Fabricação de chip micro-padronizado com espessura controlada para microscopia eletrônica criogênica de alta produtividade

Resumo

Um chip micro-padronizado recém-desenvolvido com janelas de óxido de grafeno é fabricado aplicando técnicas de sistema microeletromecânico, permitindo imagens eficientes e de microscopia criogênica de elétrons de vários biomoléculas e nanomateriais.

Resumo

Uma grande limitação para a análise eficiente e de estrutura de alto rendimento de biomoléculas usando microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) é a dificuldade de preparar amostras crio-EM com espessura de gelo controlada na nanoescala. O chip à base de silício (Si), que tem uma matriz regular de micro-buracos com janela de óxido de grafeno (GO) padronizado em um filme de nitreto de silício controlado pela espessura (Si_xN_y), foi desenvolvido aplicando técnicas de sistema microeletrocrânico (MEMS). Fotolitografia UV, deposição de vapor químico, gravura molhada e seca do filme fino e lançamento de materiais de nanofolha 2D foram usados para a produção em massa dos chips micro-padronizados com janelas GO. A profundidade dos micro-buracos é regulada para controlar a espessura do gelo sob demanda, dependendo do tamanho do espécime para análise crio-EM. A afinidade favorável do GO em relação às biomoléculas concentra as biomoléculas de interesse dentro do microrifício durante a preparação da amostra crio-EM. O chip micro-padronizado com janelas GO permite imagens crio-EM de alto rendimento de várias moléculas biológicas, bem como nanomateriais inorgânicos.

Introdução

A microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) foi desenvolvida para resolver a estrutura tridimensional (3D) de proteínas em seu estado natal 1,2,3,4. A técnica envolve a fixação de proteínas em uma camada fina (10-100 nm) de gelo vítreo e a aquisição de imagens de projeção de proteínas orientadas aleatoriamente usando um microscópio eletrônico de transmissão (TEM), com a amostra mantida à temperatura de nitrogênio líquido. Milhares a milhões de imagens de projeção são adquiridas e usadas para reconstruir uma estrutura 3D da proteína por algoritmos computacionais ^5,6. Para uma análise bem-sucedida com crio-EM, a preparação crio-amostra foi automatizada por meio do congelamento do equipamento que controla as condições de mancha, umidade e temperatura. A solução amostral é carregada em uma grade TEM com uma membrana de carbono furada, sucessivamente borrada para remover a solução em excesso, e, em seguida, mergulha-congelada com etano líquido para produzir gelo fino e vítreo ^1,5,6. Com os avanços da crio-EM e a automação da preparação da amostra⁷, a crio-EM tem sido cada vez mais utilizada para resolver a estrutura de proteínas, incluindo proteínas envelope para vírus e proteínas do canal de íons na membrana celular ^8,9,10. A estrutura das proteínas envelope de partículas virais patogênicas é importante para a compreensão da patologia da infecção viral, bem como para o desenvolvimento do sistema de diagnóstico e vacinas, por exemplo, SARS-CoV-2¹¹, que causou a pandemia COVID-19. Além disso, técnicas crio-EM foram recentemente aplicadas às ciências materiais, como para materiais sensíveis ao feixe de imagem utilizados na bateria ^12,13,14 e sistemas catalíticos ^14,15 e análise da estrutura de materiais inorgânicos em estado de solução¹⁶.

Apesar dos desenvolvimentos perceptíveis em crio-EM e técnicas relevantes, existem limitações na preparação da criom amostra, dificultando a análise da estrutura 3D de alto rendimento. Preparar um filme de gelo vítreo com espessura ideal é especialmente importante para a obtenção da estrutura 3D de materiais biológicos com resolução atômica. O gelo deve ser fino o suficiente para minimizar o ruído de fundo de elétrons espalhados pelo gelo e proibir sobreposições de biomoléculas ao longo do caminho^do feixe de elétrons ^1,17. No entanto, se o gelo é muito fino, pode fazer com que moléculas de proteínas se alinhem em orientações preferenciais ou desnaturais 18,19,20. Portanto, a espessura do gelo vítreo deve ser otimizada dependendo do tamanho do material de interesse. Além disso, um esforço extensivo é normalmente necessário para a preparação da amostra e a triagem manual da integridade do gelo e da proteína nas grades TEM preparadas. Esse processo é extremamente demorado, o que dificulta sua eficiência para análise de estrutura 3D de alto rendimento. Portanto, melhorias na confiabilidade e reprodutibilidade da preparação da amostra crio-EM aumentariam a utilização da crio-EM na biologia estrutural e na descoberta de medicamentos comerciais, bem como na ciência material.

