JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم تصنيع رقاقة صغيرة منقوشة تم تطويرها حديثا مع نوافذ أكسيد الجرافين من خلال تطبيق تقنيات النظام الكهروميكانيكي الدقيق ، مما يتيح التصوير المجهري الإلكتروني المبرد الفعال وعالي الإنتاجية لمختلف الجزيئات الحيوية والمواد النانوية.

Abstract

أحد القيود الرئيسية على تحليل بنية الجزيئات الحيوية بكفاءة وإنتاجية عالية باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) هو صعوبة إعداد عينات cryo-EM بسماكة جليد خاضعة للرقابة على المستوى النانوي. تم تطوير الشريحة القائمة على السيليكون (Si) ، والتي تحتوي على مجموعة منتظمة من الثقوب الدقيقة مع نافذة أكسيد الجرافين (GO) المنقوشة على فيلم نيتريد السيليكون الذي يتم التحكم فيه بسماكة (SixNy) ، من خلال تطبيق تقنيات النظام الكهروميكانيكي الدقيق (MEMS). تم استخدام الطباعة الحجرية الضوئية للأشعة فوق البنفسجية ، وترسب البخار الكيميائي ، والنقش الرطب والجاف للفيلم الرقيق ، وصب الصفائح النانوية 2D للإنتاج الضخم للرقائق ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO. يتم تنظيم عمق الثقوب الدقيقة للتحكم في سمك الجليد عند الطلب ، اعتمادا على حجم العينة لتحليل cryo-EM. يركز التقارب الإيجابي ل GO تجاه الجزيئات الحيوية على الجزيئات الحيوية ذات الأهمية داخل الثقب الصغير أثناء إعداد عينة cryo-EM. تتيح الشريحة ذات النقوش الدقيقة المزودة بنوافذ GO التصوير بالتبريد EM عالي الإنتاجية لمختلف الجزيئات البيولوجية ، بالإضافة إلى المواد النانوية غير العضوية.

Introduction

تم تطوير المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) لحل البنية ثلاثية الأبعاد (3D) للبروتينات في حالتها الأصلية1،2،3،4. تتضمن هذه التقنية تثبيت البروتينات في طبقة رقيقة (10-100 نانومتر) من الجليد الزجاجي والحصول على صور إسقاط للبروتينات الموجهة عشوائيا باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) ، مع الحفاظ على العينة عند درجة حرارة النيتروجين السائل. يتم الحصول على الآلاف إلى الملايين من صور الإسقاط واستخدامها لإعادة بناء بنية ثلاثية الأبعاد للبروتين بواسطة خوارزميات حسابية 5,6. للحصول على تحليل ناجح باستخدام cryo-EM ، تم أتمتة إعداد عينات التبريد عن طريق تجميد المعدات التي تتحكم في ظروف النشاف والرطوبة ودرجة الحرارة. يتم تحميل محلول العينة على شبكة TEM بغشاء كربوني هولي ، ويتم لطخه على التوالي لإزالة المحلول الزائد ، ثم يتم تجميده بالإيثان السائل لإنتاج جليد زجاجي رقيق 1,5,6. مع التقدم في cryo-EM وأتمتة إعداد العينات7 ، تم استخدام cryo-EM بشكل متزايد لحل بنية البروتينات ، بما في ذلك البروتينات المغلفة للفيروسات وبروتينات القناة الأيونية في غشاء الخلية 8,9,10. يعد هيكل البروتينات المغلفة للجسيمات الفيروسية المسببة للأمراض أمرا مهما لفهم أمراض العدوى الفيروسية ، وكذلك تطوير نظام التشخيص واللقاحات على سبيل المثال ، SARS-CoV-2 11 ، الذي تسبب في جائحةCOVID-19. علاوة على ذلك ، تم تطبيق تقنيات cryo-EM مؤخرا على علوم المواد ، مثل تصوير المواد الحساسة للشعاع المستخدمة في البطارية12،13،14 والأنظمة التحفيزية14،15 وتحليل بنية المواد غير العضوية في حالة الحل 16.

