Stabilire organoidi polmonari umani e differenziazione prossimale per generare organoidi maturi delle vie aeree

Riepilogo

Il protocollo presenta un metodo per derivare organoidi polmonari umani da tessuti polmonari primari, espandere gli organoidi polmonari e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi delle vie aeree 3D e 2D che fenocopio fedelmente l'epitelio delle vie aeree umane.

Abstract

La mancanza di un robusto modello in vitro dell'epitelio respiratorio umano ostacola la comprensione della biologia e della patologia dell'apparato respiratorio. Descriviamo un protocollo definito per derivare organoidi polmonari umani da cellule staminali adulte nel tessuto polmonare e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi maturi delle vie aeree. Gli organoidi polmonari vengono poi espansi consecutivamente per oltre 1 anno con elevata stabilità, mentre gli organoidi differenziati delle vie aeree vengono utilizzati per simulare morfologicamente e funzionalmente l'epitelio delle vie aeree umane a un livello quasi fisiologico. Pertanto, stabiliamo un robusto modello organoide dell'epitelio delle vie aeree umane. L'espansione a lungo termine degli organoidi polmonari e degli organoidi differenziati delle vie aeree genera una fonte stabile e rinnovabile, consentendo agli scienziati di ricostruire ed espandere le cellule epiteliali delle vie aeree umane nei piatti di coltura. Il sistema organoide polmonare umano fornisce un modello in vitro unico e fisiologicamente attivo per varie applicazioni, tra cui lo studio dell'interazione virus-ospite, test antidroga e modellazione della malattia.

Introduzione

Gli organoidi sono diventati uno strumento robusto e universale per la modellazione in vitro dello sviluppo degli organi e lo studio della biologia e delle malattie. Quando coltivate in un terreno di coltura definito dal fattore di crescita, le cellule staminali adulte (ASC) da una varietà di organi possono essere espanse in 3 dimensioni (3D) e auto-assemblate in cluster cellulari simili a organi composti da più tipi di cellule, denominati organoidi. Il laboratorio di Clevers ha riportato la derivazione del primo organoide derivato dall'ASC, organoide intestinale umano, nel 2009 ^1,2. Successivamente, gli organoidi derivati dall'ASC sono stati stabiliti per una varietà di organi e tessuti umani, tra cui prostata ^3,4, fegato ^5,6, stomaco ^7,8,9, pancreas¹⁰, ghiandola mammaria¹¹ e polmone ^12,13 . Questi organoidi derivati dall'ASC hanno mantenuto le proprietà cellulari, strutturali e funzionali critiche dell'organo nativo e hanno mantenuto la stabilità genetica e fenotipica nella coltura di espansione a lungo termine^14,15.

Gli organoidi possono anche essere derivati da cellule staminali pluripotenti (PSC), comprese le cellule staminali embrionali (ES) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS)¹⁶. Mentre gli organoidi derivati dal PSC sfruttano i meccanismi di sviluppo degli organi per la loro istituzione, gli ASC possono essere costretti a formare organoidi ricostruendo condizioni che imitano la nicchia delle cellule staminali durante l'auto-rinnovamento fisiologico dei tessuti o la riparazione dei tessuti. Gli organoidi derivati da PSC sono modelli favorevoli per esplorare lo sviluppo e l'organogenesi, sebbene incapaci di raggiungere il livello di maturazione comparabile degli organoidi derivati da ASC. Lo stato di maturazione simile a quello fetale degli organoidi derivati dal PSC e la complessità per stabilire questi organoidi impediscono sostanzialmente le loro ampie applicazioni per lo studio della biologia e della patologia nei tessuti maturi.

