مطيافية نيوترونية عالية الدقة لدراسة ديناميكيات بيكو ثانية-نانوثانية للبروتينات ومياه الترطيب

Summary

يوفر التحليل الطيفي للتشتت العكسي للنيوترونات وصولا غير مدمر وخالي من الملصقات إلى ديناميكيات ps-ns للبروتينات ومياه ترطيبها. يتم تقديم سير العمل مع دراستين حول بروتينات الأميلويد: حول ديناميكيات الليزوزيم التي تم حلها زمنيا أثناء التجميع وعلى ديناميكيات الماء المائية لتاو عند تكوين الألياف.

Abstract

يوفر تشتت النيوترونات إمكانية سبر الديناميكيات داخل العينات لمجموعة واسعة من الطاقات بطريقة غير مدمرة وبدون تسمية بخلاف الديوتيريوم. على وجه الخصوص ، يسجل التحليل الطيفي للتشتت العكسي للنيوترونات إشارات التشتت بزوايا تشتت متعددة في وقت واحد وهو مناسب تماما لدراسة ديناميكيات الأنظمة البيولوجية على مقياس ps-ns الزمني. من خلال استخدام D₂O - وربما مكونات عازلة متوقفة - تسمح الطريقة بمراقبة كل من انتشار مركز الكتلة وحركات العمود الفقري والسلسلة الجانبية (الديناميات الداخلية) للبروتينات في الحالة السائلة.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دراسة ديناميكيات مياه الترطيب عن طريق استخدام مساحيق من البروتينات المثبطة المرطبة ب H₂O. تقدم هذه الورقة سير العمل المستخدم على الأداة IN16B في معهد Laue-Langevin (ILL) للتحقيق في ديناميكيات البروتين والماء المائي. يتم شرح تحضير عينات المحلول وعينات مسحوق البروتين المائي باستخدام تبادل البخار. يتم وصف إجراء تحليل البيانات لكل من ديناميات البروتين والماء الإماهة لأنواع مختلفة من مجموعات البيانات (الأطياف شبه المرنة أو عمليات المسح ذات النافذة الثابتة) التي يمكن الحصول عليها على مطياف التشتت العكسي للنيوترونات.

يتم توضيح الطريقة من خلال دراستين تتضمنان بروتينات الأميلويد. يظهر أن تجميع الليزوزيم إلى مجاميع كروية بحجم ميكرومتر - يشار إليها بالجسيمات - يحدث في عملية من خطوة واحدة على النطاق المكاني والزمني الذي تم فحصه في IN16B ، بينما تظل الديناميكيات الداخلية دون تغيير. علاوة على ذلك ، تمت دراسة ديناميات ماء الترطيب في تاو على مساحيق رطبة من البروتين perdeuteated. يتبين أن الحركات الانتقالية للماء يتم تنشيطها عند تكوين ألياف الأميلويد. أخيرا ، تتم مناقشة الخطوات الحاسمة في البروتوكول حول كيفية وضع تشتت النيوترونات فيما يتعلق بدراسة الديناميات فيما يتعلق بالطرق الفيزيائية الحيوية التجريبية الأخرى.

Introduction

النيوترون هو جسيم ضخم بدون شحنة تم استخدامه بنجاح على مر السنين لفحص العينات في مختلف المجالات من الفيزياء الأساسية إلى علم الأحياء¹. بالنسبة للتطبيقات البيولوجية ، يتم استخدام تشتت النيوترونات بزاوية صغيرة ، وتشتت النيوترونات غير المرن ، وعلم البلورات النيوتروني وقياس الانعكاس على نطاق واسع²،^3،4. يوفر تشتت النيوترونات غير المرن قياسا متوسطا للديناميكيات دون الحاجة إلى وضع علامات محددة في حد ذاتها ، وجودة إشارة لا تعتمد على الحجم أو البروتين⁵. يمكن إجراء القياس باستخدام بيئة معقدة للغاية للبروتين قيد الدراسة الذي يحاكي الوسط داخل الخلايا ، مثل المحللة البكتيرية المنزوعة أو حتى في الجسم الحي³،^6،7. يمكن استخدام إعدادات تجريبية مختلفة لدراسة الديناميات ، وهي i) وقت الرحلة الذي يمنح الوصول إلى ديناميكيات ps-ps الفرعية ، ii) الوصول إلى التشتت العكسي إلى ديناميكيات ps-ns ، و iii) الوصول إلى الصدى المغزلي إلى الديناميكيات من ns إلى مئات ns. يستخدم التشتت العكسي للنيوترونات قانون براغ 2d sinθ = nλ ، حيث d هي المسافة بين المستويات في البلورة ، و θ زاوية التشتت ، و n ترتيب التشتت ، و λ الطول الموجي. يسمح استخدام البلورات للتشتت العكسي نحو أجهزة الكشف بتحقيق دقة عالية في الطاقة ، عادة ~ 0.8 μeV. لقياس تبادل الطاقة ، يتم استخدام إما محرك دوبلر يحمل بلورة في التشتت العكسي لتحديد وضبط الطول الموجي النيوتروني الوارد⁸،^9،10 (الشكل 1) ^، أو يمكن استخدام إعداد وقت الرحلة على حساب انخفاض في دقة الطاقة¹¹.

