建立人肺类器官和近端分化以产生成熟的气道类器官

摘要

该协议提出了一种从原代肺组织衍生人肺类器官的方法，扩大肺类器官并诱导近端分化以产生3D和2D气道类器官，从而忠实地对人气道上皮进行表型检查。

摘要

缺乏强大的人体呼吸 道上皮体外 模型阻碍了对呼吸系统生物学和病理学的理解。我们描述了一种明确的方案，从肺组织中的成体干细胞中提取人肺类器官，并诱导近端分化以产生成熟的气道类器官。然后以高稳定性连续扩张肺类器官超过1年，而分化的气道类器官用于在形态学和功能上模拟人气道上皮至接近生理水平。因此，我们建立了人类气道上皮的鲁棒类器官模型。肺类器官和分化气道类器官的长期扩张产生了稳定和可再生的来源，使科学家能够在培养皿中重建和扩增人气道上皮细胞。人肺类器官系统为各种应用提供了独特且具有生理活性 的体外 模型，包括研究病毒 - 宿主相互作用，药物测试和疾病建模。

引言

类器官已成为器官发育 体外 建模和研究生物学和疾病的强大而通用的工具。当在生长因子定义的培养基中培养时，来自各种器官的成体干细胞（ASC）可以在3维（3D）中扩增并自组装成由多种细胞类型组成的器官样细胞簇，称为类器官。Clevers的实验室在2009年报告了第一个ASC衍生的类器官，人类肠道类器官^{的衍生1，2}。之后，ASC衍生的类器官已被确定用于各种人体器官和组织，包括前列腺^3，4，肝脏^5，6，胃^7，8，9，胰腺¹⁰，乳腺¹¹和肺 ^12，13.这些ASC衍生的类器官保留了天然器官的关键细胞，结构和功能特性，并在长期扩增培养物中保持了遗传和表型稳定性^14，15。

类器官也可以来源于多能干细胞（PSC），包括胚胎干（ES）细胞和诱导多能干细胞（iPS）细胞¹⁶。虽然PSC衍生的类器官利用器官发育的机制来建立它们，但ASC可以通过重建在生理组织自我更新或组织修复期间模仿干细胞位的条件来强制形成类器官。PSC衍生的类器官是探索发育和器官发生的有利模型，尽管无法达到ASC衍生类器官的可比成熟水平。PSC衍生类器官的胎儿样成熟状态，以及建立这些类器官的复杂性，大大阻碍了它们在研究成熟组织中的生物学和病理学的广泛应用。

从鼻子到末端细支气管的人体呼吸道内衬气道上皮，也称为假分层纤毛上皮，由四种主要细胞类型组成，即纤毛细胞，杯状细胞，基底细胞和俱乐部细胞。我们与Clevers的实验室^12，13合作，从人类肺组织中建立了ASC衍生的人类肺类器官。这些肺类器官在扩张介质中连续扩张超过一年;确切的持续时间因从不同供体获得的不同类器官系而异。然而，与天然气道上皮相比，这些长期可扩张的肺类器官还不够成熟，因为纤毛细胞（人体气道中的主要细胞群）在这些肺类器官中代表性不足。因此，我们开发了一种近端分化方案，并产生了3D和2D气道类器官，其形态学和功能上将气道上皮进行表观镜检查至接近生理水平。

在这里，我们提供一种视频方案，从原代肺组织中衍生出人肺类器官，扩大肺类器官并诱导近端分化以产生3D和2D气道类器官。

研究方案

本文所述的所有使用人体组织的实验均已获得香港大学/医院管理局香港西区（UW13-364和UW21-695）机构审查委员会的批准。在组织收集之前获得患者的知情同意。