Il tratto respiratorio umano, dal naso al bronchiolo terminale, è rivestito con l'epitelio delle vie aeree, chiamato anche epitelio ciliato pseudostratificato, che consiste di quattro tipi di cellule principali, cioè cellule ciliate, cellule calici, cellule basali e cellule club. Abbiamo stabilito l'organoide polmonare umano derivato dall'ASC da tessuti polmonari umani in collaborazione con il laboratorio ^12,13 di Clevers. Questi organoidi polmonari vengono espansi consecutivamente nel mezzo di espansione per oltre un anno; la durata precisa varia tra diverse linee organoidi ottenute da diversi donatori. Tuttavia, rispetto all'epitelio nativo delle vie aeree, questi organoidi polmonari espandibili a lungo termine non sono abbastanza maturi poiché le cellule ciliate, la principale popolazione cellulare nelle vie aeree umane, sono sottorappresentate in questi organoidi polmonari. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo di differenziazione prossimale e generato organoidi delle vie aeree 3D e 2D che morfologicamente e funzionalmente fenocopio l'epitelio delle vie aeree a un livello quasi fisiologico.

Qui forniamo un protocollo video per derivare organoidi polmonari umani dai tessuti polmonari primari, espandere gli organoidi polmonari e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi delle vie aeree 3D e 2D.

Protocollo

Tutti i esperimenti che utilizzano tessuti umani qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Review Board dell'Università di Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 e UW21-695). Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti prima della raccolta dei tessuti.

1. Derivazione dell'organoide polmonare umano

1. Preparazione di materiali sperimentali
   1. Preparare il mezzo basale integrando il mezzo DMEM / F12 avanzato con 2 mM di glutammina, 10 mM HEPES, 100 U / mL di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina.
   2. Preparare il mezzo di espansione organoide polmonare umano integrando il mezzo basale con il 10% di R-spondin 1 mezzo condizionato, il 10% di mezzo condizionato noggin, 1x integratore B27, 1,25 mM di N-acetilcisteina, 10 mM di nicotinamide, 5 μM di Y-27632, 500 nM di A-83-01, 1 μM di SB202190, 5 ng/ mL di fattore di crescita fibroblst (FGF)-7, 20 ng / mL di FGF-10 e 100 μg / mL di primocina (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: il mezzo condizionato R-spondin 1 e Noggin può essere sostituito con R-spondin 1 (500 ng/mL) e Noggin (100 ng/mL) commerciali.
   3. Prewarm una piastra di coltura in sospensione a 24 pozzetti in un incubatore di colture cellulari. Utilizzare un incubatore di colture cellulari standard con il 5% di CO₂ e atmosfera umidificata a 37 °C. Scongelare la matrice del seminterrato in un frigorifero a 4 °C. Mantenere la matrice del seminterrato e il terreno di coltura sul ghiaccio durante la sperimentazione.
2. Isolamento cellulare da tessuti polmonari umani per la coltura di organoidi 3D
   1. Procurarsi tessuti polmonari umani appena resecati di circa 0,5 cm da pazienti sottoposti a resezione chirurgica a causa di varie malattie. Trasportare i tessuti polmonari in 30 ml di terreno basale a temperatura ambiente ed elaborare il più rapidamente possibile all'interno di una cappa di biosicurezza.