الشكل 1: رسم مطياف التشتت العكسي للنيوترونات بمحرك دوبلر. يصطدم الشعاع الوارد بمروحية تحويل فضاء الطور (PST)⁴² ، مما يزيد من التدفق في موضع العينة. ثم يتم تشتيتها مرة أخرى نحو العينة بواسطة محرك دوبلر ، الذي يختار الطاقة E₁ (السهم السماوي). ثم يتم تشتيت النيوترونات بواسطة العينة (مع طاقات مختلفة ممثلة بلون الأسهم) والمحللين ، المصنوع من بلورات Si 111 ، سوف ينتشر فقط النيوترونات ذات الطاقة المحددة E₀ (الأسهم ذات اللون الأحمر هنا). ومن ثم ، يتم الحصول على نقل الزخم q من الموضع المكتشف للنيوترون على صفيف الكاشف ، ويتم الحصول على نقل الطاقة من الفرق E₁- E₀. يتم استخدام وقت الرحلة المتوقع لنبضة النيوترون التي تنتجها PST لتجاهل الإشارة من النيوترونات المنتشرة مباشرة نحو أنابيب الكاشف. اختصار: PST = تحويل مساحة الطور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالنسبة للتحليل الطيفي للتشتت العكسي ، تأتي المساهمة الرئيسية في الإشارة من العينات الغنية ببروتون الهيدروجين ، مثل البروتينات ، من التشتت غير المترابط ، حيث تظهر شدة التشتت S_inc (q ، ω) بواسطة Eq (1) ¹²

(1)

حيث σ_inc هو المقطع العرضي غير المترابط للعنصر المعتبر ، k 'هو معيار المتجه الموجي المتناثر ، k هو معيار المتجه الموجي الوارد ، q (= k - k') نقل الزخم ، r j (t) متجه موضع الذرة _j في الوقت t ، و ω التردد المقابل لنقل الطاقة بين النيوترون الوارد والنظام. تشير الأقواس الزاوية إلى متوسط المجموعة. ومن ثم ، فإن التشتت غير المترابط يسبر الارتباط الذاتي للجسيم الواحد متوسط المجموعة لمواقع الذرة مع الوقت ويعطي متوسط الديناميكيات الذاتية على جميع الذرات في النظام وأصول زمنية مختلفة (متوسط المجموعة). دالة التشتت هي تحويل فورييه في زمن دالة التشتت الوسيطة I (q، t) ، والتي يمكن اعتبارها تحويل فورييه في الفضاء لدالة ارتباط فان هوف الموضحة بواسطة Eq (2):

(2)

حيث ρ (r، t) هي كثافة احتمال إيجاد ذرة في الموضع r والوقت t ¹³.

بالنسبة لعملية الانتشار الويكي ، تنتج دالة الانتشار الذاتي (انظر Eq (3)) بعد تحويل فورييه المزدوج في دالة تشتت تتكون من لورنتزيان بعرض الخط المعطى بواسطة γ = Dq².

(3)

تم تطوير نماذج أكثر تطورا ووجدت مفيدة مثل نموذج انتشار القفز بواسطة Singwi و Sjölander لديناميات البروتين الداخلية^{ps-ns 14} أو نموذج الدوران بواسطة Sears لمياه الترطيب¹⁵،^16،17.

على أداة التشتت العكسي للنيوترونات (NBS) IN16B ^8,9 في ILL، غرونوبل، فرنسا (الشكل التكميلي S1)، يتكون الإعداد الذي يشيع استخدامه مع البروتينات من بلورات Si 111 للمحللات مع محرك دوبلر لضبط الطول الموجي الوارد (الشكل التكميلي S2A)، مما يتيح الوصول إلى نطاق نقل الزخم ~ 0.2 Å-1 < q < ~ 2 ^Å-1 ونطاق نقل الطاقة -30 μeV < < 30 μeV المقابلة لجداول زمنية تتراوح من بضعة ps إلى عدد قليل من ns ومسافات قليلة Å. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر IN16B إمكانية إجراء عمليات مسح مرنة وغير مرنة للنافذة الثابتة (E / IFWS) ¹⁰ ، والتي تشمل الحصول على البيانات عند نقل الطاقة الثابتة. نظرا لأن التدفق محدود عند العمل مع النيوترونات ، فإن E / IFWS يسمح بتعظيم التدفق لنقل طاقة واحد ، وبالتالي تقليل وقت الاكتساب اللازم للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء مرضية. والخيار الأحدث هو النمط¹¹ لمطياف التشتت العكسي ووقت الطيران (BATS) ، والذي يسمح بقياس مجموعة واسعة من عمليات نقل الطاقة ، (على سبيل المثال ، -150 μeV < < 150 μeV) ، مع تدفق أعلى من محرك دوبلر ، ولكن على حساب دقة طاقة أقل (الشكل التكميلي S2B).

