Fabrication d’une puce à micro-motifs avec épaisseur contrôlée pour la microscopie électronique cryogénique à haut débit

Résumé

Une puce à micro-motifs nouvellement développée avec des fenêtres en oxyde de graphène est fabriquée en appliquant des techniques de système microélectromécanique, permettant une imagerie efficace et à haut débit par microscopie électronique cryogénique de diverses biomolécules et nanomatériaux.

Résumé

Une limitation majeure pour l’analyse efficace et à haut débit de la structure des biomolécules à l’aide de la microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) est la difficulté de préparer des échantillons cryo-EM avec une épaisseur de glace contrôlée à l’échelle nanométrique. La puce à base de silicium (Si), qui a un réseau régulier de micro-trous avec une fenêtre d’oxyde de graphène (GO) modelée sur un film de nitrure de silicium (Si_xN_y) à épaisseur contrôlée, a été développée en appliquant des techniques de système microélectromécanique (MEMS). La photolithographie UV, le dépôt chimique en phase vapeur, la gravure humide et sèche du film mince et la coulée par goutte de matériaux nanofeuilles 2D ont été utilisés pour la production en série des puces à micro-motifs avec des fenêtres GO. La profondeur des micro-trous est régulée pour contrôler l’épaisseur de la glace à la demande, en fonction de la taille de l’échantillon pour l’analyse cryo-EM. L’affinité favorable de GO pour les biomolécules concentre les biomolécules d’intérêt dans le micro-trou lors de la préparation de l’échantillon cryo-EM. La puce à micro-motifs avec fenêtres GO permet une imagerie cryo-EM à haut débit de diverses molécules biologiques, ainsi que de nanomatériaux inorganiques.

Introduction

La microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) a été développée pour résoudre la structure tridimensionnelle (3D) des protéines dans leur état natif 1,2,3,4. La technique consiste à fixer des protéines dans une fine couche (10-100 nm) de glace vitrée et à acquérir des images de projection de protéines orientées aléatoirement à l’aide d’un microscope électronique à transmission (TEM), l’échantillon étant maintenu à la température de l’azote liquide. Des milliers à des millions d’images de projection sont acquises et utilisées pour reconstruire une structure 3D de la protéine par des algorithmes de calcul ^5,6. Pour une analyse réussie avec cryo-EM, la préparation des cryo-échantillons a été automatisée en gelant l’équipement qui contrôle les conditions de buvardage, l’humidité et la température. La solution d’échantillon est chargée sur une grille TEM avec une membrane de carbone trouée, successivement effacée pour éliminer l’excès de solution, puis congelée avec de l’éthane liquide pour produire de la glace mince et vitreuse ^1,5,6. Avec les progrès de la cryo-EM et l’automatisation de la préparation des échantillons⁷, la cryo-EM a été de plus en plus utilisée pour résoudre la structure des protéines, y compris les protéines d’enveloppe pour les virus et les protéines des canaux ioniques dans la membrane cellulaire ^8,9,10. La structure des protéines d’enveloppe des particules virales pathogènes est importante pour comprendre la pathologie de l’infection virale, ainsi que pour développer le système de diagnostic et les vaccins, par exemple le SRAS-CoV-2¹¹, qui a causé la pandémie de COVID-19. De plus, les techniques cryo-EM ont récemment été appliquées aux sciences des matériaux, telles que l’imagerie de matériaux sensibles aux faisceaux utilisés dans les batteries ^12,13,14 et les systèmes catalytiques ^14,15 et l’analyse de la structure des matériaux inorganiques à l’état de solution¹⁶.

