JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم البروتوكول طريقة لاشتقاق عضويات الرئة البشرية من أنسجة الرئة الأولية ، وتوسيع عضويات الرئة وحث التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء 3D و 2D التي تنسخ بأمانة ظهارة مجرى الهواء البشري.

Abstract

عدم وجود نموذج قوي في المختبر للظهارة التنفسية البشرية يعيق فهم بيولوجيا وأمراض الجهاز التنفسي. نحن نصف بروتوكولا محددا لاشتقاق عضويات الرئة البشرية من الخلايا الجذعية البالغة في أنسجة الرئة وتحفيز التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء الناضجة. ثم يتم توسيع العضوية الرئوية على التوالي لأكثر من 1 سنة مع استقرار عالي، في حين يتم استخدام العضوية مجرى الهواء المتمايزة لمحاكاة مورفولوجيا ووظيفيا ظهارة مجرى الهواء البشري إلى مستوى شبه فسيولوجي. وبالتالي ، فإننا نؤسس نموذجا عضويا قويا لظهارة مجرى الهواء البشري. إن التوسع طويل الأجل في عضويات الرئة وعضويات مجرى الهواء المتمايزة يولد مصدرا مستقرا ومتجددا ، مما يمكن العلماء من إعادة بناء وتوسيع الخلايا الظهارية لمجرى الهواء البشري في أطباق الاستزراع. يوفر نظام الرئة العضوية البشرية نموذجا فريدا ونشطا من الناحية الفسيولوجية في المختبر لمختلف التطبيقات ، بما في ذلك دراسة التفاعل بين الفيروس والمضيف ، واختبار الأدوية ، ونمذجة الأمراض.

Introduction

أصبحت المواد العضوية أداة قوية وعالمية لنمذجة تطور الأعضاء في المختبر ودراسة البيولوجيا والمرض. عند استزراعها في وسط استزراع محدد بعامل النمو ، يمكن توسيع الخلايا الجذعية البالغة (ASC) من مجموعة متنوعة من الأعضاء في 3 أبعاد (3D) وتجميعها ذاتيا في مجموعات خلوية تشبه الأعضاء تتكون من أنواع متعددة من الخلايا ، تسمى المواد العضوية. أبلغ مختبر كليفرز عن اشتقاق أول عضوي مشتق من ASC ، عضوي معوي بشري ، في عام 2009 1,2. بعد ذلك ، تم إنشاء عضويات مشتقة من ASC لمجموعة متنوعة من الأعضاء والأنسجة البشرية ، بما في ذلك البروستاتا3،4 ، والكبد5،6 ، والمعدة7،8،9 ، والبنكرياس 10 ، والغدة الثديية 11 ، والرئة 12،13 . احتفظت هذه المواد العضوية المشتقة من ASC بالخصائص الخلوية والهيكلية والوظيفية الحرجة للعضو الأصلي وحافظت على الاستقرار الجيني والمظهري في ثقافة التوسع طويلة الأجل14,15.

يمكن أيضا اشتقاق المواد العضوية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSC) ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (ES) والخلية الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS)16. في حين أن المواد العضوية المشتقة من PSC تستغل آليات تطوير الأعضاء لإنشائها ، يمكن إجبار ASCs على تكوين عضويات عن طريق إعادة بناء الظروف التي تحاكي مكانة الخلايا الجذعية أثناء التجديد الذاتي للأنسجة الفسيولوجية أو إصلاح الأنسجة. تعد المواد العضوية المشتقة من PSC نماذج مواتية لاستكشاف التطور والتكوين العضوي ، وإن كانت غير قادرة على الوصول إلى مستوى النضج المماثل للعضويات المشتقة من ASC. حالة النضج الشبيهة بالجنين للعضويات المشتقة من PSC ، والتعقيد لإنشاء هذه المواد العضوية تمنع بشكل كبير تطبيقاتها الواسعة لدراسة البيولوجيا وعلم الأمراض في الأنسجة الناضجة.