من الخصائص المهمة لتشتت النيوترونات أن المقطع العرضي غير المترابط σ_inc له قيمة أعلى 40 مرة للهيدروجين من الديوتيريوم ولا يكاد يذكر بالنسبة للعناصر الأخرى التي توجد عادة في العينات البيولوجية. لذلك ، يمكن دراسة ديناميكيات البروتينات في بيئة سائلة باستخدام مخزن مؤقت مقسم ، وتسمح حالة المسحوق بدراسة إما الديناميات الداخلية للبروتين مع مسحوق البروتين المهدرج المبلل ب D 2 O ، أودراسة ماء الترطيب لمسحوق البروتين perdeuterated المائي باستخدام H₂O. في الحالة السائلة ، يسمح التشتت العكسي للنيوترونات عادة بالوصول في وقت واحد إلى الانتشار الذاتي لمركز الكتلة للبروتينات (الانتشار من نوع Fickian) وديناميكياتها الداخلية. هذه الأخيرة هي حركات العمود الفقري والسلسلة الجانبية التي يصفها عادة ما يسمى نموذج انتشار القفز أو غيره ^3,18. في مساحيق البروتين المهدرجة ، يكون انتشار البروتين غائبا ويجب نمذجة الديناميات الداخلية فقط. بالنسبة لمياه الإماهة ، فإن مساهمات الحركات الانتقالية والدورانية لجزيئات الماء تقدم اعتمادا مختلفا على نقل الزخم q ، مما يسمح بتمييزها في عملية تحليل البيانات¹⁷.

توضح هذه الورقة طريقة التشتت العكسي للنيوترونات مع دراسة البروتينات التي وجد أنها قادرة على التكشف ، وتتجمع في شكل قانوني يتكون من أكوام من خيوط β - ما يسمى بنمط β المتقاطع^19،20 - وتشكل أليافا ممدودة. هذا هو ما يسمى بتجميع الأميلويد ، والذي تمت دراسته على نطاق واسع بسبب دوره المركزي في الاضطرابات التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر أو مرض باركنسون^21,22. إن دراسة بروتينات الأميلويد مدفوعة أيضا بالدور الوظيفي الذي يمكن أن تلعبه ^23,24 أو إمكاناتها العالية لتطوير مواد حيوية جديدة²⁵. لا تزال المحددات الفيزيائية والكيميائية لتجميع الأميلويد غير واضحة ، ولا تتوفر نظرية عامة لتجميع الأميلويد ، على الرغم من التقدم الهائل خلال السنوات الماضية^21,26.

ينطوي تجميع الأميلويد على تغييرات في بنية البروتين واستقراره مع مرور الوقت ، والتي تنطوي دراستها بشكل طبيعي على ديناميكيات مرتبطة باستقرار تكوين البروتين ، ووظيفة البروتين ، ومشهد طاقة البروتين²⁷. ترتبط الديناميكيات ارتباطا مباشرا باستقرار حالة معينة من خلال المساهمة الإنتروبية لأسرع الحركات²⁸ ، ويمكن الحفاظ على وظيفة البروتين من خلال الحركات على نطاقات زمنية مختلفة من sub-ps للبروتينات الحساسة للضوء²⁹ إلى ms لحركات المجال ، والتي يمكن تسهيلها بواسطة ديناميكيات بيكو ثانية^{نانو ثانية 30}.

سيتم تقديم مثالين على استخدام التحليل الطيفي للتشتت العكسي للنيوترونات لدراسة بروتينات الأميلويد ، أحدهما في الحالة السائلة لدراسة ديناميكيات البروتين والآخر في حالة المسحوق المائي لدراسة ديناميكيات الماء المماهة. يتعلق المثال الأول بتجميع الليزوزيم في كرات بحجم ميكرومتر (تسمى الجسيمات) متبوعة في الوقت الفعلي⁵ ، والثاني مقارنة لديناميكيات المياه في الحالات الأصلية والمجمعة للبروتين البشري تاو³¹.