Malgré les développements notables de la cryo-EM et des techniques pertinentes, il existe des limites dans la préparation des cryo-échantillons, ce qui entrave l’analyse de la structure 3D à haut débit. La préparation d’un film de glace vitreux avec une épaisseur optimale est particulièrement importante pour obtenir la structure 3D de matériaux biologiques à résolution atomique. La glace doit être suffisamment mince pour minimiser le bruit de fond des électrons dispersés par la glace et pour interdire les chevauchements de biomolécules le long du trajet du faisceau ^{d’électrons 1,17}. Cependant, si la glace est trop mince, elle peut entraîner l’alignement des molécules de protéines dans les orientations préférées ou dénaturer 18,19,20. Par conséquent, l’épaisseur de la glace vitreuse doit être optimisée en fonction de la taille du matériau d’intérêt. De plus, des efforts considérables sont généralement nécessaires pour la préparation des échantillons et le criblage manuel de l’intégrité de la glace et des protéines sur les grilles TEM préparées. Ce processus prend énormément de temps, ce qui nuit à son efficacité pour l’analyse de structure 3D à haut débit. Par conséquent, l’amélioration de la fiabilité et de la reproductibilité de la préparation des échantillons cryo-EM améliorerait l’utilisation de la cryo-EM en biologie structurale et en découverte commerciale de médicaments, ainsi que pour la science des matériaux.

Ici, nous présentons des procédés de microfabrication pour la fabrication d’une puce à micro-motifs avec des fenêtres en oxyde de graphène (GO) conçues pour le cryo-EM à haut débit avec une épaisseur de glace contrôlée²¹. La puce à micro-motifs a été fabriquée à l’aide de techniques de système microélectromécanique (MEMS), qui peuvent manipuler la structure et les dimensions de la puce en fonction des objectifs d’imagerie. La puce à micro-motifs avec fenêtres GO a une structure de micropuit qui peut être remplie avec la solution d’échantillon, et la profondeur du micropuit peut être régulée pour contrôler l’épaisseur de la glace vitrée. La forte affinité de GO pour les biomolécules augmente la concentration de biomolécules pour la visualisation, améliorant ainsi l’efficacité de l’analyse de structure. En outre, la puce à micro-motifs est composée d’un cadre En Si, qui offre une grande stabilité mécanique à la grille¹⁹, ce qui la rend idéale pour la manipulation de la puce lors des procédures de préparation des échantillons et de l’imagerie cryo-EM. Par conséquent, une puce à micro-motifs avec des fenêtres GO fabriquées par des techniques MEMS assure la fiabilité et la reproductibilité de la préparation des échantillons cryo-EM, ce qui peut permettre une analyse de structure efficace et à haut débit basée sur cryo-EM.

