Establecimiento de organoides pulmonares humanos y diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias

Resumen

El protocolo presenta un método para derivar organoides pulmonares humanos a partir de tejidos pulmonares primarios, expandir los organoides pulmonares e inducir la diferenciación proximal para generar organoides de las vías respiratorias 3D y 2D que fenopicon fielmente el epitelio de las vías respiratorias humanas.

Resumen

La falta de un modelo robusto in vitro del epitelio respiratorio humano dificulta la comprensión de la biología y la patología del sistema respiratorio. Describimos un protocolo definido para derivar organoides pulmonares humanos a partir de células madre adultas en el tejido pulmonar e inducir la diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias. Los organoides pulmonares se expanden consecutivamente durante más de 1 año con alta estabilidad, mientras que los organoides diferenciados de las vías respiratorias se utilizan para simular morfológica y funcionalmente el epitelio de las vías respiratorias humanas a un nivel casi fisiológico. Así, establecemos un modelo organoide robusto del epitelio de la vía aérea humana. La expansión a largo plazo de los organoides pulmonares y los organoides diferenciados de las vías respiratorias genera una fuente estable y renovable, lo que permite a los científicos reconstruir y expandir las células epiteliales de las vías respiratorias humanas en platos de cultivo. El sistema organoide pulmonar humano proporciona un modelo in vitro único y fisiológicamente activo para diversas aplicaciones, incluido el estudio de la interacción virus-huésped, las pruebas de medicamentos y el modelado de enfermedades.

Introducción

Los organoides se han convertido en una herramienta robusta y universal para el modelado in vitro del desarrollo de órganos y el estudio de la biología y la enfermedad. Cuando se cultivan en un medio de cultivo definido por el factor de crecimiento, las células madre adultas (ASC) de una variedad de órganos pueden expandirse en 3 dimensiones (3D) y autoensamblarse en grupos celulares similares a órganos compuestos de múltiples tipos de células, denominados organoides. El laboratorio de Clevers informó de la derivación del primer organoide derivado de ASC, el organoide intestinal humano, en 2009 ^1,2. Posteriormente, se han establecido organoides derivados de ASC para una variedad de órganos y tejidos humanos, incluyendo próstata ^3,4, hígado ^5,6, estómago ^7,8,9, páncreas¹⁰, glándula mamaria¹¹ y pulmón ^12,13 . Estos organoides derivados de ASC conservaron las propiedades celulares, estructurales y funcionales críticas del órgano nativo y mantuvieron la estabilidad genética y fenotípica en cultivos de expansión a largo plazo^14,15.

Los organoides también pueden derivarse de células madre pluripotentes (PSC), incluidas las células madre embrionarias (ES) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS)¹⁶. Mientras que los organoides derivados de PSC explotan los mecanismos de desarrollo de órganos para su establecimiento, los ASC pueden ser coaccionados para formar organoides mediante la reconstrucción de condiciones que imitan el nicho de células madre durante la autorrenovación fisiológica del tejido o la reparación de tejidos. Los organoides derivados de PSC son modelos favorables para explorar el desarrollo y la organogénesis, aunque no pueden alcanzar el nivel de maduración comparable de los organoides derivados de ASC. El estado de maduración similar al fetal de los organoides derivados de PSC y la complejidad para establecer estos organoides impiden sustancialmente sus amplias aplicaciones para estudiar la biología y la patología en tejidos maduros.

El tracto respiratorio humano, desde la nariz hasta el bronquiolo terminal, está revestido con el epitelio de las vías respiratorias, también llamado epitelio ciliado pseudoestratificado, que consta de cuatro tipos principales de células, es decir, células ciliadas, células caliciformes, células basales y células club. Establecimos el organoide pulmonar humano derivado de ASC a partir de tejidos pulmonares humanos en colaboración con el laboratorio^12,13 de Clevers. Estos organoides pulmonares se expanden consecutivamente en el medio de expansión durante más de un año; la duración precisa varía entre las diferentes líneas organoides obtenidas de diferentes donantes. Sin embargo, en comparación con el epitelio nativo de las vías respiratorias, estos organoides pulmonares expandibles a largo plazo no son lo suficientemente maduros ya que las células ciliadas, la principal población celular en las vías respiratorias humanas, están subrepresentadas en estos organoides pulmonares. Así, desarrollamos un protocolo de diferenciación proximal y generamos organoides de las vías respiratorias 3D y 2D que fenocopian morfológica y funcionalmente el epitelio de las vías respiratorias a un nivel casi fisiológico.