الليزوزيم هو إنزيم يشارك في الدفاع المناعي ويتكون من 129 من بقايا الأحماض الأمينية. يمكن أن يشكل الليزوزيم جسيمات في المخزن المؤقت المثبط عند pD 10.5 وعند درجة حرارة 90 درجة مئوية. مع تشتت النيوترونات ، أظهرنا أن التطور الزمني لمعامل انتشار مركز الكتلة للليزوزيم يتبع الحركية الأسية المفردة لتألق ثيوفلافين T (مسبار فلوري يستخدم لمراقبة تكوين أنماط β المتقاطع الأميلويد³²) ، مما يشير إلى أن الهياكل الفوقية للجسيمات وأنماط β المتقاطع تحدث في خطوة واحدة بنفس المعدل. علاوة على ذلك ، ظلت الديناميات الداخلية ثابتة طوال عملية التجميع ، والتي يمكن تفسيرها إما من خلال تغيير توافقي سريع لا يمكن ملاحظته على أدوات NBS ، أو من خلال عدم وجود تغيير كبير في الطاقة الداخلية للبروتين عند التجميع.

البروتين البشري تاو هو بروتين مضطرب جوهريا (IDP) يتكون من 441 من الأحماض الأمينية لما يسمى ب 2N4R isoform ، والذي يشارك بشكل خاص في مرض الزهايمر³³. باستخدام التشتت العكسي للنيوترونات على مساحيق بروتين تاو perdeuterated ، أظهرنا أن ديناميكيات الماء المائيات تزداد في حالة الألياف ، مع وجود عدد أكبر من جزيئات الماء التي تخضع لحركات متعدية. تشير النتيجة إلى أن الزيادة في إنتروبيا الماء المائي قد تؤدي إلى رجفان الأميلويد في تاو.

Protocol

1. إعداد المخزن المؤقت deuterated للبروتينات في الحالة السائلة

1. حل جميع مكونات المخزن المؤقت في D₂O النقي.
2. إذا تمت معايرة قطب الأس الهيدروجيني في H₂O ، فاضبط pD وفقا للصيغة pD = pH + 0.4 باستخدام NaOD أو DCl³⁴.
   ملاحظة: قد يؤثر استخدام D 2O بدلا من H₂O على قابلية ذوبان البروتين وقد تحتاج الظروف العازلة إلى التكيف (على سبيل المثال ، عن طريق تغيير طفيف في تركيز الملح).

2. تحضير مساحيق H₂O المائية من البروتين perdeuterated

1. تحضير حامل العينة.
   1. قم بتنظيف حامل عينة الألمنيوم المسطح تماما باستخدام ختم سلك الإنديوم والبراغي بالماء والإيثانول واتركه يجف.
      ملاحظة: يتم استخدام حامل عينة مسطح بحيث يمكن توزيع المسحوق بشكل متجانس على السطح. يجب أن تكون كمية المسحوق كافية بحيث يمكن الحفاظ عليها بين الجدران ولا تسقط عند وضع حامل العينة عموديا.
   2. قم بوزن الأجزاء المختلفة من قاع حامل العينة والغطاء وسلك الإنديوم بشكل منفصل على ميزان دقيق.
   3. ضع ختم سلك الإنديوم 1 مم في أخدود الجزء السفلي من حامل العينة ، تاركا تداخلا صغيرا حيث ينضم الطرفان (الشكل 2 أ).
   4. ضع كمية مناسبة من البروتين المجفف بالتجميد (عادة ~ 100 ملغ من البروتين) بحيث يملأ السطح الداخلي للجزء السفلي من حامل العينة.
2. رطب مسحوق البروتين.
   1. ضع حامل العينة في مجفف مع طبق بتري يحتوي على مسحوق P₂O₅ لمدة 24 ساعة لتجفيف مسحوق البروتين تماما³⁵ (الشكل 2B). قم بوزن الجزء السفلي الجاف من حامل العينة الذي يحتوي على ختم الإنديوم والمسحوق الجاف للحصول على_{م جاف}.
      تنبيه: مسحوق P₂O₅ تآكل للغاية.
   2. أخرج P 2 O₅ من المجفف وضع طبق بتري مع D₂O بالداخل. تحكم في كتلة المسحوق بانتظام للتحقق من مستوى الترطيب h = m hyd / m الجاف حيث m_hyd و m_dry هما كتلة المسحوق المائي والمسحوق_الجاف ، على التوالي.
      ملاحظة: بالنسبة للبروتينات الكارهة للماء مثل الأنسولين ، قد يكون من الضروري زيادة درجة الحرارة داخل المجفف للحصول على ضغط بخار أعلى والوصول إلى مستوى الترطيب المطلوب h.
   3. كرر الخطوتين 2.2.1 و 2.2.2 ثلاث مرات على الأقل لتحويل جميع الهيدروجين القابل للتبديل إلى الديوترونات بشكل صحيح.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام دورات التجفيف بالتجميد والذوبان في D₂O النقي لتحسين تبادل H / D بشرط ألا يتأثر البروتين به.
   4. قم بترطيب المسحوق إلى أعلى قليلا من المستوى المطلوب ، واترك الجزء السفلي من حامل العينة بسلك الإنديوم والمسحوق المائي على ميزان الدقة ، وانتظر حتى تنخفض الكتلة ببطء إلى القيمة المطلوبة للحصول على الهدف h (عادة 0.2-0.4 إذا كان البروتين الكروي متوسط الحجم سيتم تغطيته بطبقة ترطيب كاملة واحدة).
   5. ضع الغطاء بسرعة على الجزء السفلي وأغلق حامل العينة أولا بأربعة براغي لإيقاف تبادل البخار (الشكل التكميلي S3A).
   6. ضع جميع البراغي المتبقية وأحكمها حتى لا تظهر فجوة بين الجزء السفلي والغطاء (الشكل التكميلي S3B).
   7. قم بوزن حامل العينة المختوم للتحقق من أي فقد محتمل للترطيب عن طريق التسريبات بعد تجربة النيوترونات.