1. 人肺类器官的衍生

1. 实验材料的制备
   1. 通过用2mM谷氨酰胺，10mM HEPES，100 U / mL青霉素和100μg / mL链霉素补充高级DMEM / F12培养基来制备基础培养基。
   2. 通过用10%R-spondin 1条件培养基，10%诺金条件培养基，1x B27补充剂，1.25mM N-乙酰半胱氨酸，10mM烟酰胺，5μM Y-27632，500nM A-83-01，1μM SB202190，5ng / mL纤维球生长因子（FGF）-7，20ng / mL FGF-10和100μg/ mL丙莫星（见 材料表）来制备人肺类器官扩张培养基。
      注意:R-spondin 1和Noggin条件培养基可以用商业重组R-spondin 1（500 ng / mL）和Noggin（100 ng / mL）代替。
   3. 在细胞培养箱中预热24孔悬浮培养板。使用具有5%CO₂ 的标准细胞培养箱和37°C的加湿气氛。 在4°C冰箱中解冻基底基质。在实验过程中将基底基质和培养基保持在冰上。
2. 从人体肺组织中分离细胞以进行3D类器官培养
   1. 从因各种疾病而接受手术切除的患者身上获取大小约为0.5厘米的新鲜切除的人体肺组织。在室温下将肺组织运输在30 mL基础培养基中，并在生物安全罩内尽快处理。
   2. 在10厘米的细胞培养皿中用无菌手术刀将肺组织切碎成小块（0.5-1毫米）。在15mL离心管中用10mL冷基础培养基洗涤组织片，然后在4°C下以400× g 离心5分钟。
   3. 弃去上清液并将沉淀重悬于8mL基础培养基中，补充有胶原酶，终浓度为2mg / mL。通过在37°C下以120rpm摇动管30-40分钟来消化组织片。
   4. 上下移液20倍，使用10 mL血清学移液器剪切消化的组织块。将100μm过滤器堆放在50 mL离心管上并过滤悬浮液。
   5. 用基础培养基回收过滤器上的组织碎片，并将其转移到15 mL离心管中，然后进行第二轮剪切和过滤。可以进行1x-2x的额外剪切过滤以分离更多细胞，特别是当采购一小块组织（例如，<0.5 cm）时。
   6. 将FBS加入到终浓度为2%的流通中以终止消解，然后在4°C下以400× g 离心5分钟。
   7. 将细胞沉淀重悬于10mL基础培养基中，然后在4°C下以400× g 离心5分钟。 弃去上清液。
   8. （可选）如果在沉淀中观察到许多红细胞（通过沉淀的颜色估计），则将细胞沉淀重悬于2mL红细胞裂解缓冲液中，并在室温下孵育5分钟。然后，向管中加入10mL基础培养基，然后在4°C下以400× g 离心5分钟。 弃去上清液。
   9. 将颗粒重悬于冷的基底基质中并保持在冰上。加入80-160μL基底基质，用于从0.5cm左右大小的肺组织中回收的细胞;该量足以播种2-4滴。
   10. 将40μL悬浮液分配到预热的24孔悬浮培养板的每个孔中。将培养板在37°C下孵育10-15分钟。让基底基质凝固形成液滴。
   11. 向每个孔中加入500μL人肺类器官扩增培养基，补充有5nM赫氏β-1，并将板在细胞培养箱中孵育。
   12. 每 3 天刷新一次培养基。取出旧培养基，同时保持液滴完好无损，并小心加入新鲜培养基。孵育10-14天后通过类器官。仅在第一次传代之前的初始培养中使用赫来古林β-1。
   13. 在显微镜下观察类器官，以确保类器官不会嵌入非常高的细胞密度。如果液滴由于细胞密度过高而崩解，则回收并重新嵌入具有较高基底基质体积的类器官和细胞，以产生更多具有较低和理想细胞密度的液滴。

