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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le protocole présente une méthode permettant de dériver des organoïdes pulmonaires humains à partir de tissus pulmonaires primaires, d’élargir les organoïdes pulmonaires et d’induire une différenciation proximale pour générer des organoïdes des voies respiratoires 3D et 2D qui phénopient fidèlement l’épithélium des voies respiratoires humaines.

Résumé

L’absence d’un modèle in vitro robuste de l’épithélium respiratoire humain entrave la compréhension de la biologie et de la pathologie du système respiratoire. Nous décrivons un protocole défini pour dériver des organoïdes pulmonaires humains à partir de cellules souches adultes dans le tissu pulmonaire et induire une différenciation proximale pour générer des organoïdes matures des voies respiratoires. Les organoïdes pulmonaires sont ensuite étendus consécutivement pendant plus de 1 an avec une grande stabilité, tandis que les organoïdes différenciés des voies respiratoires sont utilisés pour simuler morphologiquement et fonctionnellement l’épithélium des voies respiratoires humaines à un niveau quasi physiologique. Ainsi, nous établissons un modèle organoïde robuste de l’épithélium des voies respiratoires humaines. L’expansion à long terme des organoïdes pulmonaires et des organoïdes différenciés des voies respiratoires génère une source stable et renouvelable, permettant aux scientifiques de reconstruire et d’étendre les cellules épithéliales des voies respiratoires humaines dans les boîtes de culture. Le système organoïde pulmonaire humain fournit un modèle in vitro unique et physiologiquement actif pour diverses applications, y compris l’étude de l’interaction virus-hôte, le dépistage de médicaments et la modélisation de la maladie.

Introduction

Les organoïdes sont devenus un outil robuste et universel pour la modélisation in vitro du développement d’organes et l’étude de la biologie et de la maladie. Lorsqu’elles sont cultivées dans un milieu de culture défini par un facteur de croissance, les cellules souches adultes (ASC) d’une variété d’organes peuvent être étendues en 3 dimensions (3D) et auto-assemblées en grappes cellulaires semblables à des organes composées de plusieurs types de cellules, appelées organoïdes. Le laboratoire de Clevers a rapporté la dérivation du premier organoïde dérivé de l’ASC, l’organoïde intestinal humain, en 2009 1,2. Par la suite, des organoïdes dérivés de l’ASC ont été établis pour une variété d’organes et de tissus humains, y compris la prostate 3,4, le foie 5,6, l’estomac 7,8,9, le pancréas10, la glande mammaire11 et le poumon 12,13 . Ces organoïdes dérivés de l’ASC ont conservé les propriétés cellulaires, structurelles et fonctionnelles critiques de l’organe natif et ont maintenu la stabilité génétique et phénotypique dans la culture d’expansion à long terme14,15.

Les organoïdes peuvent également être dérivés de cellules souches pluripotentes (CSP), y compris les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS)16. Alors que les organoïdes dérivés de PSC exploitent les mécanismes de développement des organes pour leur établissement, les ASC peuvent être contraints de former des organoïdes en reconstruisant des conditions qui imitent la niche des cellules souches lors de l’auto-renouvellement physiologique des tissus ou de la réparation des tissus. Les organoïdes dérivés de PSC sont des modèles favorables pour explorer le développement et l’organogenèse, bien qu’incapables d’atteindre le niveau de maturation comparable des organoïdes dérivés de l’ASC. L’état de maturation fœtale des organoïdes dérivés de la CSP et la complexité de l’établissement de ces organoïdes empêchent considérablement leurs vastes applications pour l’étude de la biologie et de la pathologie dans les tissus matures.