تصطف القناة التنفسية البشرية ، من الأنف إلى القصيبات الطرفية ، مع ظهارة مجرى الهواء ، وتسمى أيضا الظهارة الهدبية الزائفة الطبقية ، والتي تتكون من أربعة أنواع رئيسية من الخلايا ، أي الخلايا الهدبية ، والخلية الكأسية ، والخلية القاعدية ، وخلية النادي. أنشأنا عضوي الرئة البشري المشتق من ASC من أنسجة الرئة البشرية بالتعاون مع مختبر Clevers12,13. يتم توسيع هذه المواد العضوية الرئوية على التوالي في وسط التوسع لأكثر من عام. تختلف المدة الدقيقة بين الخطوط العضوية المختلفة التي تم الحصول عليها من متبرعين مختلفين. ومع ذلك ، بالمقارنة مع ظهارة مجرى الهواء الأصلي ، فإن هذه المواد العضوية الرئوية القابلة للتوسيع على المدى الطويل ليست ناضجة بما فيه الكفاية لأن الخلايا الهدبية ، وهي مجموعة الخلايا الرئيسية في مجرى الهواء البشري ، ممثلة تمثيلا ناقصا في هذه المواد العضوية الرئوية. وهكذا ، قمنا بتطوير بروتوكول تمايز قريب وأنشأنا عضويات مجرى الهواء 3D و 2D التي تنسخ ظاهريا مورفولوجيا ووظيفيا ظهارة مجرى الهواء إلى مستوى شبه فسيولوجي.

هنا نقدم بروتوكول فيديو لاشتقاق عضويات الرئة البشرية من أنسجة الرئة الأولية ، وتوسيع عضويات الرئة وحث التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء 3D و 2D.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب باستخدام الأنسجة البشرية الموضحة هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لجامعة هونغ كونغ / هيئة المستشفيات في هونغ كونغ ويست كلاستر (UW13-364 و UW21-695). تم الحصول على الموافقة المستنيرة من المرضى قبل جمع الأنسجة.

1. اشتقاق العضوية الرئة البشرية

  1. إعداد المواد التجريبية
    1. تحضير الوسط القاعدي عن طريق استكمال وسط DMEM / F12 المتقدم مع 2 mM الجلوتامين ، 10 mM HEPES ، 100 U / mL من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين.
    2. تحضير وسط توسع عضوي للرئة البشرية عن طريق استكمال الوسط القاعدي بنسبة 10٪ R-spondin 1 وسط مشروط ، و 10٪ وسط مكيف Noggin ، وملحق B27 1x ، و 1.25 mM N-acetylcysteine ، و 10 mM nicotinamide ، و 5 μM من Y-27632 ، و 500 nM من A-83-01 ، و 1 μM من SB202190 ، و 5 نانوغرام / مل من عامل النمو الليفي (FGF) -7 ، و 20 نانوغرام / مل من FGF-10 ، و 100 ميكروغرام / مل من البريموسين (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يمكن استبدال الوسط المشروط R-spondin 1 و Noggin ب R-spondin 1 المؤتلف التجاري (500 نانوغرام / مل) و Noggin (100 نانوغرام / مل).
    3. قم بتسخين صفيحة استزراع معلقة من 24 بئرا في حاضنة زراعة الخلايا. استخدم حاضنة زراعة الخلايا القياسية مع 5٪ CO2 والغلاف الجوي الرطب عند 37 درجة مئوية. قم بإذابة مصفوفة الطابق السفلي في ثلاجة 4 درجات مئوية. حافظ على مصفوفة الطابق السفلي ووسط الاستزراع على الجليد أثناء التجريب.
  2. عزل الخلايا من أنسجة الرئة البشرية لثقافة العضوية 3D
    1. شراء أنسجة الرئة البشرية المستأصلة حديثا بحجم حوالي 0.5 سم من المرضى الذين يخضعون للاستئصال الجراحي بسبب أمراض مختلفة. نقل أنسجة الرئة في 30 مل من الوسط القاعدي في درجة حرارة الغرفة ومعالجتها في أسرع وقت ممكن داخل غطاء السلامة الأحيائية.