على الرغم من التطورات الملحوظة في cryo-EM والتقنيات ذات الصلة ، توجد قيود في إعداد عينات التبريد ، مما يعوق تحليل بنية 3D عالية الإنتاجية. يعد إعداد فيلم ثلج زجاجي بسماكة مثالية أمرا مهما بشكل خاص للحصول على بنية 3D للمواد البيولوجية بدقة ذرية. يجب أن يكون الجليد رقيقا بما يكفي لتقليل ضوضاء الخلفية من الإلكترونات المتناثرة بواسطة الجليد ولمنع تداخل الجزيئات الحيوية على طول مسار شعاع الإلكترون 1,17. ومع ذلك ، إذا كان الجليد رقيقا جدا ، فقد يتسبب في محاذاة جزيئات البروتين في الاتجاهات المفضلة أو تشويه18،19،20. لذلك ، يجب تحسين سمك الجليد الزجاجي اعتمادا على حجم المادة ذات الاهتمام. علاوة على ذلك ، عادة ما تكون هناك حاجة إلى جهد مكثف لإعداد العينات والفحص اليدوي لسلامة الجليد والبروتين على شبكات TEM المعدة. هذه العملية تستغرق وقتا طويلا للغاية ، مما يعوق كفاءتها لتحليل هيكل 3D عالي الإنتاجية. ولذلك، فإن التحسينات في موثوقية وقابلية استنساخ إعداد عينات التبريد EM من شأنها أن تعزز استخدام cryo-EM في البيولوجيا الهيكلية واكتشاف الأدوية التجارية، وكذلك لعلوم المواد.

هنا ، نقدم عمليات التصنيع الدقيق لصنع شريحة ذات نقوش دقيقة مع نوافذ أكسيد الجرافين (GO) المصممة ل cryo-EM عالي الإنتاجية مع سمك الجليد المتحكم فيه21. تم تصنيع الشريحة ذات النقوش الدقيقة باستخدام تقنيات النظام الكهروميكانيكي الدقيق (MEMS) ، والتي يمكنها التعامل مع بنية وأبعاد الشريحة اعتمادا على أغراض التصوير. تحتوي الشريحة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO على بنية microwell يمكن ملؤها بمحلول العينة ، ويمكن تنظيم عمق البئر الصغير للتحكم في سمك الجليد الزجاجي. يعزز التقارب القوي ل GO للجزيئات الحيوية تركيز الجزيئات الحيوية للتصور ، مما يحسن كفاءة تحليل الهيكل. علاوة على ذلك ، تتكون الشريحة ذات النقوش الدقيقة من إطار Si ، والذي يوفر استقرارا ميكانيكيا عاليا للشبكة19 ، مما يجعلها مثالية للتعامل مع الشريحة أثناء إجراءات إعداد العينات والتصوير بالتبريد EM. لذلك ، توفر الشريحة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO المصنعة بواسطة تقنيات MEMS الموثوقية والتكرار لإعداد عينات cryo-EM ، والتي يمكن أن تمكن من تحليل هيكل فعال وعالي الإنتاجية استنادا إلى cryo-EM.

Protocol

1. تصنيع رقاقة صغيرة مع نوافذ GO (الشكل 1)