Aquí proporcionamos un protocolo de video para derivar organoides pulmonares humanos de los tejidos pulmonares primarios, expandir los organoides pulmonares e inducir la diferenciación proximal para generar organoides de las vías respiratorias 3D y 2D.

Protocolo

Toda la experimentación con tejidos humanos descritos en este documento fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Hong Kong / Autoridad Hospitalaria Hong Kong West Cluster (UW13-364 y UW21-695). Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de la recolección de tejidos.

1. Derivación del organoide pulmonar humano

1. Preparación de materiales experimentales
   1. Prepare el medio basal complementando el medio DMEM/F12 avanzado con 2 mM de glutamina, 10 mM HEPES, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
   2. Preparar el medio de expansión organoide pulmonar humana complementando el medio basal con 10% de R-spondina 1 medio condicionado, 10% de medio condicionado de Noggin, 1x suplemento de B27, 1,25 mM de N-acetilcisteína, 10 mM de nicotinamida, 5 μM de Y-27632, 500 nM de A-83-01, 1 μM de SB202190, 5 ng/mL de factor de crecimiento fibroblst (FGF)-7, 20 ng/mL de FGF-10 y 100 μg/mL de primocina (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: El medio acondicionado R-spondin 1 y Noggin puede ser reemplazado por R-spondinante comercial 1 (500 ng/mL) y Noggin (100 ng/mL).
   3. Precalentar una placa de cultivo en suspensión de 24 pocillos en una incubadora de cultivo celular. Utilice una incubadora de cultivo celular estándar con 5% de CO₂ y atmósfera humidificada a 37 °C. Descongele la matriz del sótano en una nevera de 4 °C. Mantenga la matriz del sótano y el medio de cultivo en hielo durante la experimentación.
2. Aislamiento celular de tejidos pulmonares humanos para cultivo de organoides en 3D
   1. Procure tejidos pulmonares humanos recién resecados de un tamaño de alrededor de 0,5 cm de pacientes que se someten a resección quirúrgica debido a diversas enfermedades. Transportar los tejidos pulmonares en 30 ml de medio basal a temperatura ambiente y procesarlos lo más rápido posible dentro de una campana de bioseguridad.
   2. Picar los tejidos pulmonares en trozos pequeños (0,5-1 mm) con un bisturí estéril en una placa de cultivo celular de 10 cm. Lavar las piezas de tejido con 10 ml de medio basal frío en un tubo centrífugo de 15 ml, seguido de centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
   3. Desechar el sobrenadante y resuspend el pellet en 8 mL de medio basal suplementado con colagenasa a una concentración final de 2 mg/mL. Digiera las piezas de tejido agitando el tubo a 120 rpm durante 30-40 min a 37 °C.
   4. Pipetee hacia arriba y hacia abajo durante 20x para cortar las piezas de tejido digeridas utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Apilar un colador de 100 μm en un tubo centrífugo de 50 ml y filtrar la suspensión.
   5. Recupere las piezas de tejido en el colador con el medio basal y transfiéralas a un tubo centrífugo de 15 ml, seguido de una segunda ronda de cizallamiento y filtrado. Se puede realizar un filtrado de cizallamiento adicional 1x-2x para aislar más células, especialmente cuando se adquiere un pequeño trozo de tejido (por ejemplo, <0,5 cm).
   6. Agregue FBS al flujo con una concentración final del 2% para terminar la digestión, seguido de centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
   7. Resuspend el pellet celular en 10 mL de medio basal, seguido de centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
   8. (Opcional) Si se ven muchos eritrocitos en el pellet (estimado por el color del pellet), vuelva a suspender el pellet celular en 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos e incube a temperatura ambiente durante 5 min. Luego, agregue 10 ml de medio basal al tubo, seguido de centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
   9. Vuelva a suspender el pellet en la matriz del sótano frío y manténgalo en hielo. Añadir 80-160 μL de matriz basal para células recuperadas de un tejido pulmonar de tamaño alrededor de 0,5 cm; la cantidad es suficiente para sembrar 2-4 gotas.
   10. Dispensar 40 μL de suspensión a cada pocillo de una placa de cultivo de suspensión de 24 pocillos precalentada. Incubar la placa de cultivo a 37 °C durante 10-15 min. Deje que la matriz del sótano se solidifique para formar una gota.
   11. Añadir 500 μL de medio de expansión de organoides pulmonares humanos suplementado con 5 nM de Heregulin beta-1 a cada pocillo e incubar la placa en una incubadora de cultivo celular.
   12. Refresque el medio cada 3 días. Retire el medio viejo mientras mantiene la gota intacta y agregue el medio fresco con precaución. Pase los organoides después de la incubación durante 10-14 días. Use Heregulin beta-1 solo en el cultivo inicial antes del primer pasaje.
   13. Observe los organoides bajo un microscopio para asegurarse de que los organoides no estén incrustados con una densidad celular muy alta. Si una gota se desintegra debido a una densidad celular demasiado alta, recupere y vuelva a incrustar los organoides y las células con un mayor volumen de matriz basal para hacer más gotas con una densidad celular más baja y deseable.