   2. Tritare i tessuti polmonari in piccoli pezzi (0,5-1 mm) con un bisturi sterile in un piatto di coltura cellulare di 10 cm. Lavare i pezzi di tessuto con 10 mL di mezzo basale freddo in un tubo di centrifuga da 15 mL, seguito da centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
   3. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet in 8 mL di mezzo basale integrato con collagenasi ad una concentrazione finale di 2 mg/mL. Digerire i pezzi di tessuto agitando il tubo a 120 giri/min per 30-40 min a 37 °C.
   4. Pipettare su e giù per 20 volte per tagliare i pezzi di tessuto digerito usando una pipetta sierologica da 10 ml. Impilare un filtro da 100 μm su un tubo centrifugo da 50 ml e filtrare la sospensione.
   5. Recuperare i pezzi di tessuto sul colino con il mezzo basale e trasferirli in un tubo centrifugo da 15 ml, seguito da un secondo ciclo di taglio e filtraggio. Ulteriori cesoie-filtraggio possono essere eseguite 1x-2x per isolare più cellule, specialmente quando viene procurato un piccolo pezzo di tessuto (ad esempio, <0,5 cm).
   6. Aggiungere FBS al flusso con una concentrazione finale del 2% per terminare la digestione, seguita da centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
   7. Risospesere il pellet cellulare in 10 mL di terreno basale, seguito da centrifugazione a 400 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante.
   8. (Facoltativo) Se molti eritrociti sono visti nel pellet (stimato dal colore del pellet), risospesso il pellet cellulare in 2 ml di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Quindi, aggiungere 10 ml di mezzo basale al tubo, seguito da centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
   9. Risospesciare il pellet in matrice fredda del seminterrato e tenerlo sul ghiaccio. Aggiungere 80-160 μL di matrice basale per cellule recuperate da un tessuto polmonare di dimensioni intorno a 0,5 cm; la quantità è sufficiente per seminare 2-4 goccioline.
   10. Erogare 40 μL di sospensione a ciascun pozzetto di una piastra di coltura di sospensione a 24 pozzetti preriscaldata. Incubare la piastra di coltura a 37 °C per 10-15 min. Lascia che la matrice del seminterrato si solidifichi per formare una goccia.
   11. Aggiungere 500 μL di organoidi polmonari umani mezzo di espansione integrato con 5 nM di Heregulin beta-1 a ciascun pozzetto e incubare la piastra in un incubatore di colture cellulari.
   12. Aggiorna il mezzo ogni 3 giorni. Rimuovere il vecchio mezzo mantenendo intatta la goccia e aggiungere il mezzo fresco con cautela. Passare gli organoidi dopo l'incubazione per 10-14 giorni. Usa Heregulin beta-1 solo nella cultura iniziale prima del primo passaggio.
   13. Osservare gli organoidi al microscopio per assicurarsi che gli organoidi non siano incorporati con una densità cellulare molto elevata. Se una goccia si disintegra a causa di una densità cellulare eccessivamente elevata, recuperare e reincorporare gli organoidi e le cellule con un volume maggiore di matrice basale per produrre più goccioline con una densità cellulare inferiore e desiderabile.