Aqui, introduzimos processos de microfabização para a fabricação de um chip micro-padronizado com janelas de óxido de grafeno (GO) projetados para crio-EM de alta produtividade com espessura de gelo controlada²¹. O chip micro-padronizado foi fabricado usando técnicas de sistema microeletromecânico (MEMS), que podem manipular a estrutura e as dimensões do chip dependendo dos propósitos de imagem. O chip micro-padronizado com janelas GO tem uma estrutura de microwell que pode ser preenchida com a solução de amostra, e a profundidade da microwell pode ser regulada para controlar a espessura do gelo vítreo. A forte afinidade do GO com as biomoléculas aumenta a concentração de biomoléculas para visualização, melhorando a eficiência da análise da estrutura. Além disso, o chip micro-padronizado é composto por um quadro Si, que proporciona alta estabilidade mecânica para a grade¹⁹, tornando-o ideal para manusear o chip durante os procedimentos de preparação da amostra e imagens crio-EM. Portanto, um chip micro-padronizado com janelas GO fabricadas por técnicas MEMS fornece confiabilidade e reprodutibilidade da preparação da amostra crio-EM, que pode permitir uma análise eficiente e de estrutura de alto rendimento com base no crio-EM.

Protocolo

1. Fabricação de chip micro-padronizado com janelas GO (Figura 1)

1. Deposite o nitreto de silício.
   1. Deposite nitreto de silício de baixo estresse (Si_xN_y) em ambos os lados do wafer Si (4 polegadas de diâmetro e 100 μm de espessura) usando deposição de vapor químico de baixa pressão (LPCVD) a 830 °C e uma pressão de 150 mTorr, sob um fluxo de 170 sccm diclorosilane (SiH₂Cl₂, DCS) e amônia de 38 sccm (NH₃).
   2. Usando uma taxa de deposição de ~30 Å/min, controle a espessura si_xN_y para estar dentro de 25-100 nm variando o tempo de deposição.
      NOTA: Deve-se tomar muito cuidado ao manusear o wafer Si porque o wafer é muito fino e frágil. Tome cuidado para não dobrar o wafer durante o manuseio ou carregamento no equipamento.
2. Padrone o fotoresist.
   1. Aplique uma solução de hexametiethyldisilazane (HMDS) no wafer Si_xN_y-depositado si com volume suficiente para cobrir toda a superfície do wafer, gire casaco com um revestr de spin a 3.000 rpm por 30 s, e asse a 95°C por 30 s em uma placa quente para tornar a superfície hidrofóbica da superfície do wafer e, assim, garantir um bom desempenho de revestimento com fotoistres (PR).
   2. Aplique RP (Tabela de Materiais) positiva com volume suficiente para cobrir toda a superfície do wafer, gire o casaco a 3.000 rpm por 30 s e asse a 100 °C por 90 s em uma placa quente. Pr revestido de spin tem uma espessura de 500 nm.
   3. Exponha o wafer revestido de RP com luz ultravioleta (comprimento de onda de 365 nm e intensidade de²⁰ mW/cm 2) por 5 s através de uma máscara de cromo (Figura 2A-D) usando um alinhador.
   4. Desenvolva o PR por 1 min usando um desenvolvedor (Tabela de Materiais) e enxágue o wafer imergindo-o em água deionizada (DI) 2x. Seque totalmente o wafer com padrão pr soprando gás N₂ na superfície do wafer.
      NOTA: Deve-se tomar cuidado ao soprar gás N₂ no wafer Si porque o wafer é muito fino e frágil. Não sopre gás N₂ com alta pressão em direção perpendicular ao wafer, pois isso pode causar a fratura do wafer.
3. Padre o Si_xN_y.
   1. Etch o Si_xN_y exposto seguindo a padronização do RP usando um íon reativo construído em laboratório etc(RIE), com 3 sccm de hexafluoreto de enxofre (SF₆) a um poder de radiofrequência (RF) de 50 W. A taxa de gravação com essas configurações é de ~6 Å/s. Ajuste o tempo de gravação dependendo da espessura da camada Si_xN_y depositada.
      NOTA: A taxa de gravação pode variar e precisa de otimização em laboratório, dependendo das especificações do equipamento RIE utilizado.
   2. Elimine o RP imergindo o wafer padrão Si_xN_y em acetona à temperatura ambiente por 30 minutos, seguido por enxaguar o wafer imergindo-o em água DI 2x. Seque totalmente o wafer soprando gás N₂ na superfície do wafer.
      NOTA: Devem ser tomados extremos cuidados ao mergulhar ou retirar o wafer das soluções porque o wafer pode ser fraturado pela tensão superficial da solução. Não mergulhe ou tire o wafer paralelamente à superfície da solução. Use pinças de manuseio de wafer de precisão com pontas de fibra de carbono. Não pegue fortemente o wafer com a pinça; levantar um lado do wafer até que o wafer se incline para um ângulo, onde ele pode ser retirado da solução. O wafer pode fraturar quando se curva devido à aderência firme durante o levantamento.
4. Etch the Si.
   1. Prepare uma solução de hidróxido de potássio de 1,5 M (KOH) dissolvendo o pó KOH em água DI a 80 °C.