    2. افرم أنسجة الرئة إلى قطع صغيرة (0.5-1 مم) باستخدام مشرط معقم في طبق زراعة خلايا 10 سم. اغسل قطع الأنسجة ب 10 مل من الوسط القاعدي البارد في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، يليه الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات في 8 مل من الوسط القاعدي المكمل بالكولاجيناز بتركيز نهائي قدره 2 ملغم / مل. هضم قطع الأنسجة عن طريق هز الأنبوب عند 120 دورة في الدقيقة لمدة 30-40 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. قم بتحريك أعلى وأسفل لمدة 20 ضعفا لقص قطع الأنسجة المهضومة باستخدام ماصة مصلية 10 مل. قم بتكديس مصفاة 100 ميكرومتر على أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتصفية التعليق.
    5. استعادة قطع الأنسجة على المصفاة مع الوسط القاعدي ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل ، تليها جولة ثانية من القص والترشيح. يمكن إجراء تصفية قص إضافية 1x-2x لعزل المزيد من الخلايا ، خاصة عند شراء قطعة صغيرة من الأنسجة (على سبيل المثال ، <0.5 سم).
    6. أضف FBS إلى التدفق من خلال تركيز نهائي قدره 2٪ لإنهاء الهضم ، يليه الطرد المركزي عند 400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من الوسط القاعدي ، تليها الطرد المركزي عند 400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
    8. (اختياري) إذا شوهدت العديد من كريات الدم الحمراء في الكريات (تقدر بلون الكرية) ، فأعد تعليق بيليه الخلية في 2 مل من مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء وحضانتها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم أضف 10 مل من الوسط القاعدي إلى الأنبوب ، متبوعا بالطرد المركزي عند 400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
    9. أعد تعليق الكريات في مصفوفة الطابق السفلي البارد واحتفظ بها على الجليد. إضافة 80-160 ميكرولتر من مصفوفة الطابق السفلي للخلايا المستردة من أنسجة الرئة بحجم حوالي 0.5 سم ؛ المبلغ يكفي لزرع 2-4 قطرات.
    10. قم بتوزيع 40 ميكرولتر من التعليق على كل بئر من لوحة مستنبتة التعليق 24 بئرا التي تم تسخينها مسبقا. احتضان لوحة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. دع مصفوفة الطابق السفلي تتصلب لتشكيل قطرة.
    11. أضف 500 ميكرولتر من وسط تمدد عضويات الرئة البشرية مع 5 نانومتر من هيريجولين بيتا-1 إلى كل بئر واحتضن الصفيحة في حاضنة زراعة الخلايا.
    12. قم بتحديث الوسط كل 3 أيام. قم بإزالة الوسط القديم مع الحفاظ على القطرة سليمة وأضف الوسط الطازج بحذر. مرور المواد العضوية بعد الحضانة لمدة 10-14 يوما. استخدم Heregulin beta-1 فقط في الثقافة الأولية قبل المقطع الأول.
    13. راقب المواد العضوية تحت المجهر للتأكد من أن المواد العضوية ليست جزءا لا يتجزأ من كثافة الخلايا العالية جدا. إذا تفككت قطرة بسبب كثافة الخلايا العالية بشكل مفرط ، فقم باستعادة وإعادة تضمين المواد العضوية والخلايا ذات الحجم الأكبر من مصفوفة الطابق السفلي لصنع المزيد من القطرات ذات كثافة الخلايا الأقل والمرغوبة.

