进行以下显微注射。
   注意:琼脂糖凝胶电泳的结果可以使用图像处理软件转换为灰度图像，并且根据推测尺寸的条带的灰度估计切割效率。

3. 卵子的显微注射和培养

1. 通过用微量移液器拉动玻璃毛细管来准备注射针（材料表）。参数设置如下:加热为 588，拉力设置为 90，速度为 60，时间设置为 40。用微型研磨机研磨注射针的尖端（材料表）。
   注意:理想的针尖是开放且锋利的（图2A）。强烈建议为实验准备额外的针头，因为在注射过程中针头有时会堵塞或意外折断。
2. 将 1 μL Cas9 蛋白 （300 ng/μL） 与 1 μL 经验证的 sgRNA （300 ng/μL） 混合在一起，以获得用于注射的 RNP。加入 8 μL 无 RNase 无菌水，使混合物的最终体积达到 10 μL。 彻底混合溶液并将其放在冰上。
   注意:Cas9蛋白和sgRNA的最终浓度可以根据编辑结果进行优化。避免重复冷冻和解冻制备的RNP溶液，建议立即使用。
3. 在30°C下用16（浅）:8（暗）光周期将雄性和雌性成年蝗虫一起饲养，并为其提供足够的新鲜小麦幼苗作为食物。每天观察这些蝗虫，并在蝗虫交配后将产卵盆（装满湿无菌沙子的塑料花盆或杯子）放入饲养笼中产卵。
   注意:通常，在饲养笼（40 cm x 40 cm x 40 cm）中饲养的100对成年蝗虫足以产生卵以敲除单个基因。如果需要更多的卵，则培养额外的蝗虫对。
4. 从产卵罐中收集新鲜产下的蛋荚，等待约30分钟进行蛋鞣。用细刷子将鸡蛋从蛋荚中轻轻地从水中分离出来，并用无菌水清洗三次。将鸡蛋放在培养皿中，并加入无菌水以保持湿润。
   注意:新产卵的鞣制可以显着提高突变效率²¹。
5. 用制备的RNP溶液填充注射针，并将其加载到显微操纵器中（材料表）。
   1. 显微注射参数设置如下:注射压力（pi）为300 hPa，注射时间（ti）为0.5 s，补偿压力（pc）为25 hPa。
   2. 踩下踏板以评估注入溶液的体积。调整注射压力和注射时间，确保注射量约为50-100nL。
      注意:排出针头中的残留空气，以使注射液尽可能连续和可控。针头和显微操纵器的连接需要紧密。
6. 将无菌卵定期排列在注射垫上（图2B，C），并将垫放在显微镜的物体台上（图3A）。调整显微镜的放大倍率，直到观察到鸡蛋。在显微镜下调整显微注射针，直到可以看到注射尖端并将其放置在要注射的鸡蛋附近。
7. 以合适的高度和30-45度的角度开始注射。小心地将尖端插入鸡蛋的微孔附近的鸡蛋中（图3B），然后踩下踏板以完成注射。快速缩回针头并移动注射垫以注射下一个鸡蛋。
   注意:在显微注射过程中应观察到卵子的轻微膨胀。针孔处的少量细胞质渗漏是可以接受的。更换新的注射针，如果流出的过多，请调整注射角度。
8. 将注射的卵子转移到培养皿（带有一块湿滤纸的培养皿）中，并将它们置于30°C的培养箱中。
   注意:若虫从这些注射的卵中孵化大约需要13-14天（条件是靶基因的突变不会影响胚胎的发育）（图3C）。注射至少100个鸡蛋，以确保有足够的孵化和封闭量来敲除特定基因。