Les voies respiratoires humaines, du nez à la bronchiole terminale, sont tapissées de l’épithélium des voies respiratoires, également appelé épithélium cilié pseudostratifié, qui se compose de quatre principaux types de cellules, à savoir les cellules ciliées, les cellules gobelets, les cellules basales et les cellules club. Nous avons créé l’organoïde pulmonaire humain dérivé de l’ASC à partir de tissus pulmonaires humains en collaboration avec le laboratoire12,13 de Clevers. Ces organoïdes pulmonaires sont successivement dilatés dans le milieu d’expansion pendant plus d’un an; la durée précise varie selon les différentes lignées organoïdes obtenues auprès de différents donneurs. Cependant, par rapport à l’épithélium natif des voies respiratoires, ces organoïdes pulmonaires extensibles à long terme ne sont pas assez matures puisque les cellules ciliées, la principale population cellulaire des voies respiratoires humaines, sont sous-représentées dans ces organoïdes pulmonaires. Ainsi, nous avons développé un protocole de différenciation proximale et généré des organoïdes des voies respiratoires 3D et 2D qui phénocopisent morphologiquement et fonctionnellement l’épithélium des voies respiratoires à un niveau quasi physiologique.

Ici, nous fournissons un protocole vidéo pour dériver les organoïdes pulmonaires humains des tissus pulmonaires primaires, élargir les organoïdes pulmonaires et induire une différenciation proximale pour générer des organoïdes des voies respiratoires 3D et 2D.

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Protocole

Toutes les expérimentations utilisant des tissus humains décrits dans le présent document ont été approuvées par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 et UW21-695). Le consentement éclairé des patients a été obtenu avant le prélèvement de tissus.

1. Dérivation d’organoïdes pulmonaires humains

  1. Préparation de matériel expérimental
    1. Préparer le milieu basal en complétant le milieu DMEM/F12 avancé avec 2 mM de glutamine, 10 mM d’HEPES, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.
    2. Préparer le milieu d’expansion organoïde pulmonaire humain en complétant le milieu basal avec 10 % de R-spondine 1 milieu conditionné, 10 % de milieu conditionné noggin, 1x supplément de B27, 1,25 mM de N-acétylcystéine, 10 mM de nicotinamide, 5 μM de Y-27632, 500 nM d’A-83-01, 1 μM de SB202190, 5 ng/mL de facteur de croissance fibroblyte (FGF)-7, 20 ng/mL de FGF-10 et 100 μg/mL de primocine (voir tableau des matériaux).
      REMARQUE: Le milieu conditionné R-spondin 1 et Noggin peut être remplacé par la R-spondine 1 recombinante commerciale (500 ng / mL) et Noggin (100 ng / mL).
    3. Préchauffer une plaque de culture en suspension de 24 puits dans un incubateur de culture cellulaire. Utilisez un incubateur de culture cellulaire standard contenant 5 % de CO2 et une atmosphère humidifiée à 37 °C. Décongeler la matrice du sous-sol dans un réfrigérateur à 4 °C. Gardez la matrice du sous-sol et le milieu de culture sur la glace pendant l’expérimentation.
  2. Isolement cellulaire à partir de tissus pulmonaires humains pour la culture organoïde 3D
    1. Procurez-vous des tissus pulmonaires humains fraîchement réséqués d’une taille d’environ 0,5 cm chez les patients qui subissent une résection chirurgicale en raison de diverses maladies. Transporter les tissus pulmonaires dans 30 mL de milieu basal à température ambiante et traiter le plus rapidement possible à l’intérieur d’une hotte de biosécurité.