3. إجراء تجربة تشتت النيوترونات غير المتماسكة

1. ناقش وتحقق مرة أخرى من تكوين الأداة اللازمة للتجربة مع جهة الاتصال المحلية قبل بضعة أسابيع من وقت الحزمة المعين.
2. تحضير عينة الحالة السائلة.
   1. حل البروتين في المخزن المؤقت deuteated.
   2. تحديد الحجم المناسب للسائل الذي سيتم وضعه في حامل العينة باستخدام الماء (تأكد من عدم وجود فائض عند إغلاق حامل العينة ؛ الشكل 2 ج).
      ملاحظة: تصف الخطوتان التاليتان (3.3 و 3.4) تجربة أجريت على مطياف NBS IN16B في ILL ^8,9 ، باستخدام فرن التبريد كبيئة عينة. سيتغير نظام التحكم في الأداة من أداة إلى أخرى ، لكن مبادئ العمل تظل كما هي.
3. أدخل العينة.
   1. جفف عصا العينة تماما (الشكل 2D) ، وأزل العينة السابقة ، إن وجدت ، بعد التحقق من أن جرعة الإشعاع المؤين أقل من 100 μSv / h قبل التعامل مع أي مادة (في ILL).
   2. ضع العينة ، وتحقق من التمركز المناسب بالنسبة لمركز الحزمة (الشكل التكميلي S4) ، وأدخل عصا العينة في فرن التبريد (الشكل 2D). قم بتشغيل مضخة التفريغ للوصول إلى أقل من ^10-3 بار ، واطرد الهواء داخل فرن التبريد عن طريق تكرار ثلاث مرات التالية: املأ فرن التبريد بغاز الهيليوم حتى يتم الوصول إلى الضغط الجوي ، وقم بإزالة الغاز مرة أخرى باستخدام مضخة التفريغ.
      ملاحظة: في حالة حامل العينة المسطح ، يجب توجيه حامل العينة بزاوية 45 درجة بالنسبة إلى الحزمة الواردة. يمكن تقليل نطاق نقل الزخم المفيد بسبب الامتصاص والتشتت بواسطة الخلية. يمكن استخدام ممتص نيوتروني قوي مثل الكادميوم لإخفاء أجزاء معينة من حامل العينة (على سبيل المثال ، البراغي والأجزاء السميكة).
   3. أدخل بعض غاز الهيليوم في فرن التبريد بحيث يكون الضغط ~ 0.05 بار.
4. الحصول على البيانات (على سبيل المثال ، باستخدام NOMAD على IN16B في ILL ، يفترض أن المستخدم يفضل درجة حرارة 200 K قبل الحصول على طيف طيف نيوتروني شبه مرن (QENS) ، ثم E / IFWS أثناء منحدر درجة الحرارة إلى 310 K عند 0.5 K في الدقيقة وأخيرا QENS عند 310 K).
   1. باستخدام NOMAD ، في علامة تبويب التنفيذ ، اسحب وحدة تحكم FurnaceCryostat وأفلتها في لوحة التشغيل. اضبط درجة الحرارة على 200 كلفن. استخدم الوضع السريع ومهلة 30 دقيقة بحيث يكون لدرجة الحرارة وقت للاستقرار. انقر على أيقونة الأسهم الدوارة لتشغيلها في الخلفية بحيث يمكن الحصول على البيانات أثناء انخفاض درجة الحرارة.
   2. اسحب وحدة التحكم IN16DopplerSettings وأفلتها، واضبط ملف تعريف السرعة على السرعة الدقيقة التي تم تعيينها بواسطة Max ΔE، وقيمة 0.00 μeV و128 قناة للحصول على تكوين EFWS.
   3. قم بسحب وإسقاط وحدة تحكم العد ، واملأ حقل العنوان الفرعي باسم يسمح بسهولة التعرف على البيانات ، وقم بتعيين 60 تكرارا لمسح 30 ثانية (الشكل التكميلي S5A).
   4. اسحب وحدة تحكم IN16DopplerSettings وأفلتها، واضبط ملف تعريف السرعة على Sine الذي تم تعيينه بواسطة Speed بقيمة 4.5 m/s و2048 قناة للحصول على تكوين QENS.
   5. قم بسحب وإسقاط وحدة تحكم العد مع 4 تكرارات لمدة 30 دقيقة من عمليات المسح الضوئي (الشكل التكميلي S5B).
   6. بالنسبة لمنحدر درجة الحرارة ، اسحب وحدة تحكم FurnaceCryostat وأفلتها ، واضبط درجة الحرارة على 310 K ، واضبط المنحدر على SetPoint مع Δ = 0.05 K و 6 ثوان. استخدم وقتا من 220 دقيقة (الشكل التكميلي S6A).
   7. استخدم حلقة for مع 65 تكرارا. في الداخل ، أدخل وحدة تحكم IN16DopplerSettings كما في الخطوة 3.4.2 ، متبوعة بعدد واحد يبلغ 30 ثانية. بعد ذلك ، أدخل IN16DopplerSettings ، كما هو موضح سابقا ولكن باستخدام إزاحة طاقة تبلغ 1.5 μeV و 1024 قناة متبوعة بعدد واحد قدره 3 دقائق (الشكل التكميلي S6B).
   8. للحصول على آخر QENS عند 310 كلفن، قم بسحب وإفلات وحدات التحكم IN16DopplerSettings وCount التي تم تكوينها كما هو موضح في الخطوتين 3.4.4 و3.4.5 على التوالي.
   9. اضغط على زر البدء (مثلث قائم الزاوية في أسفل النافذة) لتشغيل البرنامج النصي.
      ملاحظة: ستتطلب كل تجربة الحصول على بيانات المعايرة. أي الخلية الفارغة لتصحيحات الطرح أو الامتصاص ، والمخزن المؤقت وحده في درجات الحرارة المختلفة المستخدمة لنمذجة الخلفية ، وقياس الفاناديوم (أو ما يعادله ، العينة عند درجة حرارة 10 كلفن أو أقل) للحصول على وظيفة دقة الجهاز.