2. Espansione degli organoidi polmonari umani

1. Preparare una pipetta Pasteur bruciando la punta di una pipetta Pasteur su una fiamma, come un bruciatore Bunsen, per restringere l'apertura da 1,5 mm a circa 1,0 mm di diametro. Raffreddare le pipette, seguito da autoclave per sterilizzare. Bagnare le pipette con il mezzo basale per evitare l'attaccamento e la perdita di cellule durante la cesoiatura meccanica.
2. Passaggio organoidi polmonari con taglio meccanico
   1. Utilizzare una punta da 1 ml e un pipetto su e giù per rompere le goccioline ottenute sopra. Quindi, trasferire gli organoidi insieme al mezzo in un tubo centrifugo da 15 ml e regolare il volume a 10 ml con mezzo basale freddo. Scartare il surnatante dopo centrifugazione a 300 x g per 5 min a 4 °C
   2. Lavare nuovamente gli organoidi con 10 ml di mezzo basale freddo. Sospendere gli organoidi in 2 ml di terreno basale freddo. Pipettare su e giù per tagliare gli organoidi in piccoli pezzi con una pipetta Pasteur.
   3. Integrare con mezzo basale ad un volume totale di 10 ml, seguito da centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospesso i frammenti organoidi con matrice basale fredda sufficiente a consentire un'espansione da 1:3 a 1:5. Continua sul ghiaccio.
   4. Posizionare 40 μL di sospensione organoide in ogni pozzetto di una piastra preriscaldata a 24 pozzetti. Incubare la piastra di coltura a 37 °C per 10-15 min. Lascia che la matrice del seminterrato si solidifichi.
   5. Aggiungere 500 μL di terreno di espansione organoide polmonare a ciascun pozzetto e incubare in un incubatore di colture cellulari. Aggiorna il mezzo ogni 3 giorni. Passare gli organoidi ogni 2 settimane con un rapporto da 1:3 a 1:5.
3. Passaggio degli organoidi polmonari con tripsinizzazione
   NOTA: La tripsinizzazione è preferita quando è difficile tagliare l'organoide polmonare in piccoli pezzi usando un pipetto Pasteur, o la dimensione degli organoidi è altamente variabile, o le sperimentazioni successive richiedono organoidi di dimensioni più uniformi.
   1. Raccogliere gli organoidi polmonari come indicato al punto 2.2.1. Sospendere l'organoide in 1 mL di enzima di dissociazione e incubare a bagnomaria a 37 °C per 3-5 min.
   2. Aggiungere 1 mL di mezzo basale al tubo. Tagliare meccanicamente gli organoidi pipettando gli organoidi su e giù in piccoli pezzi usando un pipetto Pasteur. Controllare le dimensioni dei pezzi organoidi al microscopio con ingrandimento 4x. Quindi, aggiungere 40 μL di FBS per terminare la digestione.
      NOTA: Determinare la dimensione dei frammenti organoidi al microscopio in base alla disposizione sperimentale. Se un esperimento ha bisogno di più organoidi o organoidi di dimensioni più uniformi, tagliare gli organoidi in pezzi più piccoli o anche in singole cellule. Quindi, ci vuole più tempo, probabilmente 3 settimane, prima che gli organoidi siano pronti per la sperimentazione.
   3. Rabboccare con mezzo basale fino ad un volume finale di 10 ml, seguito da centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospesso i pezzi organoidi in matrice fredda di basamento con un volume sufficiente al passaggio con un rapporto di 1:5-1:10. Continua sul ghiaccio.
   4. Posizionare 40 μL di sospensione organoide in ogni pozzetto di una piastra preriscaldata a 24 pozzetti. Incubare la piastra di coltura a 37 °C per 10-15 min. Lascia che la matrice del seminterrato si solidifichi.
   5. Integrare con 500 μL di terreno di espansione organoide polmonare per pozzetto e incubare in un incubatore di colture cellulari. Aggiorna il mezzo di espansione ogni 3 giorni. Passaggio degli organoidi dopo 2-3 settimane.
      NOTA: Circa 100 organoidi sono montati all'interno di una goccia da 40 μL di matrice basale. Gli organoidi polmonari normalmente crescono meglio con una densità cellulare relativamente alta. Reincorporare gli organoidi con una densità cellulare inferiore se le goccioline si disintegrano o gli organoidi in crescita si attaccano insieme a causa della densità cellulare eccessivamente elevata.