    2. Hacher les tissus pulmonaires en petits morceaux (0,5-1 mm) avec un scalpel stérile dans un plat de culture cellulaire de 10 cm. Laver les morceaux de tissu avec 10 mL de milieu basal froid dans un tube centrifuge de 15 mL, suivi d’une centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
    3. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 8 mL de milieu basal complété par de la collagénase à une concentration finale de 2 mg/mL. Digérer les morceaux de tissu en secouant le tube à 120 tr/min pendant 30-40 min à 37 °C.
    4. Pipetez de haut en bas pendant 20x pour cisailler les morceaux de tissu digérés à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Empiler une crépine de 100 μm sur un tube de centrifugeuse de 50 mL et filtrer la suspension.
    5. Récupérez les morceaux de tissu sur la crépine avec le milieu basal et transférez-les dans un tube de centrifugeuse de 15 mL, suivi d’une deuxième série de cisaillement et de filtrage. Un cisaillement-filtrage supplémentaire peut être effectué 1x-2x pour isoler plus de cellules, en particulier lorsqu’un petit morceau de tissu (par exemple, <0,5 cm) est acheté.
    6. Ajouter FBS à l’écoulement avec une concentration finale de 2% pour terminer la digestion, suivie d’une centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
    7. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu basal, puis la centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
    8. (Facultatif) Si de nombreux érythrocytes sont vus dans la pastille (estimée par la couleur de la pastille), remettez en suspension la pastille cellulaire dans 2 mL de tampon de lyse des globules rouges et incubez à température ambiante pendant 5 min. Ensuite, ajouter 10 mL de milieu basal au tube, suivi d’une centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
    9. Remettez en suspension le granulé dans une matrice froide du sous-sol et conservez-le sur la glace. Ajouter 80-160 μL de matrice de sous-sol pour les cellules récupérées à partir d’un tissu pulmonaire de taille d’environ 0,5 cm; la quantité est suffisante pour ensemencer 2-4 gouttelettes.
    10. Distribuer 40 μL de suspension dans chaque puits d’une plaque de culture de suspension préchauffée de 24 puits. Incuber la plaque de culture à 37 °C pendant 10-15 min. Laissez la matrice du sous-sol se solidifier pour former une gouttelette.
    11. Ajouter 500 μL de milieu d’expansion des organoïdes pulmonaires humains complété par 5 nM d’Heregulin bêta-1 à chaque puits et incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire.
    12. Rafraîchissez le support tous les 3 jours. Retirez l’ancien milieu tout en gardant la gouttelette intacte et ajoutez le milieu frais avec prudence. Passage des organoïdes après l’incubation pendant 10-14 jours. Utilisez Heregulin beta-1 uniquement dans la culture initiale avant le premier passage.
    13. Observez les organoïdes au microscope pour vous assurer que les organoïdes ne sont pas incorporés avec une densité cellulaire très élevée. Si une gouttelette se désintègre en raison d’une densité cellulaire trop élevée, récupérez et réincorporez les organoïdes et les cellules avec un volume plus élevé de matrice sous-jacente pour produire plus de gouttelettes avec une densité cellulaire plus faible et souhaitable.