2. توسيع العضوية الرئوية البشرية

  1. قم بإعداد ماصة باستور عن طريق حرق طرف ماصة باستور على لهب ، مثل موقد بنسن ، لتضييق الفتحة من 1.5 مم إلى حوالي 1.0 مم في القطر. قم بتبريد الماصات ، تليها التعقيم للتعقيم. بلل الماصات بالوسط القاعدي لتجنب التعلق الخلوي وفقدانه أثناء القص الميكانيكي.
  2. مرور عضويات الرئة مع القص الميكانيكي
    1. استخدم طرف 1 مل وماصة لأعلى ولأسفل لكسر القطرات التي تم الحصول عليها أعلاه. ثم ، انقل المواد العضوية مع الوسط إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل واضبط الحجم إلى 10 مل مع وسط قاعدي بارد. تخلص من المادة الفائقة بعد الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية
    2. اغسل المواد العضوية ب 10 مل من الوسط القاعدي البارد مرة أخرى. إعادة تعليق المواد العضوية في 2 مل من الوسط القاعدي البارد. ضع لأعلى ولأسفل لقص المواد العضوية إلى قطع صغيرة باستخدام ماصة باستور.
    3. تكملة مع المتوسطة القاعدية إلى حجم إجمالي من 10 مل، تليها الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الشظايا العضوية باستخدام مصفوفة قبو باردة كافية لتمكين التوسع من 1:3 إلى 1:5. حافظ على الجليد.
    4. ضع 40 ميكرولتر من التعليق العضوي في كل بئر من صفيحة 24 بئرا تم تسخينها مسبقا. احتضان لوحة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. دع مصفوفة الطابق السفلي تتصلب.
    5. أضف 500 ميكرولتر من وسط تمدد الرئة العضوي إلى كل بئر واحتضنه في حاضنة زراعة الخلايا. قم بتحديث الوسط كل 3 أيام. مرور المواد العضوية كل أسبوعين بنسبة 1: 3 إلى 1: 5.
  3. مرور عضويات الرئة مع التربسين
    ملاحظة: يفضل التربسين عندما يكون من الصعب قص عضوي الرئة إلى قطع صغيرة باستخدام ماصة باستور ، أو يكون حجم المواد العضوية متغيرا للغاية ، أو تتطلب التجارب اللاحقة عضويات ذات حجم أكثر اتساقا.
    1. حصاد المواد العضوية الرئوية كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. أعد تعليق العضو العضوي في 1 مل من إنزيم التفكك واحتضنه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
    2. أضف 1 مل من الوسط القاعدي إلى الأنبوب. قص المواد العضوية ميكانيكيا عن طريق سحب المواد العضوية لأعلى ولأسفل إلى قطع صغيرة باستخدام ماصة باستور. تحقق من حجم القطع العضوية تحت المجهر عند تكبير 4x. ثم أضف 40 ميكرولتر من FBS لإنهاء عملية الهضم.
      ملاحظة: تحديد حجم الشظايا العضوية تحت المجهر وفقا للترتيب التجريبي. إذا كانت التجربة تحتاج إلى المزيد من المواد العضوية أو المواد العضوية ذات الحجم الأكثر اتساقا ، فقم بقص المواد العضوية إلى قطع أصغر أو حتى خلايا مفردة. بعد ذلك ، يستغرق الأمر وقتا أطول ، ربما 3 أسابيع ، قبل أن تكون المواد العضوية جاهزة للتجريب.
    3. قم بتعبئة الرصيد بوسط قاعدي إلى حجم نهائي يبلغ 10 مل ، يليه الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق القطع العضوية في مصفوفة الطابق السفلي البارد بحجم كاف للمرور بنسبة 1:5-1:10. حافظ على الجليد.
    4. ضع 40 ميكرولتر من التعليق العضوي في كل بئر من صفيحة 24 بئرا تم تسخينها مسبقا. احتضان لوحة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. دع مصفوفة الطابق السفلي تتصلب.
    5. تكملة مع 500 ميكرولتر من وسط توسع الرئة العضوي لكل بئر وحضانة في حاضنة زراعة الخلايا. قم بتحديث وسيط التمدد كل 3 أيام. مرور المواد العضوية بعد 2-3 أسابيع.
      ملاحظة: يتم تركيب حوالي 100 مادة عضوية داخل قطرة 40 ميكرولتر من مصفوفة الطابق السفلي. عادة ما تنمو عضويات الرئة بشكل أفضل مع كثافة خلايا عالية نسبيا. أعد تضمين المواد العضوية بكثافة خلايا أقل إذا تفككت القطرات أو التقت المواد العضوية المتنامية معا بسبب كثافة الخلايا العالية للغاية.

3. التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء الناضجة

  1. قم بإعداد وسط التمايز القريب (وسط PD) عن طريق استكمال الوسط القاعدي للواجهة السائلة الهوائية بملحق واجهة سائلة هوائية 1x ، وملحق صيانة واجهة سائل الهواء 1x ، و 4 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، و 1 ميكرومتر من الهيدروكورتيزون ، و 10 ميكرومتر من Y-27632 ، و 10 ميكرومتر من DAPT (انظر جدول المواد).
  2. 3D مجرى الهواء العضوية
    1. احتضان عضويات الرئة في وسط التمدد لمدة 7-10 أيام بعد المرور عن طريق القص الميكانيكي. استبدل وسيط التوسيع بوسيط PD. احتضان المواد العضوية في وسط PD لمدة 14 يوما في حاضنة زراعة الخلايا.
    2. تخلص من وسيط PD في كل بئر. أضف المخزن المؤقت للخلايا لحصاد المجرى الهوائي العضوي المتمايز لاستخراج الحمض النووي الريبي والكشف عن التعبير الجيني الخلوي عن طريق فحص RT-qPCR.
    3. بدلا من ذلك ، احتضن المواد العضوية عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة بعد إضافة 10 mM EDTA لفصل المواد العضوية إلى خلايا مفردة ، تليها تحليل التدفق الخلوي لفحص مجموعات الخلايا. المواد العضوية جاهزة للتلاعبات التجريبية المختلفة.
  3. 2D مجرى الهواء العضوي
    1. إعداد ما يكفي من المواد العضوية الرئوية 3D لثقافة التمايز 2D. مطلوب ما مجموعه 1.3 × 10 5 و 4.5 × 105 خلايا لإدراج دعم قابل للنفاذ 24 بئرا وإدراج دعم قابل للنفاذ 12 بئرا ، على التوالي.
    2. بعد أن تنمو عضويات الرئة ثلاثية الأبعاد في وسط التمدد لمدة أسبوعين ، هضم المواد العضوية إلى خلايا مفردة والبذور في إدراج 24 بئرا و 12 بئرا لتوليد عضويات مجرى الهواء ثنائية الأبعاد.
    3. قبل احتضان الإدخالات مع الوسط القاعدي بين عشية وضحاها في حاضنة زراعة الخلايا. أضف 250 ميكرولتر و 500 ميكرولتر من الوسط القاعدي في الغرفة العلوية والسفلية للوحة ذات 24 بئرا ، على التوالي. للحصول على لوحة من 12 بئرا ، أضف 500 ميكرولتر و 1000 ميكرولتر من الوسط القاعدي في الغرفة العلوية والسفلية ، على التوالي.
    4. حصاد العضوية الرئوية ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. أعد تعليق المواد العضوية مع 1 مل من إنزيم التفكك واحتضنها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
    5. أضف 1 مل من الوسط القاعدي إلى الأنبوب. قم بتحريك الخلايا العضوية لأعلى ولأسفل لقص المواد العضوية إلى خلايا مفردة باستخدام ماصة باستور والتحقق من الخلايا تحت المجهر. ثم أضف 40 ميكرولتر من FBS لإنهاء عملية الهضم.
    6. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. انقل تعليق الخلية المصفى إلى أنبوب 15 مل. قم بتعبئة المزيج بوسط قاعدي إلى حجم إجمالي يبلغ 10 مل ، يليه الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. أعد تعليق الكريات ، التي تم جمعها من 24 قطرة (40 ميكرولتر) ، في 1-2.5 مل من وسط تمدد الرئة العضوي اعتمادا على كثافة الخلايا في القطرات. عد عدد الخلايا التي تحتوي على عداد خلايا تحت المجهر. اضبط تركيز الخلية على 1.3 × 106/مل (لإدراج 24 بئرا) أو 9 × 105/مل (لإدراج 12 بئرا).
    8. قم بإزالة الوسط القاعدي من الغرف العلوية والسفلية. أضف 500 ميكرولتر و 1000 ميكرولتر من وسط التمدد في الغرفة السفلية لإدراج 24 بئرا وإدراج 12 بئرا ، على التوالي. البذور 100 ميكرولتر و 500 ميكرولتر من تعليق الخلية المحضرة في الخطوة 3.3.7 على الغرفة القمية لإدراج 24 بئرا و 12 بئرا ، على التوالي.
    9. احتضان في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 2 أيام. استبدل وسط التمدد بوسط PD في كل من الغرفة القمية والسفلية للألواح. احتضان المواد العضوية في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 14 يوما وتحديث وسط PD كل 3 أيام.
      ملاحظة: يمكن تمييز الأهداب المتنقلة في المواد العضوية 3D و 2D تحت المجهر من اليوم 7 بعد الحضانة في وسط PD. بعد 14 يوما من ثقافة التمايز في وسط PD ، تنضج عضويات مجرى الهواء لمختلف التلاعبات التجريبية.
    10. قم بقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER) كل يومين باستخدام نظام قياس المقاومة الكهربائية وفقا لبروتوكول قياسي موضح في17.

النتائج

يتيح هذا البروتوكول اشتقاق عضويات الرئة البشرية بمعدل نجاح مرتفع. يتم فرم أنسجة الرئة البشرية الطازجة إلى قطع صغيرة ، ثم تتحلل مع الكولاجيناز. يتم تضمين الخلايا المفردة الناتجة في مصفوفة الطابق السفلي ويتم تحضينها في وسط التوسع العضوي الرئوي مع استكمال مزيج من العوامل المتخصصة لنمو الخل?...