Protocole

1. Fabrication d’une puce à micro-motifs avec des fenêtres GO (Figure 1)

1. Déposez le nitrure de silicium.
   1. Déposer du nitrure de silicium à faible contrainte (Si_xN_y) des deux côtés de la plaquette de Si (4 pouces de diamètre et 100 μm d’épaisseur) en utilisant un dépôt chimique en phase vapeur à basse pression (LPCVD) à 830 °C et une pression de 150 mTorr, sous un débit de 170 sccm de dichlorosilane (SiH₂Cl₂, DCS) et de 38 sccm d’ammoniac (NH₃).
   2. À l’aide d’un taux de dépôt d’environ 30 Å/min, contrôlez l’épaisseur de Si_xN_y à l’intérieur de 25-100 nm en faisant varier le temps de dépôt.
      REMARQUE: Des précautions extrêmes doivent être prises lors de la manipulation de la plaquette Si car la plaquette est très mince et fragile. Veillez à ne pas plier la plaquette lors de sa manipulation ou de son chargement dans l’équipement.
2. Motif de la résine photosensible.
   1. Appliquer une solution d’hexaméthyldisilazane (HMDS) sur la plaquette de Si_xN_y déposée avec un volume suffisant pour couvrir toute la surface de la plaquette, spin coat avec un spin coater à 3 000 tr/min pendant 30 s, et cuire à 95°C pendant 30 s sur une plaque chauffante pour rendre la surface de la plaquette hydrophobe et ainsi assurer une bonne performance de revêtement avec photorésine (PR).
   2. Appliquer un PR positif (Table des matériaux) avec un volume suffisant pour couvrir toute la surface de la plaquette, faire tourner la couche à 3 000 tr/min pendant 30 s et cuire au four à 100 °C pendant 90 s sur une plaque chauffante. Le PR à revêtement de spin a une épaisseur de 500 nm.
   3. Exposer la plaquette revêtue de PR avec de la lumière ultraviolette (longueur d’onde de 365 nm et intensité de 20 mW/^cm2) pendant 5 s à travers un masque de chrome (Figure 2A-D) à l’aide d’un aligneur.
   4. Développez le PR pendant 1 min à l’aide d’un révélateur (Table des matériaux) et rincez la plaquette en l’immergeant dans de l’eau désionisée (DI) 2x. Séchez complètement la plaquette à motif PR en soufflant du gaz N₂ sur la surface de la plaquette.
      REMARQUE: Des précautions extrêmes doivent être prises lors du soufflage du gaz N₂ sur la plaquette Si car la plaquette est très mince et fragile. Ne soufflez pas le gaz N₂ à haute pression dans une direction perpendiculaire à la plaquette, car cela pourrait provoquer la rupture de la plaquette.
3. Motif le Si_xN_y.
   1. Gravez le Si_xN_y exposé selon le modèle du PR à l’aide d’un graveur d’ions réactifs (RIE) construit en laboratoire, avec 3 sccm d’hexafluorure de soufre (SF₆) de gaz à une puissance de radiofréquence (RF) de 50 W. Le taux de gravure avec ces paramètres est d’environ 6 Å / s. Réglez le temps de gravure en fonction de l’épaisseur de la couche Si_xN_y déposée.
      REMARQUE: Le taux de gravure peut varier et nécessiter une optimisation en laboratoire en fonction des spécifications de l’équipement RIE utilisé.
   2. Éliminez le PR en immergeant la plaquette à motifs Si_xN_y dans de l’acétone à température ambiante pendant 30 min, puis en rinçant la plaquette en l’immergeant dans de l’eau DI 2x. Sécher complètement la plaquette en soufflant du gaz_N2 sur la surface de la plaquette.
      REMARQUE: Des précautions extrêmes doivent être prises lors de l’immersion ou du retrait de la plaquette des solutions, car la plaquette peut être fracturée par la tension superficielle de la solution. Ne pas immerger ou retirer la plaquette parallèlement à la surface de la solution. Utilisez des pinces à épiler de précision avec des embouts en fibre de carbone. Ne saisissez pas fortement la plaquette avec la pince à épiler; soulevez un côté de la plaquette jusqu’à ce que la plaquette s’incline à un angle, où elle peut être retirée de la solution. La plaquette peut se fracturer lorsqu’elle se plie en raison de la prise ferme pendant le levage.
4. Graver le Si.
   1. Préparer une solution d’hydroxyde de potassium (KOH) de 1,5 M en dissolvant la poudre de KOH dans de l’eau DI à 80 °C.
   2. Immerger la plaquette à motifs Si_xN_y dans une solution KOH pour graver le Si exposé. Laissez la plaquette dans la solution en remuant jusqu’à ce que les fenêtres Si_xN_y autoportantes puissent être observées du côté opposé du Si_xN_y à motifs.
      REMARQUE: Le temps de gravure humide peut varier en fonction de l’épaisseur du Si; pour une plaquette de 100 μm d’épaisseur, la gravure humide prend normalement plusieurs heures. Ne réglez pas la vitesse d’agitation trop élevée pendant la gravure Si car les fenêtres Si_xN_y autoportantes sont très minces et peuvent être fracturées par l’écoulement du fluide. Dans cette expérience, la vitesse d’agitation a été réglée à 250 tr / min.