4. 突变率估计和突变体筛选

1. 注射后每天检查注射卵子的发育情况。在前5天内每24小时将注射的卵子转移到新的培养皿中。
2. 在注射后第^6天（ 或更晚），随机挑选并将10个鸡蛋转移到管中，并使用研磨机用两个钢球以60 Hz充分研磨鸡蛋6分钟（见 材料表）。用 1 mL PBS 重悬碎片。将 5 μL 混合物转移到 45 μL 的 50 mM NaOH 中，并在 95 °C 下裂解 5 分钟。向裂解系统中加入 5 μL 1 M Tris-HCl （pH=8.0） 以终止碱性裂解反应。
   注意:可以在最后一次转移后的任何一天挑选出卵子进行碱性裂解，并且可以根据其发育情况将多个卵子用作一个样品（例如，五个6天大的胚胎可以用作一个样品，两个10天大的胚胎可以用作一个样品）。有时，使用碱裂解法获得鸡蛋的基因组DNA是不可行的。商业基因组DNA提取试剂盒可用作从卵子中分离基因组DNA的替代方法。
3. 取1 μL裂解产物作为PCR模板，扩增靶基因片段（表2 和 表3），送PCR产物进行测序。将测序结果与野生型序列进行比较，初步评估CRISPR/Cas9系统是否在 体内 切割了靶基因（图4A）。允许其余的卵子进行后续发育，条件是在胚胎阶段检测到插入缺失。
   注意:通过这种方式，可以在胚胎阶段初步估计突变率。如果在此步骤中未发现插入缺失，则为靶基因准备一些新的sgRNA，并重复步骤2.1中的敲除方案。
4. 将孵化的若虫转移到饲养笼中，并按照步骤3.3中的说明进行培养。当若虫发育到第五龄期时，用塑料培养杯（1个若虫/杯）将它们分开。
   注意:若虫通常需要大约 25-35 天才能发育到第五龄，最明显的表型是翼芽延伸到第四或第五腹节。此外，建议在进一步研究中记录死若虫的表型，以预测靶基因与表型之间的关系。
5. 用解剖剪刀切下约2毫米长的触角，并使用碱裂解法裂解（步骤4.2）。如上所述（步骤4.3）分析这些若虫的靶基因片段序列以鉴定G₀ 突变体（图4B）。
   注意:用于裂解的触角切口可以稍长一些，尽管触角可以直接消化，但研磨或切碎触角有助于裂解。测序结果中靶位点附近有多个峰的个体被鉴定为阳性突变体，并允许随后发育和交配。

5. 突变系的建立和传代

1. 使用G₀ 突变体和野生型蝗虫进行杂交育种（图4B）。收集卵囊并在30°C下分别孵育这些卵囊。 如步骤4.2和4.3中所述，在每个卵囊中使用3-6个发育的卵来检测突变。保留突变阳性卵囊以供后续发育，并放弃突变阴性卵囊。
   注意:胚胎阶段的突变率估计可以大大加快G₁ 突变体的筛选。通常，如上所述，可以将3-6个发育的卵子作为一个样品混合，用于PCR介导的基因分型。
2. 按照步骤 4.4 中所述饲养 G₁ 若虫。切断约2mm长的触角以执行基于PCR的基因分型，如步骤4.5中所述，以检测G₁ 杂合子。根据制造商的说明（参见 材料表）进行TA克隆以鉴定其突变。使用具有相同突变的 G₁ 杂合子进行杂交以获得 G₂ 若虫。
   注意:PCR产物的Sanger测序只能提供发现杂合子的信息，但没有足够的信息来识别确切的突变。因此，需要使用PCR产物进行TA克隆以明确识别突变，并且可以促进稳定突变系的建立。
3. 饲养G₂ 若虫直到它们的第五龄。使用步骤5.2中描述的基于PCR的基因分型来鉴定适合进一步研究和稳定传代的纯合子和/或杂合子（图4B）。
   注意:注意避免纯合子和杂合子混合。建议在每一代中进行基于PCR的基因分型，以确认每个群体的纯合子和/或杂合性。用于此检查的蝗虫数量取决于种群规模。此外，蝗虫的数量可以通过杂交策略扩大。

6. 卵子冷冻保存和复苏

1. 用无菌水清洗要冷冻保存的鸡蛋，并如上所述（步骤3.8）在培养皿中孵育5-6天。将这些鸡蛋聚集在培养皿中，并用滤纸碎片覆盖它们。用石蜡膜包裹整个培养皿。
2. 将培养皿在25°C下保持2天，然后在相对较低的温度（13-16°C）下再保持2天。然后，将盘子转移到6°C冰箱中。每 2 周加入一次水，为鸡蛋提供潮湿的环境（图 5A）。
   注意:胚胎推测在30°C²⁶下发育5-6天后处于katatrepsis阶段。梯度冷却有助于鸡蛋的冷冻保存（表5）。
3. 为了复苏冷冻保存的卵子，将培养皿从冰箱中取出并在25°C下保持2天。将这些卵放入30°C孵化器中，直到若虫孵化（图5B）。
   注意:在将它们转移到30°C培养箱之前，有必要将冷冻保存的鸡蛋放在25°C。胚胎可以冷冻保存至少五个月，尽管孵化率和封闭率会因冷冻保存而降低（表5）。