   2. Mergulhe o wafer padrão Si_xN_y na solução KOH para gravar o Si. Deixe o wafer na solução com agitação até que as janelas Si_xN_y de pé livre possam ser observadas no lado oposto do padrão Si_xN_y.
      NOTA: O tempo de gravação molhada pode diferir dependendo da espessura do Si; para um wafer de 100 μm de espessura, a gravura molhada normalmente leva várias horas. Não defina a velocidade de agitação muito alta durante a gravação de Si porque as janelas si_xn_y de pé livre são muito finas e podem ser fraturadas pelo fluxo do fluido. Neste experimento, a taxa de agitação foi definida para 250 rpm.
   3. Limpe o wafer gravado mergulhando-o várias vezes em um banho d'água DI para eliminar resíduos de gravura. Seque o wafer no ar.
      NOTA: Devem ser tomados cuidados extremos ao mergulhar ou tirar o wafer padronizado Si das soluções porque as janelas si_xn_y de pé livre são muito finas e frágeis e podem ser fraturadas pela tensão superficial da solução. O wafer deve ser imerso ou retirado em um ângulo, de tal forma que a borda do wafer entre e saia da solução primeiro.
5. Elimine os resíduos de gravação KOH.
   1. Pressione levemente os limites da matriz de chips com uma pinça para obter uma matriz de chips que serão micro-padronizados (Figura 1B).
   2. Prepare a solução KOH de 1,5 M a 80 °C com agitação.
   3. Mergulhe a matriz de chips na solução KOH para 30 s e enxágue-a mergulhando-a em água DI 2x. Seque totalmente os chips soprando gás N₂ .
      NOTA: Deve-se tomar muito cuidado ao mergulhar os chips em soluções e secá-los com gás N₂ porque as janelas de si_xn_y autônomos são muito finas e frágeis. Enquanto o chip está imerso na solução KOH, a agitação deve ser interrompida. Os chips devem ser mergulhados com suas bordas primeiro na direção perpendicular à solução e soprados com gás N₂ na direção paralela.
   4. Seque totalmente a matriz do chip no ar por pelo menos 1 h.
6. Padrone o RP.
   1. Prepare um wafer si de 525 μm em branco como suporte sólido. Gire o wafer Si com HMDS e RP positivo, como descrito acima, mas conecte a matriz de chip (com o lado da janela si_xn_y para cima) no wafer Si antes de assar o RP. O PR age como um adesivo entre o wafer e a matriz de chips. Asse o wafer Si anexado com a matriz de chip a 100 °C por 90 s em uma placa quente.
   2. Gire o conjunto de chips com HMDS e RP positivo, conforme descrito acima.
   3. Exponha o conjunto de chip com luz ultravioleta (comprimento de onda de 365 nm; intensidade de 20 mW/cm²) para 5 s através de uma máscara de cromo (Figura 2E,F) usando um alinhador.
   4. Desenvolva o RP usando um desenvolvedor para 15 s, enxágue o conjunto de chips mergulhando-o em água DI 2x, e seque totalmente o chip padrão pr definido soprando gás N₂ .
7. Prepare o micro-padronizado Si_xN_y.
   1. Etch Si_xN_y seguindo a padronização de RP usando um RIE construído em laboratório, com 3 sccm de gás SF₆ em potência RF de 50 W. Controle o tempo de gravação dependendo da espessura da camada Si_xN_y .
8. Elimine o RP.
   1. Elimine o RP imergindo o conjunto de chip padronizado na solução 1-metil-2-pyrrolidina (NMP) a 60 °C e deixando-o durante a noite. Enxágüe o conjunto de chips mergulhando-o em água DI 2x, e seque totalmente o chip padronizado, soprando gás N₂ .
   2. Elimine os resíduos de RP com um processo de plasma O₂ usando 100 sccm O₂ gás em rf potência de 150 W por 1 min com o RIE construído em laboratório.
9. Enxágüe o chip micro-padronizado.
   1. Prepare a solução KOH de 1,5 M a 80 °C.
   2. Mergulhe os chips micro-padronizados na solução KOH por 30 s para eliminar totalmente os resíduos de RP e enxaguar os chips imergindo-os em água DI 2x. Seque totalmente os chips soprando gás N₂ .
   3. Seque totalmente as lascas no ar por pelo menos 1h.
10. Transfira óxido de grafeno (GO) pelo método de fundição de gotas.
    1. Solução DILuir GO (2 mg/mL) a 0,2 mg/L com água DI e sonicato por 10 minutos para quebrar agregados de folhas GO. Centrifugar a solução GO diluída a 300 x g para 30 s.
    2. Descarregue o lado gravado do chip micro-padronizado para tornar a superfície do chip com carga positiva usando um descarga de brilho (Tabela de Materiais) a 15 mA por 1 min.
    3. Solte 3 μL da solução GO no lado descarado do chip micro-padronizado e deixe a gota no chip por 1 min. Depois de 1 min, limpe a solução GO em excesso no chip com papel filtro.
    4. Lave o chip transferido para GO com gotículas dI preparadas em filme de parafina e limpe a água DI no chip com papel filtro. Repita este procedimento 2x no lado transferido go e 1x no lado oposto. Seque o chip transferido por GO à temperatura ambiente durante a noite.
    5. Lave o chip micro-padronizado com janelas GO, imergindo-o na água DI e seque o chip com gás N₂ .