   3. Nettoyez la plaquette gravée en la trempant plusieurs fois dans un bain-marie DI pour éliminer les résidus de gravure. Sécher la plaquette à l’air.
      REMARQUE: Des précautions extrêmes doivent être prises lors de l’immersion ou du retrait de la plaquette à motifs Si des solutions, car les fenêtres autoportantes Si_xN_y sont très minces et fragiles et peuvent être fracturées par la tension superficielle de la solution. La plaquette doit être immergée ou retirée à un angle tel que le bord de la plaquette entre et sorte d’abord dans la solution.
5. Éliminez les résidus de gravure KOH.
   1. Appuyez légèrement sur les limites du réseau de puces à l’aide d’une pince à épiler pour obtenir un réseau de puces qui seront micro-modelées (Figure 1B).
   2. Préparer 1,5 M de solution de KOH à 80 °C en remuant.
   3. Immergez le réseau de puces dans la solution KOH pendant 30 s et rincez-le en le trempant dans de l’eau DI 2x. Séchez complètement les copeaux en soufflant du gaz N₂ .
      REMARQUE: Des précautions extrêmes doivent être prises lors de la trempation des copeaux dans des solutions et de leur séchage avec du gaz N₂ , car les fenêtres autoportantes Si_xN_y sont très minces et fragiles. Pendant que la puce est immergée dans la solution KOH, l’agitation doit être arrêtée. Les copeaux doivent être trempés avec leurs bords d’abord dans la direction perpendiculaire à la solution et soufflés avec du gaz_N2 dans la direction parallèle.
   4. Sécher complètement le réseau de puces dans l’air pendant au moins 1 h.
6. Modélisez le PR.
   1. Préparez une plaquette de Si vierge de 525 μm comme support solide. Enduire la plaquette Si avec HMDS et PR positif, comme décrit ci-dessus, mais attacher le réseau de puces (avec la fenêtre Si_xN_y autoportante vers le haut) sur la plaquette Si avant de cuire la PR. Le PR agit comme un adhésif entre la plaquette et le réseau de puces. Cuire la plaquette De Si fixée avec le réseau de puces à 100 °C pendant 90 s sur une plaque chauffante.
   2. Spin coat le jeu de puces avec HMDS et PR positif, comme décrit ci-dessus.
   3. Exposez le jeu de puces avec de la lumière ultraviolette (longueur d’onde de 365 nm; intensité^{de 20} mW/cm2) pendant 5 s à travers un masque de chrome (Figure 2E,F) à l’aide d’un aligneur.
   4. Développez le PR à l’aide d’un révélateur pendant 15 s, rincez le jeu de copeaux en le trempant dans de l’eau DI 2x et séchez complètement le jeu de copeaux à motif PR en soufflant du gaz N₂ .
7. Préparez le micro-motif Si_xN_y.
   1. Etch Si_xN_y suivant le modèle PR à l’aide d’un RIE construit en laboratoire, avec 3 sccm SF₆ gaz à une puissance RF de 50 W. Contrôlez le temps de gravure en fonction de l’épaisseur de la couche Si_xN_y .
8. Éliminez le PR.
   1. Éliminez le PR en immergeant le jeu de copeaux à motifs dans une solution de 1-méthyl-2-pyrrolidinone (NMP) à 60 °C et en le laissant toute la nuit. Rincez le jeu de copeaux en le trempant dans de l’eau DI 2x, et séchez complètement le jeu de copeaux à motifs en soufflant du gaz N₂ .
   2. Éliminez les résidus PR avec un procédé plasma O₂ utilisant 100 sccm O₂ gaz à une puissance RF de 150 W pendant 1 min avec le RIE construit en laboratoire.
9. Rincez la puce à micro-motifs.
   1. Préparer une solution de KOH de 1,5 M à 80 °C.
   2. Immergez les puces à micro-motifs dans une solution KOH pendant 30 s pour éliminer complètement les résidus PR et rincez les puces en les immergeant dans de l’eau DI 2x. Séchez complètement les copeaux en soufflant du gaz N₂ .
   3. Sécher complètement les copeaux à l’air pendant au moins 1 h.
10. Transférer l’oxyde de graphène (GO) par la méthode de coulée goutte à goutte.
    1. Diluer la solution de GO (2 mg/mL) à 0,2 mg/L avec de l’eau DI et du sonicate pendant 10 min pour briser les agrégats de feuilles de GO. Centrifuger la solution de GO diluée à 300 x g pendant 30 s.
    2. Déchargez le côté gravé en Si de la puce à micro-motifs pour rendre la surface de la puce avec une charge positive à l’aide d’un déchargeur luminescent (Table des matériaux) à 15 mA pendant 1 min.
    3. Déposer 3 μL de la solution GO sur le côté déchargé de lueur de la puce à micro-motifs et laisser la goutte sur la puce pendant 1 min. Après 1 min, épongez l’excès de solution GO sur la puce avec du papier filtre.
    4. Lavez la puce transférée go avec des gouttelettes d’eau DI préparées sur un film de paraffine et épongez l’eau DI sur la puce avec du papier filtre. Répétez cette procédure 2x sur le côté transféré GO et 1x sur le côté opposé. Séchez la puce transférée go à température ambiante pendant la nuit.
    5. Lavez la puce à micro-motifs avec des fenêtres GO en l’immergeant dans l’eau DI et séchez la puce avec du gaz N₂ .

2. Imagerie cryo-EM

1. Préparez le cryo-échantillon.
   1. Préparez le cryo-échantillon à l’aide d’une machine de cryo-plongée mécanique (Table des matériaux), qui contrôle la température, l’humidité, le temps d’effacement et la force. Après avoir chargé le tampon sur les buvards, assurez-vous que l’humidité et la température dans la chambre sont maintenues à 100% et 15 ° C, respectivement.
   2. Prenez la puce à micro-motifs avec une cryo-pince typique et chargez la pince à épiler sur la machine à cryo-plongeage. Pipet 3 μL de solution d’échantillon sur la puce à micro-motifs du côté à motif de trou, avec des fenêtres GO sur le fond. Contrôlez le temps de transfert et la force en fonction de la solution d’échantillon.
      NOTE: Ici, des échantillons biologiques, à savoir le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1), la ferritine, le protéasome 26S, le groEL, les particules de protéine d’apoferritine et les protéines de filament tau ont été utilisés pour l’imagerie cryo-EM. En outre, divers types de matériaux inorganiques, tels que les nanoparticules Fe₂O₃ (NP), les nanoparticules Au, les nanotiges Au et les nanoparticules de silice, ont été utilisés pour l’imagerie cryo-EM. Le temps et la force de transfert souhaités ont été réglés sur le piston cryogénique pour différents types d’échantillons.
   3. Après le processus de buvardage, geler immédiatement la puce chargée de l’échantillon dans de l’éthane liquide. Transférez la puce dans la boîte de grille dans de l’azote liquide (LN₂) et stockez-la dans LN₂ avant l’imagerie cryo-EM.
2. Effectuer une imagerie cryo-EM.
   1. Chargez le cryo-échantillon sur un support cryo-EM avec la température maintenue à -180 °C.
   2. Chargez le support cryo-EM dans un TEM et observez les échantillons avec le mode système de dose minimale (MDS).

Résultats

Une puce à micro-motifs avec des fenêtres GO a été fabriquée par fabrication MEMS et transfert de nanofeuilles GO 2D. Les puces pour le micro-modelage ont été produites en série, avec environ 500 puces produites à partir d’une plaquette de 4 (Figure 1B et Figure 2A,B). Les conceptions des puces à micro-motifs peuvent être manipulées à l’aide de différents modèles du masque au chrome (Figure 2) au ...

Discussion

Les procédés de microfabrication pour la production de puces à micro-motifs avec des fenêtres GO sont présentés ici. La puce fabriquée à micro-motifs est conçue pour réguler l’épaisseur de la couche de glace vitrée en contrôlant la profondeur du micro-trou avec des fenêtres GO en fonction de la taille du matériau à analyser. Une puce à micro-motifs avec des fenêtres GO a été fabriquée à l’aide d’une série de techniques MEMS et d’une méthode de transfert de nanofeuilles 2D (

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP)	Sigma Aldrich, USA	443778
Acetone
AFM	Park Systems, South Korea	NX-10
Aligner	Midas System, South Korea	MDA-600S
AZ 300 MIF developer	AZ Electronic Materials USA Corp., USA	184411
Cryo-EM holder	Gatan, USA	626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine	Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA	Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM)	FEI Company, USA	Helios NanoLab 650
Glow discharger	Ted Pella Inc., USA	PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution	Sigma Aldrich, USA	763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%	Alfa Aesar, USA	10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD)	Centrotherm, Germany	LPCVD E1200
maP1205 positive PR	Micro resist technology, Germany	A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake	DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea	6597-4400
Raman Spectrometer	NOST, South Korea	Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE)	Scientific Engineering, South Korea	Lab-built
SEM	Carl Zeiss, Germany	SUPRA 55VP
Si wafer	JP COMMERCE, South Korea		4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater	Dong Ah Trade Corp., South Korea	ACE-200
TEM	JEOL, Japan	JEM-2100F