4. تحليل البيانات - QENS

1. قم باستيراد مجموعة البيانات باستخدام طريقة 'IN16B_QENS.process()' في برنامج Python nPDyn v3.x³⁶
   >>>> من nPDyn.dataParsers استيراد IN16B_QENS
   
   >>> العينة = IN16B_QENS(
   ... <المسار إلى ملفات البيانات>
   ... [detGroup = < عدد صحيح أو ملف تجميع كاشف في XML
   ... الشكل>]
   ... ). عملية ()
   
   >>> عينة = sample.get_q_range (0.3 ، 1.8)
2. قم بإجراء تصحيحات البيانات (اختياري) باستخدام الأوامر التالية (انظر وثائق nPDyn لمزيد من المعلومات ، الشكل 3):
   يفترض #it أن بيانات الخلية الفارغة والفاناديوم والمخزن المؤقت
   # تم استيرادها بالفعل في مجموعة بيانات تسمى "empty_cell" ، "الفاناديوم" ،
   # و "المخزن المؤقت" ، على التوالي.
   
   # لطرح الخلية الفارغة بعامل تحجيم
   # (يتم نشر الأخطاء تلقائيا)
   >>> عينة = عينة - 0.95 * empty_cell
   
   # للتصحيح باستخدام معامل بالمان بينغ
   # (حصري بشكل متبادل مع المثال أعلاه)
   >>> العينة = sample.absorptionCorrection(empty_cell)
   
   # للتطبيع
   >>> عينة = عينة.تطبيع (الفاناديوم)
   
   # للتجميع على طول المحور الذي يمكن ملاحظته
   # يمكن ملاحظته هو وقت التجميع هنا
   >>> العينة = العينة .bin (3 ، المحور = 0)
3. تناسب بيانات المعايرة. يمكن تركيب عينات مجموعة البيانات والخلية الفارغة والمخزن المؤقت المخفف (إذا لزم الأمر) والفاناديوم باستخدام نماذج مدمجة أو نموذج محدد من قبل المستخدم (انظر وثائق nPDyn):
   >>> من استيراد nPDyn.models.builtins (
   ... نموذجPVoigt,
   ... نموذجالمياه,
   ... نموذجمعايرةD2O,
   ... )
   