2. Imagem Cryo-EM

1. Prepare a crio-amostra.
   1. Prepare a crio-amostra usando uma máquina mecânica de mergulho crio-mergulhador (Tabela de Materiais), que controla a temperatura, a umidade, o tempo de mancha e a força. Depois de carregar a almofada de manchas nas manchas, certifique-se de que a umidade e a temperatura na câmara sejam mantidas a 100% e 15 °C, respectivamente.
   2. Pegue o chip micro-padronizado com uma pinça crio-doce típica e carregue a pinça para a máquina de mergulho crio-. Pipet 3 μL de solução de amostra para o chip micro-padronizado no lado padrão do orifício, com janelas GO na parte inferior. Controle o tempo e a força de manchas dependendo da solução amostral.
      NOTA: Aqui, foram utilizados espécimes biológicos, ou seja, vírus da imunodeficiência humana (HIV-1), ferritina, proteasome 26S, groEL, partículas de proteína de apoferritina e proteínas de filamento foram usadas para imagens crio-EM. Além disso, diversos tipos de materiais inorgânicos, como nanopartículas Fe₂O₃ (NP), nanopartículas Au, nanorods Au e nanopartículas de sílica, foram utilizados para imagens crio-EM. O tempo e a força desejados foram colocados no êmbolo criogeno para diferentes tipos de amostras.
   3. Após o processo de desinchar, congele o chip carregado com amostras imediatamente em etano líquido. Transfira o chip para a caixa de grade em nitrogênio líquido (LN₂) e armazene-o na LN₂ antes da imagem crio-EM.
2. Realize imagens crio-EM.
   1. Carregue a crio-amostra em um suporte crio-EM com a temperatura mantida a -180 °C.
   2. Carregue o suporte crio-EM em um TEM e observe as amostras com o modo de sistema de dose mínima (MDS).

Resultados

Um chip micro-padronizado com janelas GO foi fabricado pela fabricação mems e transferência de nanofolha 2D GO. Os chips para micro-padronização foram produzidos em massa, com cerca de 500 chips produzidos a partir de um wafer de 4 polegadas (Figura 1B e Figura 2A,B). Os desenhos dos chips micro-padronizados podem ser manipulados usando diferentes desenhos da máscara de cromo (Figura 2) durante o procedimento ...

Discussão

Os processos de microfabização para a produção de chips micro-padronizados com janelas GO são introduzidos aqui. O chip micro-padronizado fabricado foi projetado para regular a espessura da camada de gelo vítreo, controlando a profundidade do micro-buraco com janelas GO, dependendo do tamanho do material a ser analisado. Um chip micro-padronizado com janelas GO foi fabricado usando uma série de técnicas MEMS e um método de transferência de nanofolha 2D (Figura 1). A maior vantagem ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP)	Sigma Aldrich, USA	443778
Acetone
AFM	Park Systems, South Korea	NX-10
Aligner	Midas System, South Korea	MDA-600S
AZ 300 MIF developer	AZ Electronic Materials USA Corp., USA	184411
Cryo-EM holder	Gatan, USA	626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine	Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA	Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM)	FEI Company, USA	Helios NanoLab 650
Glow discharger	Ted Pella Inc., USA	PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution	Sigma Aldrich, USA	763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%	Alfa Aesar, USA	10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD)	Centrotherm, Germany	LPCVD E1200
maP1205 positive PR	Micro resist technology, Germany	A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake	DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea	6597-4400
Raman Spectrometer	NOST, South Korea	Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE)	Scientific Engineering, South Korea	Lab-built
SEM	Carl Zeiss, Germany	SUPRA 55VP
Si wafer	JP COMMERCE, South Korea		4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater	Dong Ah Trade Corp., South Korea	ACE-200
TEM	JEOL, Japan	JEM-2100F