2. Expansion des organoïdes pulmonaires humains

  1. Préparez une pipette Pasteur en brûlant l’extrémité d’une pipette Pasteur sur une flamme, comme un brûleur Bunsen, pour réduire l’ouverture de 1,5 mm à environ 1,0 mm de diamètre. Refroidir les pipettes, puis autoclaver pour stériliser. Mouiller les pipettes avec le milieu basal pour éviter la fixation et la perte de cellules lors du cisaillement mécanique.
  2. Passage des organoïdes pulmonaires avec cisaillement mécanique
    1. Utilisez une pointe de 1 mL et pipet de haut en bas pour briser les gouttelettes obtenues ci-dessus. Ensuite, transférez les organoïdes avec le milieu dans un tube centrifuge de 15 mL et ajustez le volume à 10 mL avec un milieu basal froid. Jeter le surnageant après centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 °C
    2. Laver à nouveau les organoïdes avec 10 mL de milieu basal froid. Remettre en suspension les organoïdes dans 2 mL de milieu basal froid. Pipet de haut en bas pour cisailler les organoïdes en petits morceaux avec une pipette Pasteur.
    3. Compléter avec le milieu basal jusqu’à un volume total de 10 mL, suivi d’une centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettez en suspension les fragments organoïdes avec une matrice de sous-sol froide suffisante pour permettre une expansion de 1:3 à 1:5. Restez sur la glace.
    4. Placer 40 μL de suspension organoïde dans chaque puits d’une plaque préchauffée de 24 puits. Incuber la plaque de culture à 37 °C pendant 10-15 min. Laissez la matrice du sous-sol se solidifier.
    5. Ajouter 500 μL de milieu d’expansion organoïde pulmonaire à chaque puits et incuber dans un incubateur de culture cellulaire. Rafraîchissez le support tous les 3 jours. Passage des organoïdes toutes les 2 semaines avec un rapport de 1:3 à 1:5.
  3. Passage des organoïdes pulmonaires avec trypsinisation
    REMARQUE: La trypsinisation est préférable lorsqu’il est difficile de cisailler l’organoïde pulmonaire en petits morceaux à l’aide d’un pipot Pasteur, ou que la taille des organoïdes est très variable, ou que les expérimentations ultérieures nécessitent des organoïdes de taille plus uniforme.
    1. Prélevez les organoïdes pulmonaires comme indiqué à l’étape 2.2.1. Remettre l’organoïde en suspension dans 1 mL d’enzyme de dissociation et incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 3 à 5 min.
    2. Ajouter 1 mL de milieu basal au tube. Cisaillez les organoïdes mécaniquement en pipettant les organoïdes de haut en bas en petits morceaux à l’aide d’un pipet Pasteur. Vérifiez la taille des pièces organoïdes au microscope à un grossissement 4x. Ensuite, ajoutez 40 μL de FBS pour mettre fin à la digestion.
      REMARQUE: Déterminer la taille des fragments organoïdes au microscope selon l’arrangement expérimental. Si une expérience a besoin de plus d’organoïdes ou d’organoïdes de taille plus uniforme, cisaillez les organoïdes en plus petits morceaux ou même en cellules individuelles. Ensuite, il faut plus de temps, probablement 3 semaines, avant que les organoïdes soient prêts pour l’expérimentation.
    3. Compléter avec le milieu basal jusqu’à un volume final de 10 mL, suivi d’une centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettre en suspension les pièces organoïdes dans une matrice de sous-sol froide avec un volume suffisant pour passer avec un rapport de 1:5-1:10. Restez sur la glace.
    4. Placer 40 μL de suspension organoïde dans chaque puits d’une plaque préchauffée de 24 puits. Incuber la plaque de culture à 37 °C pendant 10-15 min. Laissez la matrice du sous-sol se solidifier.
    5. Complétez avec 500 μL de milieu d’expansion organoïde pulmonaire par puits et incubez dans un incubateur de culture cellulaire. Actualisez le milieu d’expansion tous les 3 jours. Passage des organoïdes après 2-3 semaines.
      REMARQUE: Environ 100 organoïdes sont montés dans une gouttelette de 40 μL de matrice de sous-sol. Les organoïdes pulmonaires se développent normalement mieux avec une densité cellulaire relativement élevée. Réincorporez les organoïdes avec une densité cellulaire plus faible si les gouttelettes se désintègrent ou si les organoïdes en croissance se fixent ensemble en raison de la densité cellulaire trop élevée.