   # تستخدم النماذج المدمجة متجه عمود للزخم
   # نقل قيم q
   >>> q = الفاناديوم.q[:, لا يوجد]
   
   # يتم تركيب الفاناديوم باستخدام ملف تعريف زائف Voigt
   >>> الفاناديوم.فيت (نموذجPVoigt (ف))
4. استخدم النموذج المدمج لمياه الترطيب المسمى "modelWater". يقرأ هذا النموذج كما هو موضح بواسطة مكافئ (4) ¹⁷
   (4)
   حيث₀ و_r و_t هي أعداد قياسية تمثل المساهمة النسبية للإشارة المرنة والحركات الدورانية والحركات الانتقالية ، على التوالي ؛ j₁ (qd) هي دالة^{بيسل الكروية} من الدرجة l th ، مع q هي نقل الزخم ؛ د مسافة O-H في جزيء الماء ؛ δ (ω) هي دلتا ديراك ، والتي يتم ضربها في EISF هنا ؛ N هو أعلى ترتيب لدالة Bessel الكروية المستخدمة (عادة ~ 5) ؛ وهي الحركات الدورانية والانتقالية لورنتزيان ، على التوالي ؛ ب (ف) هو مصطلح خلفية مسطح. تعطي دوال Bessel الكروية المساهمة النسبية لكل حالة زخم زاوية لجزيئات الماء ، ويتم تحديد الرقم N بناء على نطاق q لنقل الزخم. في حالة مطياف NBS النموذجي ، فإن المصطلحات حتى N = 4 تشرح الإشارة بالكامل تقريبا (الشكل التكميلي S7).
   # هنا ، يتم استخدام المعادلة 2 لمياه الترطيب
   # الالتفاف مع وظيفة القرار وإضافة
   # تتم خلفية D2O تلقائيا باستخدام ملف
   # الحجج المقدمة
   >>> sample.fit (modelWater (q) ،
   ... الدقة = الفاناديوم ،
   ... bkgd = العازلة ،
   ... volume_fraction_bkgd=0.95
   ... )
   ملاحظة: يجب أن تكون مساهمات الحركات الدورانية والانتقالية معقدة لتكون صارمة تماما. يعزى نجاح النموذج الإضافي إلى وجود مجموعات متميزة من الماء على سطح البروتين ونطاق الطاقة المحدود الذي يمكن الوصول إليه.
5. استخدم ما يلي لرسم البيانات (الشكل 4):
   >>> من قطعة أرض استيراد nPDyn.plot
   مؤامرة >>> (عينة)

5. تحليل البيانات - منحدر درجة الحرارة ، مسح النافذة الثابتة المرنة (EFWS)

1. استخدم إجراء مشابها للقسم 4 لتطبيع بيانات منحدر درجة الحرارة بواسطة الإشارة عند أدنى درجة حرارة (عادة 10 كلفن):
   >>> من nPDyn.dataParsers استيراد IN16B_FWS
   
   >>> عينة = IN16B_FWS(
   ... <المسار إلى ملفات البيانات> ،
   ... detGroup=[detGroup=<ملف تجميع عدد صحيح أو كاشف بتنسيق XML>]
   ... ). عملية ()
   
   # التطبيع مع النقاط ال 5 الأولى على ما يمكن ملاحظته
   # المحور ، والتي تتوافق مع درجة الحرارة
   >>> عينة /= عينة [:5].يعني (0)
   
   # نطاق Q لنقل الزخم المستخدم هنا أصغر
   # حيث أن النموذج المستخدم صالح ل Low Q فقط
   >>> عينة = sample.get_q_range (0.2 ، 0.8)
2. استخدم نموذجا غاوسيا بسيطا للبدء ، يتم إعطاء عرضه بواسطة ما يسمى بمتوسط الإزاحة التربيعية (MSD). قم ببناء النموذج وملاءمته باستخدام الأوامر التالية:
   >>> استيراد numpy ك np
   >>> من nPDyn.models استيراد المعلمات والنموذج والمكون
   
   # أ هو عامل التحجيم
   >>> المعلمات = المعلمات (
   ... a={'value': 1، 'bounds': (0, np.inf)},
   ... msd = {'القيمة': 1 ، 'الحدود': (0 ، np.inf)}
   ... )
   
   >>> نموذج = نموذج (معلمات)
   >>> model.addComponent(Component(
   ... "غاوسي" ،
   ... لامدا س ، أ ، إم إس دي: أ * NP.exp (-x ** 2 * MSD / 6)
   ... ))
   
   >>> sample.fit (نموذج ، x = sample.q [: ، لا شيء])
   
   مؤامرة >>> (عينة)
   ملاحظة: ينطبق تقريب Gaussian دائما على q²MSD << 1 ، ولكن يمكن استخدام نطاق نقل زخم أوسع للمقارنة النسبية بين العينات. تم تطوير نماذج أكثر تطورا ، والتي تتجاوز التقريب الغاوسي ،³⁷،^38،39.