2. Expansión de organoides pulmonares humanos

1. Prepare una pipeta Pasteur quemando la punta de una pipeta Pasteur en una llama, como un quemador Bunsen, para reducir la abertura de 1,5 mm a alrededor de 1,0 mm de diámetro. Enfríe las pipetas, seguido de un autoclave para esterilizar. Humedezca las pipetas con el medio basal para evitar la fijación y pérdida de células durante el cizallamiento mecánico.
2. Paso de organoides pulmonares con cizallamiento mecánico
   1. Use una punta de 1 ml y pipetee hacia arriba y hacia abajo para romper las gotas obtenidas arriba. Luego, transfiera los organoides junto con el medio a un tubo centrífugo de 15 ml y ajuste el volumen a 10 ml con medio basal frío. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C
   2. Lavar los organoides con 10 ml de medio basal frío una vez más. Resuspendir los organoides en 2 mL de medio basal frío. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para cortar los organoides en trozos pequeños con una pipeta Pasteur.
   3. Suplementar con medio basal a un volumen total de 10 mL, seguido de centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspend los fragmentos organoides con matriz de basamento frío suficiente para permitir una expansión de 1:3 a 1:5. Manténgase en hielo.
   4. Coloque 40 μL de suspensión organoide en cada pocillo de una placa de 24 pocillos precalentada. Incubar la placa de cultivo a 37 °C durante 10-15 min. Deje que la matriz del sótano se solidifique.
   5. Añadir 500 μL de medio de expansión organoide pulmonar a cada pocillo e incubar en una incubadora de cultivo celular. Refresque el medio cada 3 días. Pase los organoides cada 2 semanas con una proporción de 1:3 a 1:5.
3. Paso de organoides pulmonares con tripsinización
   NOTA: Se prefiere la tripsinización cuando es difícil cortar el organoide pulmonar en pedazos pequeños usando una pipeta Pasteur, o el tamaño de los organoides es muy variable, o las experimentaciones posteriores requieren organoides de tamaño más uniforme.
   1. Extraiga los organoides pulmonares como se muestra en el paso 2.2.1. Resuspend el organoide en 1 mL de enzima disociación e incubar en un baño de agua a 37 °C durante 3-5 min.
   2. Agregue 1 ml de medio basal al tubo. Corta los organoides mecánicamente mediante pipeteos de los organoides hacia arriba y hacia abajo en pedazos pequeños usando una pipeta Pasteur. Compruebe el tamaño de las piezas organoides bajo un microscopio con un aumento de 4x. Luego, agregue 40 μL de FBS para terminar la digestión.
      NOTA: Determine el tamaño de los fragmentos organoides bajo el microscopio de acuerdo con la disposición experimental. Si un experimento necesita más organoides u organoides de tamaño más uniforme, corte los organoides en pedazos más pequeños o incluso en células individuales. Luego, toma más tiempo, probablemente 3 semanas, antes de que los organoides estén listos para la experimentación.
   3. Recargue con medio basal hasta un volumen final de 10 ml, seguido de centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspend las piezas organoides en matriz de basamento frío con un volumen suficiente para pasar con una proporción de 1:5-1:10. Manténgase en hielo.
   4. Coloque 40 μL de suspensión organoide en cada pocillo de una placa de 24 pocillos precalentada. Incubar la placa de cultivo a 37 °C durante 10-15 min. Deje que la matriz del sótano se solidifique.
   5. Suplementar con 500 μL de medio de expansión organoide pulmonar por pozo e incubar en una incubadora de cultivo celular. Actualice el medio de expansión cada 3 días. Pase los organoides después de 2-3 semanas.
      NOTA: Alrededor de 100 organoides están montados dentro de una gota de 40 μL de matriz basal. Los organoides pulmonares normalmente crecen mejor con una densidad celular relativamente alta. Vuelva a incrustar los organoides con una densidad celular más baja si las gotas se desintegran o los organoides en crecimiento se unen debido a la densidad celular demasiado alta.

3. Diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias

1. Preparar el medio de diferenciación proximal (medio PD) complementando el medio basal de interfaz líquida de aire con 1 suplemento de interfaz de líquido de aire, 1 suplemento de mantenimiento de interfaz líquida de aire, 4 μg/ml de heparina, 1 μM de hidrocortisona, 10 μM de Y-27632 y 10 μM de DAPT (ver Tabla de Materiales).
2. Organoides 3D de las vías respiratorias
   1. Incubar organoides pulmonares en el medio de expansión durante 7-10 días después de la transmisión a través de cizallamiento mecánico. Reemplace el medio de expansión por el medio PD. Incubar los organoides en el medio PD durante 14 días en una incubadora de cultivo celular.
   2. Deseche el medio de DP en cada pozo. Agregue un tampón de lisado celular para cosechar el organoide diferenciado de las vías respiratorias para la extracción de ARN y la detección de la expresión génica celular mediante el ensayo RT-qPCR.
   3. Alternativamente, incube los organoides a 37 ° C durante 60 minutos después de la adición de 10 mM EDTA para disociar los organoides en células individuales, seguido de un análisis de citometría de flujo para examinar las poblaciones celulares. Los organoides están listos para diversas manipulaciones experimentales.
3. Organoide 2D de las vías respiratorias
   1. Preparar suficientes organoides pulmonares 3D para el cultivo de diferenciación 2D. Se requiere un total de 1,3 x 10⁵ y 4,5 x 10⁵ celdas para un inserto de soporte permeable de 24 pocillos y un inserto de soporte permeable de 12 pocillos, respectivamente.
   2. Después de que los organoides pulmonares 3D crezcan en el medio de expansión durante 2 semanas, digiera los organoides en células individuales y firme en los insertos de 24 y 12 pocillos para generar organoides de las vías respiratorias 2D.
   3. Preincubar los insertos con el medio basal durante la noche en una incubadora de cultivo celular. Agregue 250 μL y 500 μL de medio basal en la cámara superior e inferior de una placa de 24 pocillos, respectivamente. Para una placa de 12 pocillos, agregue 500 μL y 1,000 μL de medio basal en la cámara superior e inferior, respectivamente.
   4. Cosechar organoides pulmonares 3D como se describe en el paso 2.2.1. Resuspendir los organoides con 1 ml de enzima disociación e incubar en un baño de agua a 37 °C durante 3-5 min.
   5. Agregue 1 ml de medio basal al tubo. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para cortar los organoides en células individuales con una pipeta Pasteur y verifique las células bajo un microscopio. Luego, agregue 40 μL de FBS para terminar la digestión.
   6. Filtre las células a través de un colador de 40 μm en un tubo centrífugo de 50 ml. Transfiera la suspensión de la celda filtrada a un tubo de 15 ml. Recargue con medio basal a un volumen total de 10 ml, seguido de centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
   7. Resuspend el pellet, recogido de 24 gotas (40 μL), en 1-2,5 mL de medio de expansión organoide pulmonar dependiendo de la densidad celular en las gotas. Cuente el número de células con un contador celular bajo un microscopio. Ajuste la concentración de la celda a 1,3 x 10⁶/ml (para insertos de 24 pocillos) o 9 x 10⁵/ml (para insertos de 12 pocillos).
   8. Retire el medio basal de las cámaras superior e inferior. Agregue 500 μL y 1.000 μL de medio de expansión en la cámara inferior del inserto de 24 pocillos y el inserto de 12 pocillos, respectivamente. Semilla de 100 μL y 500 μL de suspensión celular preparada en la etapa 3.3.7 en la cámara apical del inserto de 24 pocillos y el inserto de 12 pocillos, respectivamente.
   9. Incubar en una incubadora de cultivo celular durante 2 días. Reemplace el medio de expansión con el medio PD en la cámara apical e inferior de las placas. Incubar los organoides en la incubadora de cultivo celular durante 14 días y refrescar el medio de EP cada 3 días.
      NOTA: Los cilios móviles son discernibles en los organoides 3D y 2D bajo un microscopio desde el día 7 después de la incubación en el medio PD. Después de 14 días de cultivo de diferenciación en el medio de EP, los organoides de las vías respiratorias están maduros para diversas manipulaciones experimentales.
   10. Mida la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) cada dos días utilizando un sistema de medición de resistencia eléctrica de acuerdo con un protocolo estándar descrito en¹⁷.