2. 人肺类器官的扩张

1. 通过将巴斯德移液器的尖端燃烧到火焰（如本生燃烧器）上来准备巴斯德移液器，以将开口从1.5毫米缩小到直径约1.0毫米。冷却移液器，然后进行高压灭菌以灭菌。用基础培养基润湿移液器，以避免在机械剪切过程中细胞附着和损失。
2. 通过机械剪切进行肺类器官通道
   1. 使用1 mL吸头和上下移液器来打破上面获得的液滴。然后，将类器官与培养基一起转移到15 mL离心管中，并用冷的基础介质将体积调节至10 mL。在4°C下以300× g 离心5分钟后弃去上清液
   2. 再次用10mL冷基础培养基洗涤类器官。将类器官重悬于2 mL冷基础培养基中。上下移液，用巴斯德移液器将类器官剪切成小块。
   3. 用基础培养基补充至总体积为10mL，然后在4°C下以300× g 离心5分钟。 用足够多的冷基底基质重悬类器官碎片，以实现1:3至1:5的扩张。保持冰封。
   4. 将40μL类器官悬浮液置于预热的24孔板的每个孔中。将培养板在37°C下孵育10-15分钟。让基底基质固化。
   5. 向每个孔中加入500μL肺类器官扩增培养基，并在细胞培养箱中孵育。每 3 天刷新一次培养基。每2周通过一次类器官，比例为1:3至1:5。
3. 肺类器官通过胰蛋白酶消化
   注意:当难以使用巴斯德移液管将肺类器官剪切成小块时，或者类器官的大小变化很大，或者随后的实验需要更均匀大小的类器官时，胰蛋白酶消化是优选的。
   1. 收获肺类器官，如步骤2.2.1所示。将类器官重悬于1mL解离酶中，并在37°C水浴中孵育3-5分钟。
   2. 向试管中加入1 mL基础培养基。通过使用巴斯德移液器将类器官上下移液成小块，机械地剪切类器官。在4倍放大倍率的显微镜下检查类器官碎片的大小。然后，加入40μLFBS以终止消化。
      注意:根据实验安排在显微镜下确定类器官碎片的大小。如果实验需要更多的类器官或更均匀大小的类器官，请将类器官剪切成更小的碎片甚至单个细胞。然后，在类器官准备好进行实验之前，需要更长的时间，可能是3周。
   3. 用基础培养基加注至最终体积为10mL，然后在4°C下以300× g 离心5分钟。 将类器官碎片重悬于冷基底基质中，其体积足以通过，比例为1:5-1:10。保持冰封。
   4. 将40μL类器官悬浮液置于预热的24孔板的每个孔中。将培养板在37°C下孵育10-15分钟。让基底基质固化。
   5. 每孔补充500μL肺类器官扩增培养基，并在细胞培养箱中孵育。每 3 天刷新一次扩展介质。2-3周后通过类器官。
      注意:大约100个类器官安装在基底基质的40μL液滴中。肺类器官通常生长得更好，细胞密度相对较高。如果液滴分解或由于细胞密度过高而使生长中的类器官附着在一起，则以较低的细胞密度重新包埋类器官。

3. 近端分化产生成熟的气道类器官

1. 制备近端分化培养基（PD培养基），方法是用1x空气液体界面补充剂，1x空气液体界面维持补充剂，4μg/ mL肝素，1μM氢化可的松，10μM Y-27632和10μM DAPT补充空气液体界面基础介质（见 材料表）。
2. 3D 气道类器官
   1. 通过机械剪切传代后，在膨胀培养基中孵育肺类器官7-10天。将膨胀介质更换为PD介质。将类器官在PD培养基中孵育14天，在细胞培养箱中孵育14天。
   2. 丢弃每个孔中的PD培养基。加入细胞裂解物缓冲液以收获分化的气道类器官，用于RNA提取和通过RT-qPCR测定检测细胞基因表达。
   3. 或者，在加入10mM EDTA后，将类器官在37°C下孵育60分钟以将类器官分离成单细胞，然后进行流式细胞术分析以检查细胞群。类器官已准备好进行各种实验操作。
3. 2D 气道类器官
   1. 准备足够的3D肺类器官用于2D分化培养。24 孔渗透性支撑插入^物和 12 孔渗透性支撑插入物总共需要 1.3 x 10^{5 和 4.5} x 10 5 个细胞。
   2. 在3D肺类器官在扩增培养基中生长2周后，将类器官消化成单细胞并接种到24孔和12孔插入物中以产生2D气道类器官。
   3. 将插入物与基础培养基在细胞培养箱中预孵育过夜。分别在24孔板的顶部和底部室中加入250μL和500μL基础培养基。对于12孔板，分别在顶部和底部室中加入500μL和1，000μL基础培养基。
   4. 收获3D肺类器官，如步骤2.2.1所述。用1mL解离酶重悬类器官，并在37°C水浴中孵育3-5分钟。
   5. 向试管中加入1 mL基础培养基。上下移液，用巴斯德移液管将类器官剪切成单个细胞，并在显微镜下检查细胞。然后，加入40μLFBS以终止消化。
   6. 将细胞通过40μm过滤器过滤到50mL离心管中。将过滤后的细胞悬浮液转移到15 mL管中。用基础培养基加注至总体积为10mL，然后在4°C下以300× g 离心5分钟。
   7. 根据液滴中的细胞密度，将从24个液滴（40μL）收集的沉淀重悬于1-2.5mL肺类器官扩增培养基中。在显微镜下用细胞计数器计算细胞数量。将细胞浓度调节至 1.3 x 10⁶/mL（对于 24 孔插入片段）或 9 x 10⁵/mL（对于 12 孔插入片段）。
   8. 从顶部和底部腔室中取出基底培养基。分别在24孔插入物和12孔插入物的底部室中加入500μL和1，000μL膨胀培养基。在步骤3.3.7中制备的100μL和500μL细胞悬浮液分别将100μL和500μL种子到24孔插入物和12孔插入物的顶端室中。
   9. 在细胞培养箱中孵育2天。用板的顶腔和底室中的PD介质替换膨胀介质。将类器官在细胞培养箱中孵育14天，每3天刷新一次PD培养基。
      注意:在PD培养基中孵育后的第7天起，在显微镜下的3D和2D类器官中可识别移动纤毛。在PD培养基中分化培养14天后，气道类器官成熟，可用于各种实验操作。
   10. 每隔一天使用电阻测量系统测量经上皮电阻（TEER），该系统符合¹⁷中描述的标准协议。