6. تحليل البيانات - عمليات المسح المرنة وغير المرنة للنوافذ الثابتة (E / IFWS)

1. على غرار الخطوة 4 ، قم باستيراد مجموعة البيانات ولكن باستخدام الفئة "IN16B_FWS":
   >>> من nPDyn.dataParsers استيراد IN16B_FWS
   
   >>> عينة = IN16B_FWS(
   ... <المسار إلى ملفات البيانات>
   ... [detGroup = <ملف تجميع عدد صحيح أو كاشف بتنسيق XML>]
   ... ). عملية ()
   
   >>> عينة = sample.get_q_range (0.3 ، 1.8)
2. تناسب بيانات المعايرة وبيانات العينة.
   1. قم بتحليل بيانات E / IFWS باستخدام MSD⁴⁰ المعمم أو من خلال اعتبارها أطياف QENS الخشنة (مع وجود عدد قليل فقط من نقاط البيانات على محور الطاقة). عندما ينظر إلى E / IFWS على أنه QENS-خشن ، يتم استخدام النماذج المستخدمة في QENS لتناسب مجموعة بيانات E / IFWS بأكملها في وقت واحد (التوافق العالمي لعمليات نقل الطاقة وتحويلات الزخم).
      ملاحظة: يتم استخدام نماذج استخدام الحل الأخير ل QENS على بيانات E / IFWS هنا حيث يتم فرض اعتماد نقل الزخم لانتشار مركز الكتلة والديناميات الداخلية للبروتين.
   2. نموذج ديناميكيات البروتين في السوائل باستخدام مكافئ البروتين التالي (5) ("modelProteinJumpDiff" في nPDyn):
      (5)
      حيث R (q، ω) هي دالة الدقة ؛ β عدد قياسي مستقل لكل نقل زخم q ؛ 0 هو عامل البنية غير المتماسكة المرنة (EISF) ؛ حساب لورنتزيان لانتشار مركز الكتلة بعرض معطى بواسطة Eq (6) ؛ هو لورنتزيان يتضمن انتشار مركز الكتلة ومساهمة بعد نموذج انتشار القفز¹⁴ الذي يمثل الديناميكيات الداخلية (Eq (7) ؛ كونها الإشارة المجهزة من D₂O المعاد قياسها بواسطة جزء حجمها في العينة.
      γ = د_ق^{س 2} (6)
      D_s هو معامل الانتشار الذاتي.
      (7)
      D_i هو معامل الانتشار الظاهر للديناميكيات الداخلية و τ وقت استرخاء للحركات الانتشارية.
      >>> من استيراد nPDyn.models.builtins (
      ... نموذجPVoigt,
      ... modelProteinJumpDiff,
      ... نموذجمعايرةD2O,
      ... )
      
      # تستخدم النماذج المدمجة متجه عمود للزخم
      # نقل قيم q
      >>> q = الفاناديوم.q[:, لا يوجد]
      
      # يتم تركيب الفاناديوم باستخدام ملف تعريف زائف Voigt
      >>> الفاناديوم.فيت (نموذجPVoigt (ف))
      
      # ل D2O النقي ، نموذج بعرض خط معاير
      # لدرجات حرارة مختلفة يتم تضمينها في nPDyn
      >>> buffer.fit (modelCalibratedD2O (q ، temp = 363))
      
      # هنا ، يتم استخدام المعادلة 3 للعينات السائلة
      # الالتفاف مع وظيفة القرار وإضافة
      # تتم خلفية D2O تلقائيا باستخدام # الوسيطات المقدمة
      >>> sample.fit (modelProteinJumpDiff (q) ،
      ... الدقة = الفاناديوم ،
      ... bkgd = العازلة ،
      ... volume_fraction_bkgd=0.95
      ... )
3. ارسم البيانات المجهزة باستخدام:
   >>> من قطعة أرض استيراد nPDyn.plot
   مؤامرة >>> (عينة)

النتائج

تم إجراء تجميع الليزوزيم في الجسيمات عند 90 درجة مئوية بتركيز بروتين 50 مجم / مل في مخزن مؤقت مقسم (0.1 M NaCl عند pD 10.5). يتم تشغيل تكوين الجسيمات من خلال زيادة درجة الحرارة إلى 90 درجة مئوية ويحدث في غضون 6 ساعات (الشكل التكميلي S8). تم الحصول على البيانات على IN16B ، كما هو موضح في البروتوكول أع?...

Discussion

التحليل الطيفي النيوتروني هو الطريقة الوحيدة التي تسمح بفحص ديناميكيات ps-ns ذات المتوسط الجماعي لعينات البروتين بغض النظر عن حجم البروتين أو تعقيد المحلول عند استخدام deuteration⁶. على وجه التحديد ، من خلال التحقيق في الانتشار الذاتي لمجموعات البروتين في المحلول ، يمكن تحديد الحجم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum sample holder			Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D	Sigma-Aldrich	543047
Deuterium oxide (D, 99.9%)	Eurisotop	DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease	Sigma-Aldrich	Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur	Sigma-Aldrich	1.5901
Glass dessicator	VWR	75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm	VWR	89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%	Alfa Aesar	00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg	Sigma-Aldrich	62970
nPDyn		v3.x	see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration	Dutscher	92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%	Sigma-Aldrich	214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL	Starlab	S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL	Starlab	S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL	Starlab	S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL	Starlab	S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL	Starlab	S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL	Starlab	S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D	Sigma-Aldrich	372072