Resultados

Este protocolo permite la derivación de organoides pulmonares humanos con una alta tasa de éxito. El tejido pulmonar humano fresco se pica en trozos pequeños y luego se descompone con colagenasa. Las células individuales resultantes se incrustan en la matriz del basamento y se incuban en el medio de expansión organoide pulmonar complementado con un cóctel de factores de nicho para el crecimiento de células madre epiteliales (paso 1.1.2). La Figura 1 muestra la microfotografía de cél...

Discusión

Las vías respiratorias humanas están revestidas con el epitelio de las vías respiratorias, también conocido como epitelio ciliado pseudoestratificado. Los principales tipos de células del epitelio de las vías respiratorias superiores son las células ciliadas que permiten el movimiento coordinado de sus cilios apicales para expulsar el moco y las partículas inhaladas de las vías respiratorias, las células caliciformes que producen y secretan moco y las células basales que recubren la membrana basal y están imp...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents for lung organoid culture
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634010	-
A8301	Tocris	2939	500nM
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1x
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)	Trevigen	3533-010-0	70-80%
FGF-10	Peprotech	100-26	20 ng/mL
FGF-7	Peprotech	100-19	5 ng/mL
GlutaMAX (glutamine)	Invitrogen	35050061	1x
HEPES 1M	Invitrogen	15630-056	10 mM
Heregulin β-1	Peprotech	100-03	5 nM
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165	1.25 mM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
Noggin (conditional medium)	home made	-	10x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Invitrogen	15140-122	1x
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	100 µg/mL
Rspondin1 (conditional medium)	home made	-	10x
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	1 µM
Y-27632	Tocris	1254	5 µM
Proximal differentiation medium
DAPT	Tocris	2634	10 µM
Heparin Solution	StemCell Technology	7980	4 µg/mL
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technology	7925	1 µM
PneumaCult-ALI 10X Supplement			air liquid interface supplement
PneumaCult-ALI Basal Medium	StemCell Technology	05001	air liquid interface basal medium
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement			air liquid interface maintenance supplement
Y-27632	Tocris	1254	10 µM
Equipment
Biological safety cabinet	Baker	1-800-992-2537
Carl Zeiss LSM 780 or 800	Zeiss		confocal microscope
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	42093483
Stereo-microscope	Olympus Corporation	CKX31SF
Centrifuge	Eppendorf	5418BG040397
Serological pipettor	Eppendorf
Micropipette	Eppendorf
ZEN black or ZEN blue software	Zeiss		analysis software
Consumables
12mm Trans-well	StemCell Technology	#38023
12-well cell culture plate	Cellstar	665970
15- and 50 ml conical tubes	Thermo Fisher Scientific	L6BF5Z8118
24-well cell culture plate	Cellstar	662160
6.5mm Trans-well	StemCell Technology	#38024
Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm	Sigma-Aldrich	SLGPR33RB
Microfuge tubes	Eppendorf
Micropipette tips	Thermo Fisher Scientific	TFLR140-200-Q21190531
Pasteur pipette glass	Thermo Fisher Scientific	22-378893
Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)	Thermo Fisher Scientific	BA08003, 08004, 08005
Antibodies
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11005
Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11037
Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11007
Mouse Anti-Cytokeratin 5	Abcam	ab128190
Mouse Anti-FOX J1	Invitrogen	14-9965-82
Mouse Anti-Mucin 5AC	Abcam	ab3649
Mouse Anti-β-tubulin 4	Sigma	T7941
Rabbit Anti-p63	Abcam	ab124762
Rat Anti-Uteroglobin/CC-10	R&D Systems	MAB4218-SP
Other reagent
TrypLE Select Enzyme (10X)	Thermo Fisher Scientific	A1217701	dissociation enzyme