结果

该方案能够以高成功率衍生出人肺类器官。将新鲜的人体肺组织切成小块，然后用胶原酶分解。将所得的单细胞嵌入基底基质中，并在肺类器官扩增培养基中孵育，并补充一系列用于上皮干细胞生长的利基因子（步骤1.1.2）。 图1 显示了嵌入在2型（BME; 图 1A（左）。囊性类器官出现并随着时间的推移而扩大（图1A，右）。同时，不...

讨论

人气道内衬气道上皮，也称为假分层纤毛上皮。上气道上皮的主要细胞类型是纤毛细胞，其能够协调其顶端纤毛运动以从气道中排出粘液和吸入颗粒，产生和分泌粘液的杯状细胞以及排列在基底膜上并参与再生的基础细胞。在小气道（如细支气管）中，长方体气道上皮包含分泌性俱乐部细胞和比上气道区域更少的纤毛细胞。我们描述了一种从人类肺组织中的上皮干细胞中提取人体肺类器官的强大?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents for lung organoid culture
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634010	-
A8301	Tocris	2939	500nM
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1x
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)	Trevigen	3533-010-0	70-80%
FGF-10	Peprotech	100-26	20 ng/mL
FGF-7	Peprotech	100-19	5 ng/mL
GlutaMAX (glutamine)	Invitrogen	35050061	1x
HEPES 1M	Invitrogen	15630-056	10 mM
Heregulin β-1	Peprotech	100-03	5 nM
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165	1.25 mM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
Noggin (conditional medium)	home made	-	10x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Invitrogen	15140-122	1x
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	100 µg/mL
Rspondin1 (conditional medium)	home made	-	10x
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	1 µM
Y-27632	Tocris	1254	5 µM
Proximal differentiation medium
DAPT	Tocris	2634	10 µM
Heparin Solution	StemCell Technology	7980	4 µg/mL
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technology	7925	1 µM
PneumaCult-ALI 10X Supplement			air liquid interface supplement
PneumaCult-ALI Basal Medium	StemCell Technology	05001	air liquid interface basal medium
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement			air liquid interface maintenance supplement
Y-27632	Tocris	1254	10 µM
Equipment
Biological safety cabinet	Baker	1-800-992-2537
Carl Zeiss LSM 780 or 800	Zeiss		confocal microscope
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	42093483
Stereo-microscope	Olympus Corporation	CKX31SF
Centrifuge	Eppendorf	5418BG040397
Serological pipettor	Eppendorf
Micropipette	Eppendorf
ZEN black or ZEN blue software	Zeiss		analysis software
Consumables
12mm Trans-well	StemCell Technology	#38023
12-well cell culture plate	Cellstar	665970
15- and 50 ml conical tubes	Thermo Fisher Scientific	L6BF5Z8118
24-well cell culture plate	Cellstar	662160
6.5mm Trans-well	StemCell Technology	#38024
Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm	Sigma-Aldrich	SLGPR33RB
Microfuge tubes	Eppendorf
Micropipette tips	Thermo Fisher Scientific	TFLR140-200-Q21190531
Pasteur pipette glass	Thermo Fisher Scientific	22-378893
Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)	Thermo Fisher Scientific	BA08003, 08004, 08005
Antibodies
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11005
Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11037
Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11007
Mouse Anti-Cytokeratin 5	Abcam	ab128190
Mouse Anti-FOX J1	Invitrogen	14-9965-82
Mouse Anti-Mucin 5AC	Abcam	ab3649
Mouse Anti-β-tubulin 4	Sigma	T7941
Rabbit Anti-p63	Abcam	ab124762
Rat Anti-Uteroglobin/CC-10	R&D Systems	MAB4218-SP
Other reagent
TrypLE Select Enzyme (10X)	Thermo Fisher Scientific	A1217701	dissociation enzyme