  1. إيداع نيتريد السيليكون.
    1. ترسب نيتريد السيليكون منخفض الضغط (SixN y) على جانبي رقاقة Si (قطرها 4 بوصاتوسماكة 100 ميكرومتر) باستخدام ترسب بخار كيميائي منخفض الضغط (LPCVD) عند 830 درجة مئوية وضغط 150 mTorr ، تحت تدفق 170 sccm dichlorosilane (SiH2Cl2 ، DCS) و 38 sccm الأمونيا (NH3).
    2. باستخدام معدل ترسيب ~ 30 Å / min ، تحكم في سمك SixNy ليكون في حدود 25-100 نانومتر عن طريق تغيير وقت الترسب.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد عند التعامل مع رقاقة Si لأن الرقاقة رقيقة جدا وهشة. احرص على عدم ثني الرقاقة أثناء مناولتها أو تحميلها في المعدات.
  2. نمط مقاومة الضوء.
    1. ضع محلول سداسي ميثيل ديسيلازان (HMDS) على رقاقة SixNy المودعة بحجم كاف لتغطية كامل سطح الرقاقة ، وقم بتدوير المعطف بطبقة دوارة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية ، واخبز عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية على صفيحة ساخنة لجعل سطح الرقاقة كارها للماء وبالتالي ضمان أداء طلاء جيد مع مقاومة للضوء (PR).
    2. ضع PR (جدول المواد) الإيجابي بحجم كاف لتغطية كامل سطح الرقاقة ، وقم بتدوير الطبقة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية ، واخبزها على درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 90 ثانية على صفيحة ساخنة. العلاقات العامة المغلفة بالدوران يبلغ سمكها 500 نانومتر.
    3. قم بتعريض الرقاقة المغلفة بالأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي 365 نانومتر وكثافة20 ميجاوات / سم 2) لمدة 5 ثوان من خلال قناع الكروم (الشكل 2A-D) باستخدام محاذاة.
    4. قم بتطوير العلاقات العامة لمدة 1 دقيقة باستخدام مطور (جدول المواد) وشطف الرقاقة عن طريق غمرها في ماء منزوع الأيونات (DI) 2x. جفف الرقاقة المزخرفة بنمط PR بالكامل عن طريق نفخ غاز N2 على سطح الرقاقة.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد أثناء نفخ غاز N2 على رقاقة Si لأن الرقاقة رقيقة جدا وهشة. لا تهب غاز N2 بضغط عال في اتجاه عمودي على الرقاقة ، لأن هذا قد يتسبب في كسر الرقاقة.
  3. نمط SixNy.
    1. حفر SixNy المكشوف بعد نقش العلاقات العامة باستخدام محفور أيون تفاعلي (RIE) تم بناؤه في المختبر ، مع غاز 3 سم سادس فلوريد الكبريت (SF6) عند طاقة ترددات راديوية (RF) تبلغ 50 واط. معدل النقش مع هذه الإعدادات هو ~ 6 Å / s. اضبط وقت الحفر اعتمادا على سمك طبقة SixNy المودعة.
      ملاحظة: قد يختلف معدل النقش ويحتاج إلى تحسين داخل المختبر وفقا لمواصفات معدات RIE المستخدمة.
    2. تخلص من العلاقات العامة عن طريق غمر رقاقة SixN y المنقوشة في الأسيتون في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، تليها شطف الرقاقة عن طريق غمرها في ماء DI 2x. جفف الرقاقة بالكامل عن طريق نفخ غاز N2 على سطح الرقاقة.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد أثناء غمر أو إخراج الرقاقة من المحاليل لأن الرقاقة يمكن كسرها بسبب التوتر السطحي للمحلول. لا تغمر أو تخرج الرقاقة الموازية لسطح المحلول. استخدم ملاقط مناولة الرقاقة الدقيقة مع أطراف ألياف الكربون. لا تمسك الرقاقة بقوة باستخدام الملقط. ارفع جانبا واحدا من الرقاقة حتى تميل الرقاقة إلى زاوية ، حيث يمكن إخراجها من المحلول. قد تنكسر الرقاقة عندما تنحني بسبب القبضة القوية أثناء الرفع.
  4. حفر سي.
    1. تحضير محلول هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) 1.5 متر عن طريق إذابة مسحوق KOH في الماء DI عند 80 درجة مئوية.
    2. اغمررقاقة Si x N y المنقوشة في محلول KOH لحفر Si. اترك الرقاقة في المحلول مع التحريك حتى يمكن ملاحظة نوافذ Si x N y القائمة بذاتها على الجانب الآخر من SixNy المنقوشة.
      ملاحظة: قد يختلف وقت النقش الرطب اعتمادا على سمك Si ؛ بالنسبة لرقاقة بسمك 100 ميكرومتر ، يستغرق النقش الرطب عادة عدة ساعات. لا تقم بتعيين سرعة التحريك عالية جدا أثناء حفر Si لأن نوافذ SixN y القائمةبذاتها رقيقة جدا ويمكن كسرها بواسطة تدفق السائل. في هذه التجربة ، تم تعيين معدل التحريك إلى 250 دورة في الدقيقة.