Discussion

تصطف الشعب الهوائية البشرية مع ظهارة مجرى الهواء ، والمعروفة أيضا باسم الظهارة الهدبية الزائفة. أنواع الخلايا الرئيسية في ظهارة مجرى الهواء العلوي هي الخلايا الهدبية التي تمكن الحركة المنسقة لأهداب قمية لطرد المخاط والجسيمات المستنشقة من الشعب الهوائية ، والخلايا الكأسية التي تنتج وتف?...

Disclosures

تم إدراج J. Z. ، C.L. ، و M.C.C. كمخترعين في براءة اختراع المواد العضوية في مجرى الهواء (المنشور رقم: US-2021-0207081-A1). ولا يعلن المؤلفون الآخرون عن أي مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نشكر مركز PanorOmic Sciences ووحدة المجهر الإلكتروني ، كلية لي كا شينغ للطب ، جامعة هونغ كونغ ، للمساعدة في التصوير البؤري وقياس التدفق الخلوي. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من صندوق البحوث الصحية والطبية (HMRF و 17161272 و 19180392) التابع لمكتب الأغذية والصحة. الصندوق العام للبحوث (GRF، 17105420) التابع لمجلس المنح البحثية؛ Health@InnoHK، لجنة الابتكار والتكنولوجيا، حكومة منطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents for lung organoid culture
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634010-
A8301Tocris2939500nM
B27 supplementInvitrogen17504-0441x
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)Trevigen3533-010-070-80%
FGF-10Peprotech100-2620 ng/mL
FGF-7Peprotech100-195 ng/mL
GlutaMAX (glutamine)Invitrogen350500611x
HEPES 1MInvitrogen15630-05610 mM
Heregulin β-1Peprotech100-035 nM
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA91651.25 mM
NicotinamideSigma-AldrichN063610 mM
Noggin (conditional medium)home made-10x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Invitrogen15140-1221x
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
Rspondin1 (conditional medium)home made-10x
SB202190Sigma-AldrichS70671 µM
Y-27632Tocris12545 µM
Proximal differentiation medium
DAPTTocris263410 µM
Heparin SolutionStemCell Technology79804 µg/mL
Hydrocortisone Stock SolutionStemCell Technology79251 µM
PneumaCult-ALI 10X Supplementair liquid interface supplement
PneumaCult-ALI Basal MediumStemCell Technology05001air liquid interface basal medium
PneumaCult-ALI Maintenance Supplementair liquid interface maintenance supplement
Y-27632Tocris125410 µM
Equipment
Biological safety cabinetBaker1-800-992-2537
Carl Zeiss LSM 780 or 800Zeissconfocal microscope
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific42093483
Stereo-microscopeOlympus CorporationCKX31SF
CentrifugeEppendorf5418BG040397
Serological pipettorEppendorf
MicropipetteEppendorf
ZEN black or ZEN blue softwareZeissanalysis software
Consumables
12mm Trans-wellStemCell Technology#38023
12-well cell culture plateCellstar665970
15- and 50 ml conical tubesThermo Fisher ScientificL6BF5Z8118
24-well cell culture plateCellstar662160
6.5mm Trans-wellStemCell Technology#38024
Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µmSigma-AldrichSLGPR33RB
Microfuge tubesEppendorf
Micropipette tipsThermo Fisher ScientificTFLR140-200-Q21190531
Pasteur pipette glassThermo Fisher Scientific22-378893
Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)Thermo Fisher ScientificBA08003, 08004, 08005
Antibodies
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594InvitrogenA11005
Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488InvitrogenA11001
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594InvitrogenA11037
Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594InvitrogenA11007
Mouse Anti-Cytokeratin 5Abcamab128190
Mouse Anti-FOX J1Invitrogen14-9965-82
Mouse Anti-Mucin 5ACAbcamab3649
Mouse Anti-β-tubulin 4SigmaT7941
Rabbit Anti-p63Abcamab124762
Rat Anti-Uteroglobin/CC-10R&D SystemsMAB4218-SP
Other reagent
TrypLE Select Enzyme (10X)Thermo Fisher ScientificA1217701dissociation enzyme

References

  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  4. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
  5. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  6. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  7. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  8. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  9. Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
  10. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
  11. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  12. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
  13. Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  16. Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
  17. . Millicell ERS-2 User Guide Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 (2021)
  18. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
  19. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
  20. Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
  21. Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
  22. Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
  23. Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
  24. Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
  25. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
  26. Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
  27. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  28. Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
  29. Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
  30. Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
  31. Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
  32. Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
  33. Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
  34. Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved