ייצור שבב מיקרו-תבניתי בעובי מבוקר למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית בתפוקה גבוהה

Summary

שבב מיקרו-תבניתי שפותח לאחרונה עם חלונות תחמוצת גרפן מיוצר על ידי יישום טכניקות של מערכת מיקרואלקטרומכנית, המאפשרות הדמיה יעילה ובעלת תפוקה גבוהה של מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית בתפוקה גבוהה של ביומולקולות וננו-חומרים שונים.

Abstract

מגבלה מרכזית לניתוח מבנה יעיל ותפוקה גבוהה של ביומולקולות באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM) היא הקושי להכין דגימות cryo-EM עם עובי קרח מבוקר בקנה מידה ננומטרי. השבב מבוסס הסיליקון (Si), בעל מערך קבוע של מיקרו-חורים עם חלון תחמוצת גרפן (GO) המעוצב על סרט סיליקון ניטריד מבוקר עובי (Si_{x Ny}), פותח על ידי יישום טכניקות של מערכת מיקרואלקטרומכנית (MEMS). פוטוליתוגרפיה של UV, תצהיר אדים כימיים, תחריט רטוב ויבש של הסרט הדק, ויציקת טיפות של חומרי ננו-יריעה דו-ממדיים שימשו לייצור המוני של השבבים בעלי התבניות הזעירות עם חלונות GO. עומק החורים הזעירים מווסת כדי לשלוט בעובי הקרח לפי דרישה, בהתאם לגודל הדגימה לצורך ניתוח cryo-EM. הזיקה החיובית של GO לביו-מולקולות מרכזת את הביומולקולות המעניינות בתוך החור המיקרו במהלך הכנת דגימת cryo-EM. השבב בעל התבנית הזעירה עם חלונות GO מאפשר הדמיית cryo-EM בתפוקה גבוהה של מולקולות ביולוגיות שונות, כמו גם ננו-חומרים אנאורגניים.

Introduction

מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM) פותחה כדי לפתור את המבנה התלת-ממדי (התלת-ממדי) של חלבונים במצבם הטבעי 1,2,3,4. הטכניקה כוללת קיבוע חלבונים בשכבה דקה (10-100 ננומטר) של קרח זגוגי ורכישת תמונות הקרנה של חלבונים בעלי אוריינטציה אקראית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM), כאשר הדגימה נשמרת בטמפרטורת חנקן נוזלי. אלפי עד מיליוני תמונות הקרנה נרכשות ומשמשות לשחזור מבנה תלת-ממדי של החלבון על ידי אלגוריתמים חישוביים ^5,6. לצורך ניתוח מוצלח עם cryo-EM, הכנת דגימת cryo הפכה לאוטומטית על ידי הקפאת הציוד השולט בתנאי הכתם, הלחות והטמפרטורה. תמיסת הדגימה מועמסת על רשת TEM עם ממברנת פחמן חורית, מוכתמת ברצף כדי להסיר את התמיסה העודפת, ולאחר מכן צוללת-קפואה עם אתאן נוזלי כדי לייצר קרח דק וזגוגי ^1,5,6. עם ההתקדמות ב- cryo-EM והאוטומציה של הכנת דגימה⁷, cryo-EM שימש יותר ויותר לפתרון מבנה החלבונים, כולל חלבוני מעטפת עבור וירוסים וחלבוני תעלת יונים בקרום התא ^8,9,10. המבנה של חלבוני מעטפת של חלקיקים נגיפיים פתוגניים חשוב להבנת הפתולוגיה של זיהומים נגיפיים, כמו גם לפיתוח מערכת האבחון והחיסונים, למשל SARS-CoV-2¹¹, שגרמו למגפת COVID-19. יתר על כן, טכניקות cryo-EM יושמו לאחרונה במדעי החומרים, כגון עבור הדמיה של חומרים רגישים לאלומה המשמשים בסוללה 12,13,14 ובמערכות^{קטליטיות 14,15} וניתוח המבנה של חומרים אנאורגניים במצב פתרון¹⁶.

למרות התפתחויות בולטות ב- cryo-EM ובטכניקות רלוונטיות, קיימות מגבלות בהכנת דגימת cryo, מה שמפריע לניתוח מבנה תלת-ממדי בתפוקה גבוהה. הכנת סרט קרח זגוגי בעובי אופטימלי חשובה במיוחד לקבלת המבנה התלת-ממדי של חומרים ביולוגיים ברזולוציה אטומית. הקרח חייב להיות דק מספיק כדי למזער את רעשי הרקע מאלקטרונים המפוזרים על ידי הקרח ולאסור על חפיפה של ביו-מולקולות לאורך נתיב קרן האלקטרונים ^1,17. עם זאת, אם הקרח דק מדי, הוא עלול לגרום למולקולות חלבון להתיישר בכיוונים מועדפים או לנטרל 18,19,20. לכן, עובי הקרח הזגוגי צריך להיות מותאם בהתאם לגודל החומר המעניין. יתר על כן, בדרך כלל נדרש מאמץ נרחב להכנת דגימה ולסינון ידני של שלמות הקרח והחלבון ברשתות ה-TEM המוכנות. תהליך זה גוזל זמן רב, מה שמעכב את יעילותו לניתוח מבנה תלת-ממדי בתפוקה גבוהה. לכן, שיפורים באמינות ובשכפול של הכנת דגימות cryo-EM ישפרו את השימוש ב- cryo-EM בביולוגיה מבנית ובגילוי תרופות מסחריות, כמו גם במדע החומרים.

כאן, אנו מציגים תהליכי מיקרו-פבריקציה ליצירת שבב בעל תבנית מיקרו עם חלונות תחמוצת גרפן (GO) המיועדים לקריו-EM בתפוקה גבוהה עם עובי קרח מבוקר²¹. השבב בעל התבנית הזעירה יוצר באמצעות טכניקות של מערכת מיקרו-אלקטרומכנית (MEMS), שיכולה לתמרן את המבנה והממדים של השבב בהתאם למטרות ההדמיה. לשבב המיקרו-תבניתי עם חלונות GO יש מבנה מיקרווול שניתן למלא בתמיסת הדגימה, וניתן לווסת את עומק המיקרווול כדי לשלוט בעובי הקרח הזגוגי. הזיקה החזקה של GO לביומולקולות מגבירה את ריכוז הביומולקולות להדמיה, ומשפרת את היעילות של ניתוח המבנה. יתר על כן, השבב בעל התבנית הזעירה מורכב ממסגרת Si, המספקת יציבות מכנית גבוהה עבור הרשת¹⁹, מה שהופך אותה לאידיאלית לטיפול בשבב במהלך הליכי הכנת דגימה והדמיית cryo-EM. לכן, שבב מיקרו-תבניתי עם חלונות GO המיוצרים על ידי טכניקות MEMS מספק אמינות ושכפול של הכנת דגימת cryo-EM, אשר יכול לאפשר ניתוח מבנה יעיל ותפוקה גבוהה המבוסס על cryo-EM.

Protocol

1. ייצור שבב עם מיקרו-דפוס עם חלונות GO (איור 1)

1. להפקיד את הסיליקון ניטריד.
   1. הפקדת סיליקון ניטריד במתח נמוך (Si_xN_y) משני צידי פרוסת Si (קוטר 4 אינץ ' ועובי של 100 מיקרומטר) באמצעות תצהיר אדים כימי בלחץ נמוך (LPCVD) בטמפרטורה של 830 °C ולחץ של 150 mTorr, תחת זרימה של 170 sccm dichlorosilane (SiH₂Cl₂, DCS) ו 38 sccm אמוניה (NH₃).
   2. באמצעות קצב תצהיר של ~30 Å/min, שלוט בעובי Si_xN_y כדי להיות בטווח של 25-100 ננומטר על ידי שינוי זמן התצהיר.
      הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת הטיפול בוופל Si מכיוון שהופל דק מאוד ושברירי. היזהרו שלא לכופף את הוופל במהלך הטיפול או ההעמסה שלו בציוד.
2. תבנית את הפוטורסיסט.
   1. יש למרוח תמיסת הקסמתילדיזילאזאן (HMDS) על פרוסת Si_xN_עם נפח מספיק כדי לכסות את כל פני השטח של הוופל, סובבו ציפוי עם מעיל ספין ב-3,000 סל"ד למשך 30 שניות, ואופים בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות על צלחת חמה כדי להפוך את משטח הוופל להידרופובי ובכך להבטיח ביצועי ציפוי טובים עם פוטורסיסט (PR).
   2. יש למרוח יחסי ציבור חיוביים (טבלת חומרים) עם נפח מספיק כדי לכסות את כל פני השטח של הוופל, לסובב את הפרווה ב-3,000 סל"ד למשך 30 שניות, ולאפות ב-100 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות על צלחת חמה. ליח"צ מצופה ספין יש עובי של 500 ננומטר.
   3. חשוף את הוופל המצופה PR באור אולטרה סגול (אורך גל של 365 ננומטר ועוצמה של 20 mW/cm²) במשך 5 שניות דרך מסכת כרום (איור 2A-D) באמצעות יישור שיניים.
   4. פתחו את יחסי הציבור למשך דקה אחת באמצעות מפתח (טבלת חומרים) ושטפו את הוופל על ידי טבילתו במים שעברו דה-יוניזציה (DI) פי 2. ייבשו לחלוטין את הוופל בדוגמת PR על ידי נשיפת גז N₂ על משטח הוופל.
      הערה: יש לנקוט בזהירות רבה בעת נשיפת גז N₂ על פרוסת Si מכיוון שהופל דק מאוד ושברירי. אין לפוצץ גז N₂ בלחץ גבוה בכיוון הניצב לוופל, שכן הדבר עלול לגרום לוופל להישבר.
3. תבנית Si_xn_y.
   1. חרטו את ה-Si_{x nN y} שנחשף בעקבות התבנית של ה-PR באמצעות תחריט יונים תגובתי שנבנה במעבדה (RIE), עם גז הקספלואוריד גופריתי של 3 sccm (SF₆) בהספק גלי רדיו (RF) של 50 W. קצב התחריט עם הגדרות אלה הוא ~ 6 Å /s. הגדר את זמן החריטה בהתאם לעובי של שכבת Si_xN_y שהופקדה.
      הערה: קצב התחריט עשוי להשתנות ולדרוש אופטימיזציה במעבדה בהתאם למפרטים של ציוד ה- RIE המשמש.
   2. בטל את יחסי הציבור על ידי טבילת הוופל בדוגמת Si_xN_y באצטון בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטיפת הוופל על ידי טבילתו במי DI 2x. ייבשו את הוופל באופן מלא על ידי נשיפת גז N₂ על משטח הוופל.
      הערה: יש לנקוט בזהירות רבה בעת טבילה או הוצאת הוופל מהתמיסות מכיוון שהופל יכול להישבר על ידי מתח הפנים של התמיסה. אין לטבול או להוציא את הוופל המקביל לפני השטח של התמיסה. השתמשו בפינצטה לטיפול בפרוסות מדויקות עם קצוות מסיבי פחמן. אין לתפוס בחוזקה את הוופל עם הפינצטה; הרימו צד אחד של הוופל עד שהופל יטה לזווית, שם ניתן להוציא אותו מהתמיסה. הוופל עלול להישבר כאשר הוא מתכופף עקב האחיזה האיתנה במהלך ההרמה.
4. תחרוט את הסי.
   1. הכינו תמיסת אשלגן הידרוקסיד (KOH) של 1.5 מ' על ידי המסת אבקת KOH במי DI בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס.
   2. טבלו את הוופל בדוגמת Si_xN_y בתמיסת KOH כדי לחרוט את Si. השאירו את הוופל החשוף בתמיסה עם ערבוב עד שניתן יהיה לצפות בחלונות Si_xN_y העומדים בפני עצמם בצד הנגדי של Si_{x Ny} התבניתי.
      הערה: זמן החריטה הרטוב עשוי להשתנות בהתאם לעובי ה- Si; עבור פרוסה בעובי 100 מיקרומטר, תחריט רטוב בדרך כלל לוקח מספר שעות. אין להגדיר את מהירות הערבוב גבוהה מדי במהלך תחריט Si מכיוון שחלונות Si_xN_y העומדים בפני עצמם דקים מאוד ועלולים להישבר על ידי זרימת הנוזל. בניסוי זה נקבע קצב הערבוב ל-250 סל"ד.
   3. נקו את הוופל החרוט על ידי טבילתו מספר פעמים באמבט מים DI כדי למנוע שאריות תחריט. מייבשים את הוופל באוויר.
      הערה: יש לנקוט בזהירות רבה בעת טבילה או הוצאה של פרוסת תבנית Si מהתמיסות מכיוון שחלונות Si_xN_y העומדים בפני עצמם הם דקים מאוד ושבריריים ויכולים להישבר על ידי מתח הפנים של התמיסה. יש לטבול את הוופל או להוציא אותו בזווית, כך שקצה הוופל נכנס ויוצא מהתמיסה תחילה.
5. בטל את שאריות התחריט של KOH.
   1. לחץ קלות על גבולות מערך השבבים באמצעות פינצטה כדי להשיג מערך של שבבים שיהיו בעלי תבנית מיקרו (איור 1B).
   2. הכינו תמיסת KOH של 1.5 M בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עם ערבוב.
   3. טבלו את מערך השבבים בתמיסת KOH למשך 30 שניות ושטפו אותו על ידי טבילתו במי DI 2x. ייבשו את השבבים במלואם על ידי ניפוח גז N₂ .
      הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת טבילת השבבים בתמיסות וייבושם בגז N₂ מכיוון שחלונות Si_xN_y העומדים בפני עצמם דקים ושבריריים מאוד. בעוד השבב שקוע בתמיסת KOH, יש להפסיק את הערבוב. את השבבים יש לטבול עם הקצוות שלהם תחילה בכיוון הניצב לתמיסה ולפוצץ בגז N₂ בכיוון המקביל.
   4. ייבשו באופן מלא את מערך השבבים באוויר למשך שעה אחת לפחות.
6. תבנית יחסי הציבור.
   1. הכן פרוסת Si 525 μm ריקה כתמיכה מוצקה. ספין מצפה את פרוסת Si עם HMDS ויח"צ חיובי, כמתואר לעיל, אך חבר את מערך השבבים (עם צד החלון Si_xN_y העומד בפני עצמו כלפי מעלה) על פרוסת Si לפני אפיית יחסי הציבור. יחסי הציבור משמשים כדבק בין הוופל למערך השבבים. יש לאפות את פרוסת ה-Si המחוברת למערך השבבים בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות על גבי צלחת חמה.
   2. ספין מצפה את ערכת השבבים עם HMDS ויח"צ חיובי, כפי שתואר לעיל.
   3. חשוף את ערכת השבבים באור אולטרה סגול (אורך גל של 365 ננומטר; עוצמה של 20 mW/cm²) במשך 5 שניות דרך מסכת כרום (איור 2E,F) באמצעות יישור שיניים.
   4. לפתח את יחסי הציבור באמצעות מפתח במשך 15 שניות, לשטוף את ערכת השבבים על ידי טבילתו במי DI 2x, ולייבש באופן מלא את השבב בדוגמת PR שנקבע על ידי ניפוח גז N₂ .
7. הכן את ה- Si_{x n}y בעל התבנית הזעירה.
   1. Etch Si_xN_y בעקבות דפוס ה- PR באמצעות RIE שנבנה במעבדה, עם גז SF₆ של 3 sccm בהספק RF של 50 W. שלוט בזמן התחריט בהתאם לעובי שכבת Si_xN_y .
8. לחסל את יחסי הציבור.
   1. בטל את יחסי הציבור על ידי טבילת השבב המעוצב שנקבע בתמיסת 1-מתיל-2-פירולידיינון (NMP) ב-60 מעלות צלזיוס והשארתו למשך הלילה. שטפו את ערכת השבבים על ידי טבילתו במי DI 2x, ויבשו לחלוטין את השבב המעוצב שנקבע על ידי ניפוח גז N₂ .
   2. בטל את שאריות ה- PR עם תהליך פלזמה O₂ באמצעות גז 100 sccm O₂ בהספק RF של 150 W למשך דקה אחת עם RIE שנבנה במעבדה.
9. יש לשטוף את השבב בעל התבנית הזעירה.
   1. הכן פתרון KOH של 1.5 M בטמפרטורה של 80 °C (80 °F).
   2. טבלו את השבבים בעלי התבניות הזעירות בתמיסת KOH במשך 30 שניות כדי לחסל לחלוטין את שאריות היח"צ ולשטוף את השבבים על ידי טבילתם במי DI 2x. ייבשו את השבבים במלואם על ידי ניפוח גז N₂ .
   3. ייבשו לחלוטין את השבבים באוויר במשך שעה אחת לפחות.
10. העברת תחמוצת גרפן (GO) בשיטת יציקת הטיפה.
    1. דיללו את תמיסת GO (2 מ"ג/מ"ל) ל-0.2 מ"ג/ל' עם מי DI וסוניקאט במשך 10 דקות כדי לפרק אגרגטים של יריעות GO. צנטריפוגה את פתרון GO מדולל ב 300 x g עבור 30 s.
    2. זוהר פורק את הצד החרוט Si של השבב בעל התבנית הזעירה כדי להפוך את משטח השבב עם מטען חיובי באמצעות פורק זוהר (טבלת חומרים) ב-15 mA למשך דקה אחת.
    3. שחררו 3 μL של תמיסת ה-GO על הצד הנקי הזוהר של השבב בעל התבנית הזעירה והשאירו את הטיפה על השבב למשך דקה אחת. לאחר דקה אחת, הכתימו את תמיסת GO העודפת על השבב עם נייר סינון.
    4. שטפו את השבב המועבר על ידי GO עם טיפות מים DI שהוכנו על סרט פרפין והכתימו את מי ה-DI על השבב עם נייר מסנן. חזור על הליך זה 2x בצד שהועבר GO ו- 1x בצד הנגדי. מייבשים את השבב המועבר על ידי GO בטמפרטורת החדר במהלך הלילה.
    5. שטפו את השבב בעל התבנית הזעירה עם חלונות GO על ידי טבילתו במי ה-DI וייבשו את השבב בגז N₂ .

2. הדמיית Cryo-EM

1. הכינו את דוגמת הקריו.
   1. הכינו את דגימת הקריו באמצעות מכונת צניחת קריו מכנית (טבלת חומרים), השולטת בטמפרטורה, בלחות, בזמן הכתם ובכוח. לאחר העמסת כרית הכתם על הכתמים, ודא כי הלחות והטמפרטורה בתא נשמרות על 100% ו -15 מעלות צלזיוס, בהתאמה.
   2. הרימו את השבב בעל התבנית הזעירה עם פינצטה אופיינית וטענו את הפינצטה למכונת הצלילה של cryo. Pipet 3 μL של תמיסת דגימה על שבב מיקרו-תבניתי בצד בדוגמת חור, עם חלונות GO בתחתית. שלוט בזמן הכתם ובכוח בהתאם לתמיסת המדגם.
      הערה: כאן, דגימות ביולוגיות, כלומר נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV-1), פריטין, פרוטאזום 26S, groEL, חלקיקי חלבון אפופריטין וחלבוני חוטי טאו שימשו להדמיית cryo-EM. בנוסף, סוגים מגוונים של חומרים אנאורגניים, כגון_{Fe 2}O₃ ננו-חלקיקים (NP), ננו-חלקיקי Au, ננו-חלקיקי Au, וננו-חלקיקי סיליקה, שימשו להדמיית cryo-EM. זמן הכתם והכוח הרצויים נקבעו על בוכנת הקריו לסוגים שונים של דגימות.
   3. לאחר תהליך ההדבקה, להקפיא-להקפיא את השבב הטעון דגימה מיד באתאן נוזלי. העבירו את השבב לתיבת הרשת בחנקן נוזלי (LN₂) ואחסנו אותו ב-LN₂ לפני הדמיית cryo-EM.
2. בצע הדמיית cryo-EM.
   1. טען את דגימת ה- cryo למחזיק cryo-EM עם הטמפרטורה שנשמרה ב - 180 ° צלזיוס.
   2. טען את מחזיק ה- cryo-EM לתוך TEM והתבונן בדגימות עם מצב מערכת המינון המינימלי (MDS).

תוצאות

שבב בדוגמת מיקרו עם חלונות GO יוצר על ידי ייצור MEMS והעברת ננו-יריעות GO דו-ממדיות. שבבים למיקרו-דפוסים יוצרו בייצור המוני, עם כ-500 שבבים שהופקו מתוך פרוסה אחת של 4 אינץ' (איור 1B ואיור 2A,B). ניתן לתפעל את העיצובים של השבבים בעלי התבניות הזעירות באמצעות עיצ?...

Discussion

תהליכי המיקרו-פבריקציה לייצור שבבים עם מיקרו-תבניות עם חלונות GO מוצגים כאן. השבב המיקרו-תבניתי המפוברק נועד לווסת את עובי שכבת הקרח הזגוגית על ידי שליטה בעומק המיקרו-חור באמצעות חלונות GO בהתאם לגודל החומר שיש לנתח. שבב בעל תבנית מיקרו עם חלונות GO יוצר באמצעות סדרה של טכניקות MEMS ושיטת העברת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP)	Sigma Aldrich, USA	443778
Acetone
AFM	Park Systems, South Korea	NX-10
Aligner	Midas System, South Korea	MDA-600S
AZ 300 MIF developer	AZ Electronic Materials USA Corp., USA	184411
Cryo-EM holder	Gatan, USA	626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine	Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA	Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM)	FEI Company, USA	Helios NanoLab 650
Glow discharger	Ted Pella Inc., USA	PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution	Sigma Aldrich, USA	763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%	Alfa Aesar, USA	10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD)	Centrotherm, Germany	LPCVD E1200
maP1205 positive PR	Micro resist technology, Germany	A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake	DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea	6597-4400
Raman Spectrometer	NOST, South Korea	Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE)	Scientific Engineering, South Korea	Lab-built
SEM	Carl Zeiss, Germany	SUPRA 55VP
Si wafer	JP COMMERCE, South Korea		4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater	Dong Ah Trade Corp., South Korea	ACE-200
TEM	JEOL, Japan	JEM-2100F