    3. نظف الرقاقة المحفورة عن طريق غمسها عدة مرات في حمام مائي DI للقضاء على بقايا الحفر. جفف الرقاقة في الهواء.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد أثناء غمر أو إخراج رقاقة Si المنقوشة من المحاليل لأن نوافذ SixNy القائمة بذاتها رقيقة جدا وهشة ويمكن كسرها بسبب التوتر السطحي للمحلول. يجب غمر الرقاقة أو إخراجها بزاوية ، بحيث تدخل حافة الرقاقة وتخرج من الحل أولا.
  5. القضاء على بقايا النقش KOH.
    1. اضغط برفق على حدود صفيف الشرائح باستخدام ملاقط للحصول على مجموعة من الرقائق التي ستكون ذات نقوش دقيقة (الشكل 1B).
    2. تحضير محلول 1.5 M KOH على درجة حرارة 80 درجة مئوية مع التحريك.
    3. اغمر صفيف الرقائق في محلول KOH لمدة 30 ثانية وشطفها عن طريق غمسها في ماء DI 2x. جفف الرقائق بالكامل عن طريق نفخ غاز N2 .
      ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد أثناء غمس الرقائق في المحاليل وتجفيفها بغاز N2 لأن نوافذ SixNy القائمة بذاتها رقيقة جدا وهشة. بينما يتم غمر الشريحة في محلول KOH ، يجب إيقاف التحريك. يجب غمس الرقائق بحوافها أولا في الاتجاه العمودي على المحلول ونفخها بغاز N2 في الاتجاه الموازي.
    4. جفف صفيف الرقائق بالكامل في الهواء لمدة 1 ساعة على الأقل.
  6. نمط العلاقات العامة.
    1. قم بإعداد رقاقة Si فارغة سعة 525 ميكرومتر كدعم صلب. قم بتدوير رقاقة Si ب HMDS والعلاقات العامة الإيجابية ، كما هو موضح أعلاه ، ولكن قم بإرفاق صفيف الرقاقة (مع جانب نافذة SixN y القائمة بذاتها لأعلى) علىرقاقة Si قبل خبز PR. تعمل العلاقات العامة كمادة لاصقة بين الرقاقة وصفيف الرقاقة. اخبز رقاقة Si المرفقة بصفيف الرقائق عند 100 درجة مئوية لمدة 90 ثانية على صفيحة ساخنة.
    2. قم بتغطية مجموعة الشرائح ب HMDS والعلاقات العامة الإيجابية ، كما هو موضح أعلاه.
    3. قم بتعريض مجموعة الشرائح بالأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي 365 نانومتر؛ 20 ميجاوات/سم2 كثافة) لمدة 5 ثوان من خلال قناع الكروم (الشكل 2E، F) باستخدام مصفف.
    4. قم بتطوير العلاقات العامة باستخدام مطور لمدة 15 ثانية ، وشطف مجموعة الشرائح عن طريق غمسها في ماء DI 2x ، وتجفيف مجموعة الشريحة المنقوشة PR بالكامل عن طريق نفخ غاز N2 .
  7. تحضير SixNy ذو النقوش الدقيقة.
    1. Etch Si x Ny بعد نقش العلاقات العامة باستخدام RIE المصنوع في المختبر ، مع 3 sccm SF6 غاز بقوة RF تبلغ 50 واط. تحكم في وقت الحفر اعتمادا على سمك طبقة SixNy.
  8. القضاء على العلاقات العامة.
    1. تخلص من العلاقات العامة عن طريق غمر الشريحة المنقوشة في محلول 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) عند 60 درجة مئوية وتركها طوال الليل. شطف مجموعة الشرائح عن طريق غمسها في ماء DI 2x ، وتجفيف الشريحة المنقوشة بالكامل عن طريق نفخ غاز N2 .
    2. تخلص من بقايا العلاقات العامة باستخدام عملية بلازما O 2 باستخدام غاز 100 sccm O2 بقوة RF تبلغ 150 واط لمدة دقيقة واحدة باستخدام RIE المصنوع في المختبر.
  9. شطف رقاقة منقوشة دقيقة.
    1. تحضير محلول 1.5 M KOH عند 80 درجة مئوية.
    2. اغمر الرقائق ذات النقوش الدقيقة في محلول KOH لمدة 30 ثانية للقضاء التام على بقايا العلاقات العامة وشطف الرقائق عن طريق غمرها في ماء DI 2x. جفف الرقائق بالكامل عن طريق نفخ غاز N2 .
    3. جفف الرقائق بالكامل في الهواء لمدة 1 ساعة على الأقل.
  10. نقل أكسيد الجرافين (GO) بطريقة صب السقوط.
    1. قم بتخفيف محلول GO (2 مجم / مل) إلى 0.2 مجم / لتر بماء DI وسونيكات لمدة 10 دقائق لتفتيت مجاميع صفائح GO. الطرد المركزي محلول GO المخفف عند 300 × g لمدة 30 ثانية.
    2. قم بتفريغ الجانب المحفور Si من الشريحة ذات النقوش الدقيقة لجعل سطح الشريحة بشحنة موجبة باستخدام مفرغ توهج (جدول المواد) عند 15 مللي أمبير لمدة 1 دقيقة.
    3. أسقط 3 ميكرولتر من محلول GO على جانب تفريغ التوهج من الشريحة ذات النقوش الدقيقة واترك السقوط على الشريحة لمدة 1 دقيقة. بعد 1 دقيقة ، قم بمسح محلول GO الزائد على الشريحة باستخدام ورق التصفية.
    4. اغسل الشريحة المنقولة بواسطة GO بقطرات ماء DI المحضرة على فيلم البارافين وامسح ماء DI على الشريحة بورق التصفية. كرر هذا الإجراء 2x على الجانب المنقول GO و 1x على الجانب الآخر. جفف الشريحة المنقولة بواسطة GO في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
    5. اغسل الشريحة ذات النقوش الدقيقة بنوافذ GO عن طريق غمرها في ماء DI وتجفيف الشريحة بغاز N2 .

2. التصوير بالتبريد EM

  1. تحضير عينة التبريد.
    1. قم بإعداد عينة التبريد باستخدام آلة ميكانيكية للغطس بالتبريد (جدول المواد) ، والتي تتحكم في درجة الحرارة والرطوبة ووقت النشاف والقوة. بعد تحميل وسادة النشاف على النشافات ، تأكد من الحفاظ على الرطوبة ودرجة الحرارة في الغرفة عند 100٪ و 15 درجة مئوية ، على التوالي.
    2. التقط الشريحة ذات النقوش الدقيقة باستخدام ملاقط تبريد نموذجية وقم بتحميل الملقط إلى آلة الغطس بالتبريد. Pipet 3 ميكرولتر من محلول العينة على الشريحة ذات النقوش الدقيقة في الجانب المزخرف بالثقب ، مع نوافذ GO في الأسفل. تحكم في وقت النشاف والقوة اعتمادا على محلول العينة.
      ملاحظة: هنا ، تم استخدام العينات البيولوجية ، وهي فيروس نقص المناعة البشرية (HIV-1) ، والفيريتين ، والبروتيازوم 26S ، و groEL ، وجزيئات بروتين الأبوفيريتين ، وبروتينات خيوط تاو للتصوير بالتبريد EM. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام أنواع متنوعة من المواد غير العضوية ، مثل الجسيمات النانوية Fe2O3 (NP) ، والجسيمات النانوية Au ، وقضبان Au النانوية ، والجسيمات النانوية السيليكا ، للتصوير بالتبريد EM. تم تعيين وقت النشاف المطلوب والقوة على مكبس التبريد لأنواع مختلفة من العينات.
    3. بعد عملية النشاف ، قم بتجميد الشريحة المحملة بالعينة على الفور في الإيثان السائل. انقل الشريحة إلى صندوق الشبكة في النيتروجين السائل (LN 2) وقم بتخزينها في LN2 قبل التصوير بالتبريد EM.
  2. قم بإجراء التصوير بالتبريد EM.
    1. قم بتحميل عينة التبريد إلى حامل cryo-EM مع الحفاظ على درجة الحرارة عند -180 درجة مئوية.
    2. قم بتحميل حامل cryo-EM في TEM وراقب العينات باستخدام وضع نظام الحد الأدنى للجرعة (MDS).