3. Différenciation proximale pour générer des organoïdes matures des voies respiratoires

  1. Préparer le milieu de différenciation proximal (milieu) en complétant le milieu basal de l’interface air liquide avec 1x supplément d’interface air liquide, 1x supplément d’entretien de l’interface air liquide, 4 μg/mL d’héparine, 1 μM d’hydrocortisone, 10 μM de Y-27632 et 10 μM de DAPT (voir tableau des matériaux).
  2. Organoïdes 3D des voies respiratoires
    1. Incuber les organoïdes pulmonaires dans le milieu de dilatation pendant 7 à 10 jours après le passage par cisaillement mécanique. Remplacez le milieu d’expansion par le milieu. Incuber les organoïdes dans le milieu pendant 14 jours dans un incubateur de culture cellulaire.
    2. Jetez le support dans chaque puits. Ajouter un tampon de lysat cellulaire pour prélever l’organoïde différencié des voies respiratoires pour l’extraction de l’ARN et la détection de l’expression des gènes cellulaires par test RT-qPCR.
    3. Alternativement, incuber les organoïdes à 37 °C pendant 60 min après l’ajout de 10 mM d’EDTA pour dissocier les organoïdes en cellules individuelles, suivi d’une analyse par cytométrie en flux pour examiner les populations cellulaires. Les organoïdes sont prêts pour diverses manipulations expérimentales.
  3. Organoïde 2D des voies respiratoires
    1. Préparez suffisamment d’organoïdes pulmonaires 3D pour la culture de différenciation 2D. Au total, 1,3 x 105 et 4,5 x 105 cellules sont nécessaires pour un insert de support perméable à 24 puits et un insert de support perméable à 12 puits, respectivement.
    2. Après la croissance des organoïdes pulmonaires 3D dans le milieu d’expansion pendant 2 semaines, digérez les organoïdes en cellules simples et ensemencez dans les inserts de 24 puits et 12 puits pour générer des organoïdes des voies respiratoires 2D.
    3. Pré-incuber les inserts avec le milieu basal pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire. Ajouter 250 μL et 500 μL de milieu basal dans la chambre supérieure et inférieure d’une plaque de 24 puits, respectivement. Pour une plaque de 12 puits, ajouter 500 μL et 1 000 μL de milieu basal dans la chambre supérieure et inférieure, respectivement.
    4. Prélever des organoïdes pulmonaires 3D comme décrit à l’étape 2.2.1. Remettre en suspension les organoïdes avec 1 mL d’enzyme de dissociation et incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 3-5 min.
    5. Ajouter 1 mL de milieu basal au tube. Pipet de haut en bas pour cisailler les organoïdes en cellules individuelles avec un pipet Pasteur et vérifier les cellules au microscope. Ensuite, ajoutez 40 μL de FBS pour mettre fin à la digestion.
    6. Filtrer les cellules à travers une passoire de 40 μm dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Transférer la suspension de la cellule filtrée dans un tube de 15 mL. Compléter avec le milieu basal jusqu’à un volume total de 10 mL, suivi d’une centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
    7. Remettre en suspension la pastille, recueillie à partir de 24 gouttelettes (40 μL), dans 1 à 2,5 mL de milieu d’expansion organoïde pulmonaire en fonction de la densité cellulaire dans les gouttelettes. Comptez le nombre de cellules avec un compteur de cellules au microscope. Ajuster la concentration de la cellule à 1,3 x 106/mL (pour les inserts à 24 puits) ou 9 x 105/mL (pour les inserts à 12 puits).
    8. Retirez le milieu basal des chambres supérieure et inférieure. Ajouter 500 μL et 1 000 μL de milieu d’expansion dans la chambre inférieure de l’insert à 24 puits et de l’insert à 12 puits, respectivement. Ensemencement de 100 μL et 500 μL de suspension cellulaire préparés à l’étape 3.3.7 sur la chambre apicale de l’insert à 24 puits et de l’insert à 12 puits, respectivement.
    9. Incuber dans un incubateur de culture cellulaire pendant 2 jours. Remplacez le milieu d’expansion par le milieu dans la chambre apicale et inférieure des plaques. Incuber les organoïdes dans un incubateur de culture cellulaire pendant 14 jours et rafraîchir le milieu tous les 3 jours.
      REMARQUE: Les cils mobiles sont discernables dans les organoïdes 3D et 2D au microscope à partir du jour 7 après l’incubation dans le milieu. Après 14 jours de culture de différenciation dans le milieu, les organoïdes des voies respiratoires sont matures pour diverses manipulations expérimentales.
    10. Mesurer la résistance électrique trans-épithéliale (TEER) tous les deux jours à l’aide d’un système de mesure de la résistance électrique selon un protocole standard décrit aupoint 17.

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Résultats

Ce protocole permet la dérivation d’organoïdes pulmonaires humains avec un taux de réussite élevé. Le tissu pulmonaire humain frais est haché en petits morceaux, puis décomposé avec de la collagénase. Les cellules uniques résultantes sont incorporées dans la matrice du sous-sol et incubées dans le milieu d’expansion organoïde pulmonaire complété par un cocktail de facteurs de niche pour l’excroissance des cellules souches épithéliales (étape 1.1.2). La figure 1 montre...

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Discussion

Les voies respiratoires humaines sont tapissées de l’épithélium des voies respiratoires, également connu sous le nom d’épithélium cilié pseudostratifié. Les principaux types de cellules de l’épithélium des voies respiratoires supérieures sont les cellules ciliées qui permettent le mouvement coordonné de leurs cils apicals pour expulser le mucus et les particules inhalées des voies respiratoires, les cellules gobelet qui produisent et sécrètent du mucus et les cellules basales qui tapissent la membra...

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Déclarations de divulgation

J. Z., C.L. et M.C.C. sont répertoriés comme inventeurs sur le brevet des organoïdes des voies respiratoires (numéro de publication: US-2021-0207081-A1). Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Nous remercions le Centre des sciences panoromiques et de l’unité de microscope électronique, Faculté de médecine Li Ka Shing, Université de Hong Kong, pour son aide en imagerie confocale et en cytométrie en flux. Ce travail a été en partie soutenu par le financement du Fonds de recherche médicale et de santé (HMRF, 17161272 et 19180392) du Bureau de l’alimentation et de la santé; Fonds général de recherche (GRF, 17105420) du Conseil des subventions de recherche; et Health@InnoHK, Commission de l’innovation et de la technologie, le gouvernement de la Région administrative spéciale de Hong Kong.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents for lung organoid culture
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634010-
A8301Tocris2939500nM
B27 supplementInvitrogen17504-0441x
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)Trevigen3533-010-070-80%
FGF-10Peprotech100-2620 ng/mL
FGF-7Peprotech100-195 ng/mL
GlutaMAX (glutamine)Invitrogen350500611x
HEPES 1MInvitrogen15630-05610 mM
Heregulin β-1Peprotech100-035 nM
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA91651.25 mM
NicotinamideSigma-AldrichN063610 mM
Noggin (conditional medium)home made-10x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Invitrogen15140-1221x
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
Rspondin1 (conditional medium)home made-10x
SB202190Sigma-AldrichS70671 µM
Y-27632Tocris12545 µM
Proximal differentiation medium
DAPTTocris263410 µM
Heparin SolutionStemCell Technology79804 µg/mL
Hydrocortisone Stock SolutionStemCell Technology79251 µM
PneumaCult-ALI 10X Supplementair liquid interface supplement
PneumaCult-ALI Basal MediumStemCell Technology05001air liquid interface basal medium
PneumaCult-ALI Maintenance Supplementair liquid interface maintenance supplement
Y-27632Tocris125410 µM
Equipment
Biological safety cabinetBaker1-800-992-2537
Carl Zeiss LSM 780 or 800Zeissconfocal microscope
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific42093483
Stereo-microscopeOlympus CorporationCKX31SF
CentrifugeEppendorf5418BG040397
Serological pipettorEppendorf
MicropipetteEppendorf
ZEN black or ZEN blue softwareZeissanalysis software
Consumables
12mm Trans-wellStemCell Technology#38023
12-well cell culture plateCellstar665970
15- and 50 ml conical tubesThermo Fisher ScientificL6BF5Z8118
24-well cell culture plateCellstar662160
6.5mm Trans-wellStemCell Technology#38024
Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µmSigma-AldrichSLGPR33RB
Microfuge tubesEppendorf
Micropipette tipsThermo Fisher ScientificTFLR140-200-Q21190531
Pasteur pipette glassThermo Fisher Scientific22-378893
Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml)Thermo Fisher ScientificBA08003, 08004, 08005
Antibodies
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594InvitrogenA11005
Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488InvitrogenA11001
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594InvitrogenA11037
Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594InvitrogenA11007
Mouse Anti-Cytokeratin 5Abcamab128190
Mouse Anti-FOX J1Invitrogen14-9965-82
Mouse Anti-Mucin 5ACAbcamab3649
Mouse Anti-β-tubulin 4SigmaT7941
Rabbit Anti-p63Abcamab124762
Rat Anti-Uteroglobin/CC-10R&D SystemsMAB4218-SP
Other reagent
TrypLE Select Enzyme (10X)Thermo Fisher ScientificA1217701dissociation enzyme

Références

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  2. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  4. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
  5. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  6. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  7. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
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