3. Differenziazione prossimale per generare organoidi maturi delle vie aeree

1. Preparare il mezzo di differenziazione prossimale (mezzo PD) integrando il mezzo basale di interfaccia liquido aria con 1x integratore di interfaccia liquido aria, 1x integratore di interfaccia liquido aria, 4 μg/mL di eparina, 1 μM di idrocortisone, 10 μM di Y-27632 e 10 μM di DAPT (vedi Tabella dei materiali).
2. Organoidi 3D delle vie aeree
   1. Incubare gli organoidi polmonari nel terreno di espansione per 7-10 giorni dopo il passaggio tramite taglio meccanico. Sostituire il mezzo di espansione con il supporto PD. Incubare gli organoidi nel mezzo PD per 14 giorni in un incubatore di colture cellulari.
   2. Scartare il supporto PD in ogni pozzetto. Aggiungere un tampone di lisato cellulare per raccogliere l'organoide differenziato delle vie aeree per l'estrazione dell'RNA e il rilevamento dell'espressione genica cellulare mediante il test RT-qPCR.
   3. In alternativa, incubare gli organoidi a 37 °C per 60 minuti dopo l'aggiunta di 10 mM edTA per dissociare gli organoidi in singole cellule, seguita da analisi citometrica a flusso per esaminare le popolazioni cellulari. Gli organoidi sono pronti per varie manipolazioni sperimentali.
3. Organoide 2D delle vie aeree
   1. Preparare sufficienti organoidi polmonari 3D per la coltura di differenziazione 2D. Un totale di 1,3 x 10⁵ e 4,5 x 10⁵ celle sono necessari rispettivamente per un inserto di supporto permeabile a 24 pozzetti e un inserto di supporto permeabile a 12 pozzetti.
   2. Dopo che gli organoidi polmonari 3D crescono nel mezzo di espansione per 2 settimane, digerire gli organoidi in singole cellule e seminare negli inserti a 24 pozzetti e 12 pozzetti per generare organoidi 2D delle vie aeree.
   3. Pre-incubare gli inserti con il mezzo basale durante la notte in un incubatore di colture cellulari. Aggiungere 250 μL e 500 μL di mezzo basale nella camera superiore e inferiore di una piastra a 24 pozzetti, rispettivamente. Per una piastra a 12 pozzetti, aggiungere 500 μL e 1.000 μL di mezzo basale nella camera superiore e inferiore, rispettivamente.
   4. Raccogliere organoidi polmonari 3D come descritto nella fase 2.2.1. Risospesere gli organoidi con 1 mL di enzima di dissociazione e incubare a bagnomaria a 37 °C per 3-5 min.
   5. Aggiungere 1 mL di mezzo basale al tubo. Pipettare su e giù per tagliare gli organoidi in singole cellule con un pipetto di Pasteur e controllare le cellule al microscopio. Quindi, aggiungere 40 μL di FBS per terminare la digestione.
   6. Filtrare le celle attraverso un filtro da 40 μm in un tubo centrifuga da 50 ml. Trasferire la sospensione cellulare filtrata in un tubo da 15 ml. Rabboccare con mezzo basale per un volume totale di 10 ml, seguito da centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
   7. Risospesso il pellet, raccolto da 24 goccioline (40 μL), in 1-2,5 mL di terreno di espansione organoide polmonare a seconda della densità cellulare nelle goccioline. Contare il numero di cellule con un contatore di cellule al microscopio. Regolare la concentrazione cellulare a 1,3 x 10⁶/mL (per inserti a 24 pozzetti) o 9 x 10⁵/mL (per inserti a 12 pozzetti).
   8. Rimuovere il mezzo basale dalle camere superiore e inferiore. Aggiungere 500 μL e 1.000 μL di terreno di espansione nella camera inferiore dell'inserto a 24 pozzetti e dell'inserto a 12 pozzetti, rispettivamente. Seminare 100 μL e 500 μL di sospensione cellulare preparati nella fase 3.3.7 sulla camera apicale dell'inserto a 24 pozzetti e dell'inserto a 12 pozzetti, rispettivamente.
   9. Incubare in un incubatore di colture cellulari per 2 giorni. Sostituire il mezzo di espansione con il mezzo PD sia nella camera apicale che in quella inferiore delle piastre. Incubare gli organoidi nell'incubatore di colture cellulari per 14 giorni e rinfrescare il mezzo PD ogni 3 giorni.
      NOTA: Le ciglia mobili sono distinguibili negli organoidi 3D e 2D al microscopio dal giorno 7 dopo l'incubazione nel mezzo PD. Dopo 14 giorni di coltura di differenziazione nel mezzo PD, gli organoidi delle vie aeree sono maturi per varie manipolazioni sperimentali.
   10. Misurare la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) a giorni alterni utilizzando un sistema di misurazione della resistenza elettrica secondo un protocollo standard descritto al^{punto 17}.

Risultati

Questo protocollo consente la derivazione di organoidi polmonari umani con un alto tasso di successo. Il tessuto polmonare umano fresco viene tritato in piccoli pezzi e quindi decomposto con collagenasi. Le singole cellule risultanti sono incorporate nella matrice basale e incubate nel mezzo di espansione organoide polmonare integrato con un cocktail di fattori di nicchia per la crescita delle cellule staminali epiteliali (fase 1.1.2). La Figura 1 mostra la microfotografia di cellule polmona...

Discussione

Le vie aeree umane sono rivestite con l'epitelio delle vie aeree, noto anche come epitelio ciliato pseudostratificato. I principali tipi di cellule dell'epitelio delle vie aeree superiori sono le cellule ciliate che consentono il movimento coordinato delle loro ciglia apicali per espellere il muco e le particelle inalate dalle vie aeree, le cellule calici che producono e secernono muco e le cellule basali che rivestono la membrana basale e sono implicate nella rigenerazione. Nelle piccole vie aeree come i bronchioli, l'e...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents for lung organoid culture
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634010	-
A8301	Tocris	2939	500nM
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1x
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)	Trevigen	3533-010-0	70-80%
FGF-10	Peprotech	100-26	20 ng/mL
FGF-7	Peprotech	100-19	5 ng/mL
GlutaMAX (glutamine)	Invitrogen	35050061	1x
HEPES 1M	Invitrogen	15630-056	10 mM
Heregulin β-1	Peprotech	100-03	5 nM
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165	1.25 mM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
Noggin (conditional medium)	home made	-	10x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Invitrogen	15140-122	1x
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	100 µg/mL
Rspondin1 (conditional medium)	home made	-	10x
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	1 µM
Y-27632	Tocris	1254	5 µM
Proximal differentiation medium
DAPT	Tocris	2634	10 µM
Heparin Solution	StemCell Technology	7980	4 µg/mL
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technology	7925	1 µM
PneumaCult-ALI 10X Supplement			air liquid interface supplement
PneumaCult-ALI Basal Medium	StemCell Technology	05001	air liquid interface basal medium
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement			air liquid interface maintenance supplement
Y-27632	Tocris	1254	10 µM
Equipment
Biological safety cabinet	Baker	1-800-992-2537
Carl Zeiss LSM 780 or 800	Zeiss		confocal microscope
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	42093483
Stereo-microscope	Olympus Corporation	CKX31SF
Centrifuge	Eppendorf	5418BG040397
Serological pipettor	Eppendorf
Micropipette	Eppendorf
ZEN black or ZEN blue software	Zeiss		analysis software
Consumables
12mm Trans-well	StemCell Technology	#38023
12-well cell culture plate	Cellstar	665970
15- and 50 ml conical tubes	Thermo Fisher Scientific	L6BF5Z8118
24-well cell culture plate	Cellstar	662160
6.5mm Trans-well	StemCell Technology	#38024
Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm	Sigma-Aldrich	SLGPR33RB
Microfuge tubes	Eppendorf
Micropipette tips	Thermo Fisher Scientific	TFLR140-200-Q21190531
Pasteur pipette glass	Thermo Fisher Scientific	22-378893
Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)	Thermo Fisher Scientific	BA08003, 08004, 08005
Antibodies
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11005
Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11037
Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11007
Mouse Anti-Cytokeratin 5	Abcam	ab128190
Mouse Anti-FOX J1	Invitrogen	14-9965-82
Mouse Anti-Mucin 5AC	Abcam	ab3649
Mouse Anti-β-tubulin 4	Sigma	T7941
Rabbit Anti-p63	Abcam	ab124762
Rat Anti-Uteroglobin/CC-10	R&D Systems	MAB4218-SP
Other reagent
TrypLE Select Enzyme (10X)	Thermo Fisher Scientific	A1217701	dissociation enzyme