结果

该协议包含生成迁徙蝗虫纯合突变体的详细步骤，RNP由Cas9蛋白和 体外 合成的sgRNA组成。以下是CRISPR/Cas9介导的靶基因敲除在蝗虫中的一些代表性结果，包括靶标选择、sgRNA合成和验证（图1A）、卵子采集和注射、突变体筛选和传代、冷冻保存和纯合子卵的复苏。

在这项研究中，根据三个在线程序（E-CRISP，CRISPOR和ZiFit）的结果选择CRISPR / Cas9系统的?...

讨论

自人类文明以来，蝗虫一直是对农业最具破坏性的害虫之一²³.基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术是更好地了解蝗虫生物学机制以及有前途的害虫控制策略的有力工具。因此，开发一种高效且易于使用的CRISPR/Cas9介导的纯合蝗虫突变体构建方法具有很大的益处。尽管已经报道了一些伟大的工作，并为蝗虫基因组编辑提供了一些基本的工作流程¹⁸，^20，21

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10×NEBuffer r3.1	New England Biolabs	B7030S	The buffer of  in vitro Cas9 cleavage assays
2xEs Taq MasterMix (Dye)	Cwbio	CW0690	For gene amplification
2xPfu MasterMix (Dye)	Cwbio	CW0686	For gene amplification
CHOPCHOP			Online website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/.
CRISPOR			Online website for designing sgRNAs, http://crispor.org.
CRISPRdirect			Online website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/.
Electrophoresis power supply	LIUYI BIOLOGY	DYY-6D	Separation of nucleic acid molecules of different sizes
Eppendorf Tube	Eppendorf	30125177	For sample collection, etc.
Fine brushes	Annigoni	1235	For cleaning and isolating eggs. Purchased online.
Flaming/brown micropipette puller	Sutter Instrument	P97	For making the microinjection needles
Gel Extraction Kit	Cwbio	CW2302	DNA recovery and purification
Gel Imaging Analysis System	OLYMPUS	Gel Doc XR	Observe the electrophoresis results
GeneTouch Plus	Bioer	B-48DA	For gene amplification
Glass electrode capillary	Gairdner	GD-102	For making injection needles with a micropipette Puller
Incubator	MEMMERT	INplus55	For migratory locust embryo culture
Metal bath	TIANGEN	AJ-800	For heating the sample
Micro autoinjector	Eppendorf	5253000068	Microinjection of embryos early in development
Micro centrifuge	Allsheng	MTV-1	Used for mixing reagents
Microgrinder	NARISHIGE	EG-401	To ground the tip of injection needle
Microloader	Eppendorf	5242956003	For loading solutions into the injection needles.
Micromanipulation system	Eppendorf	TransferMan 4r	An altinative manipulation system for microinjection
Microscope	cnoptec	SZ780	For microinjection
Motor-drive Manipulator	NARISHIGE	MM-94	For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure
Multi-Sample Tissue Grinder	jingxin	Tissuelyser-64	Grind and homogenize the eggs
ovipisition pot	ChangShengYuanYi	CS-11	Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online.
Parafilm	ParafilmM	PM996	For wrapping the petri dishes.
pEASY-T3 Cloning Kit	TransGen Biotech	CT301-01	For TA cloning
Petri dish	NEST	752001	For culture and preservation of  the eggs.
Pipettor	Eppendorf	Research®plus	For sample loading
plastic culture cup			For rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online.
Precision gRNA Synthesis Kit	Thermo	A29377	For sgRNA synthesis
Primer Premier	PREMIER Biosoft	Primer Premier 5.00	For primer design
SnapGene	Insightful Science	SnapGene®4.2.4	For analyzing  sequences
Steel balls	HuaXinGangQiu	HXGQ60	For sample grinding.Purchased online.
Tips	bioleaf	D781349	For sample loading
Trans DNA Marker II	TransGen Biotech	BM411-01	Used to determine gene size
TrueCut Cas9 Protein v2	Thermo	A36496	Cas9 protein
UniversalGen DNA Kit	Cwbio	CWY004	For genomic DNA extraction
VANNAS Scissors	Electron Microscopy Sciences	72932-01	For cutting off the antennae
Wheat			To generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers.
ZiFiT			Online website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.