النتائج

تم تصنيع رقاقة صغيرة مع نوافذ GO بواسطة تصنيع MEMS ونقل ورقة نانوية 2D GO. تم إنتاج رقائق الأنماط الدقيقة بكميات كبيرة ، مع إنتاج حوالي 500 رقاقة من رقاقة واحدة 4 في رقاقة (الشكل 1B والشكل 2A ، B). يمكن التلاعب بتصميمات الرقائق ذات النقوش الدقيقة باستخدام تصمي...

Discussion

يتم تقديم عمليات التصنيع الدقيق لإنتاج رقائق صغيرة مع نوافذ GO هنا. تم تصميم الشريحة الدقيقة المصنعة لتنظيم سمك طبقة الجليد الزجاجية من خلال التحكم في عمق الثقب الصغير باستخدام نوافذ GO اعتمادا على حجم المادة المراد تحليلها. تم تصنيع شريحة صغيرة النقوش مع نوافذ GO باستخدام سلسلة من تقنيات MEMS...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يقر M.-H.K.، S.K.، M.L.، و J.P. بالدعم المالي المقدم من معهد العلوم الأساسية (رقم المنحة. IBS-R006-D1). تعترف S.K. ، M.L. ، و J.P. بالدعم المالي المقدم من برنامج الباحثين المبدعين الرائدين من خلال جامعة سيول الوطنية (2021) ومنحة NRF الممولة من الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة. NRF-2020R1A2C2101871 ، و NRF-2021M3A9I4022936). M.L. و J.P. يقترفان بالدعم المالي المقدم من زمالة POSCO للعلوم التابعة لمؤسسة POSCO TJ Park ومنحة NRF التي تمولها الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة NRF-2017R1A5A1015365). يقر J.P. بالدعم المالي المقدم من منحة NRF التي تمولها الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة NRF-2020R1A6C101A183)، وبرامج المبادرات البحثية متعددة التخصصات من قبل كلية الهندسة وكلية الطب، جامعة سيول الوطنية (2021). يقر M.-H.K. بالدعم المالي المقدم من منحة NRF التي تمولها الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة NRF-2020R1I1A1A0107416612). يشكر المؤلفون موظفي وطاقم مركز جامعة سيول الوطنية للتصوير الجزيئي والخلوي (SNU CMCI) على جهودهم الدؤوبة ومثابرتهم في تجارب cryo-EM. يشكر المؤلفون S. J. Kim من المركز الوطني لمرافق البحوث المشتركة بين الجامعات للمساعدة في تجارب FIB-SEM.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP)Sigma Aldrich, USA443778
Acetone
AFMPark Systems, South KoreaNX-10
AlignerMidas System, South KoreaMDA-600S
AZ 300 MIF developerAZ Electronic Materials USA Corp., USA184411
Cryo-EM holderGatan, USA626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machineThermo Fisher SCIENTIFIC, USAVitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM)FEI Company, USAHelios NanoLab 650
Glow dischargerTed Pella Inc., USAPELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solutionSigma Aldrich, USA763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%Alfa Aesar, USA10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD)Centrotherm, GermanyLPCVD E1200
maP1205 positive PRMicro resist technology, GermanyA15139
Potassium hydroxide (KOH), flakeDAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea6597-4400
Raman SpectrometerNOST, South KoreaConfocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE)Scientific Engineering, South KoreaLab-built
SEMCarl Zeiss, GermanySUPRA 55VP
Si waferJP COMMERCE, South Korea4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coaterDong Ah Trade Corp., South KoreaACE-200
TEMJEOL, JapanJEM-2100F

References

  1. Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
  2. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
  3. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  4. Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
  5. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
  6. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  7. Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
  8. Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
  9. Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
  10. Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
  11. Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
  12. Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
  13. Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
  14. Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  15. Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
  16. Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
  17. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
  18. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
  19. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
  20. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
  22. Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
  23. Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
  24. Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
  25. Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
  26. Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
  27. Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
  28. Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
  29. Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
  30. Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved