JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يظهر هنا بروتوكول لهندسة نظام شخصي للأعضاء على رقاقة يلخص بنية ووظيفة حاجز الترشيح الكبيبي للكلى من خلال دمج الخلايا البطانية الظهارية والوعائية المتطابقة وراثيا المتمايزة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. يمكن لهذا النظام المهندس بيولوجيا تطوير الطب الدقيق للكلى والتطبيقات ذات الصلة.

Abstract

يؤثر مرض الكلى المزمن (CKD) على 15٪ من السكان البالغين في الولايات المتحدة ، ولكن إنشاء العلاجات المستهدفة كان محدودا بسبب عدم وجود نماذج وظيفية يمكنها التنبؤ بدقة بالاستجابات البيولوجية البشرية والسمية الكلوية. يمكن أن تساعد التطورات في الطب الدقيق للكلى في التغلب على هذه القيود. ومع ذلك ، فإن النماذج المختبرية التي تم إنشاؤها سابقا لكبيبات الكلى البشرية - الموقع الرئيسي لترشيح الدم والهدف الرئيسي للعديد من الأمراض وسمية الأدوية - عادة ما تستخدم مجموعات خلايا غير متجانسة ذات خصائص وظيفية محدودة وخلفيات وراثية لا مثيل لها. هذه الخصائص تحد بشكل كبير من تطبيقها على نمذجة الأمراض الخاصة بالمريض والاكتشاف العلاجي.

تقدم هذه الورقة بروتوكولا يدمج الظهارة الكبيبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPS) المستحثة بالإنسان (podocytes) والبطانة الوعائية من مريض واحد لهندسة رقاقة كبيبات الكلى المتحولة في الموائع الدقيقة والأوعية الدموية. تتكون رقاقة الكبيبات الناتجة من طبقات الخلايا البطانية والظهارية المشتقة من الخلايا الجذعية التي تعبر عن علامات خاصة بالسلالة ، وتنتج بروتينات الغشاء السفلي ، وتشكل واجهة نسيج الأنسجة تشبه حاجز الترشيح الكبيبي للكلية. تقوم رقاقة الكبيبات الهندسية بتصفية الجزيئات بشكل انتقائي وتلخص إصابة الكلى الناجمة عن الأدوية. القدرة على إعادة تشكيل هيكل ووظيفة كبيبات الكلى باستخدام أنواع الخلايا متساوية المنشأ يخلق الفرصة لنمذجة أمراض الكلى مع خصوصية المريض وتعزيز فائدة الأعضاء على رقائق للطب الدقيق الكلى والتطبيقات ذات الصلة.

Introduction

أجهزة Organ-on-a-chip هي نماذج ديناميكية 3D في المختبر تستخدم التحفيز الجزيئي والميكانيكي ، بالإضافة إلى الأوعية الدموية ، لتشكيل واجهات الأنسجة والأنسجة التي تنمذج بنية ووظيفة أعضاء معينة. تتكون الأجهزة التي تم إنشاؤها سابقا على رقاقة والتي تهدف إلى تلخيص كبيبات الكلى (رقائق الكبيبات) من خطوط الخلايا الحيوانية1 أو خطوط الخلايا الأولية والخالدة البشرية من مصادر غير متجانسة 2,3. يقدم استخدام مصادر الخلايا غير المتجانسة وراثيا اختلافات تحد بشكل كبير من دراسات الاستجابات الخاصة بالمريض وعلم الوراثة أو آليات المرض 4,5. تعتمد مواجهة هذا التحدي على توافر خطوط الخلايا متساوية المنشأ التي تنشأ من أفراد محددين لديهم ملامح جزيئية وجينية محفوظة لتوفير بيئة دقيقة أكثر دقة للهندسة في النماذج المختبرية 2،3،6. يمكن الآن توليد خطوط الخلايا المتساوية المنشأ من أصل بشري بسهولة بسبب التقدم في زراعة خلايا iPS البشرية. نظرا لأن خلايا iPS البشرية عادة ما تكون مصدرها غير الغازي ، ويمكن أن تجدد ذاتيا إلى أجل غير مسمى ، وتتمايز إلى أي نوع من الخلايا تقريبا ، فإنها تعمل كمصدر جذاب للخلايا لإنشاء نماذج في المختبر ، مثل رقاقة الكبيبات 7,8. حاجز الترشيح الكبيبي هو الموقع الرئيسي لترشيح الدم. يتم ترشيح الدم أولا من خلال بطانة الأوعية الدموية ، الغشاء السفلي الكبيبي ، وأخيرا من خلال ظهارة متخصصة تسمى podocytes. تساهم جميع المكونات الثلاثة لحاجز الترشيح في الترشيح الانتقائي للجزيئات. يظهر هنا بروتوكول لإنشاء جهاز عضو على رقاقة متصل بالبطانة الوعائية والظهارة الكبيبية من مصدر خلية iPS بشري واحد. في حين أن هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص لهندسة شريحة متساوية المنشأ والأوعية الدموية لتلخيص حاجز الترشيح الكبيبي ، فإنه يوفر أيضا مخططا لتطوير أنواع أخرى من الأعضاء الشخصية على الرقائق والمنصات متعددة الأعضاء مثل نظام "الجسم على رقاقة" متساوي المنشأ.

يبدأ البروتوكول الموصوف هنا بالتمايز المتباعد لخلايا iPS البشرية إلى سلالتين منفصلتين - خلايا الأديم المتوسط الجانبية والأديم المتوسط ، والتي يتم تمييزها لاحقا إلى بطانة وعائية وظهارة كبيبية ، على التوالي. لتوليد خلايا الأديم المتوسط الجانبية ، تم زرع خلايا iPS البشرية على ألواح مصفوفة الغشاء السفلي 1 المغلفة وزرعها لمدة 3 أيام (بدون تبادل الوسائط) في وسط N2B27 المكمل بمنشط Wnt ، CHIR 99021 ، ومحفز الأديم المتوسط القوي ، العظام المورفوجينية 4 (BMP4). تميزت خلايا الأديم المتوسط الجانبية الناتجة سابقا بالتعبير عن brachyury (T) ، و Homeobox الشبيه بالمزيج (MIXL) ، و eomesodermin (EOMES) 9. في وقت لاحق ، تم استزراع خلايا الأديم المتوسط الجانبية لمدة 4 أيام في وسط مكمل ب VEGF165 و Forskolin لحث الخلايا البطانية الوعائية التي تم فرزها بناء على تعبير VE-Cadherin و / أو PECAM-1 باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS). تم توسيع الخلايا البطانية الوعائية الناتجة (viEC) عن طريق زراعتها على مصفوفة الغشاء السفلي 3 قوارير مغلفة حتى تصبح جاهزة للبذر في جهاز الموائع الدقيقة.

لتوليد خلايا الأديم المتوسط ، تم زرع خلايا iPS البشرية على ألواح مصفوفة الغشاء السفلي 2-المغلفة وزرعت لمدة يومين في وسط يحتوي على Activin A و CHIR99021. تميزت خلايا الأديم المتوسط الناتجة بالتعبير عن HAND1 و goosecoid و brachury (T) كما هو موضح سابقا2،10،11. للحث على تمايز خلايا الأديم المتوسط (IM) ، تم استزراع خلايا الأديم المتوسط لمدة 14 يوما في وسط مكمل ب BMP-7 و CHIR99021. تعبر خلايا IM الناتجة عن ورم Wilm's Tumor 1 (WT1) ، والجين المربع المقترن 2 (PAX2) ، والبروتين المرتبط الغريب الذي تم تخطيه (OSR-1) 2,10,11.

تم تصميم رقاقة متعددة الميثيل سيلوكسان (PDMS) ثنائية القناة قائمة على الموائع الدقيقة لتلخيص بنية حاجز الترشيح الكبيبي في المختبر. القناة البولية هي 1000 ميكرومتر × 1000 ميكرومتر (عرض × ارتفاع) وبعد القناة الشعرية هو 1000 ميكرومتر × 200 ميكرومتر (عرض × ارتفاع). تم تسهيل دورات التمدد والاسترخاء الدورية من خلال الغرف المجوفة الموجودة على كل جانب من جوانب القنوات السائلة. تم زرع الخلايا على غشاء PDMS مرن (بسماكة 50 ميكرومتر) يفصل بين القنوات البولية والشعيرات الدموية. تم تجهيز الغشاء بمسام سداسية (قطرها 7 ميكرومتر ، على بعد 40 ميكرومتر) للمساعدة في تعزيز الإشارات بين الخلايا (الشكل 1A)2,12. قبل يومين من اكتمال تحريض IM ، تم طلاء رقائق الموائع الدقيقة بمصفوفة غشاء الطابق السفلي 2. تم زرع viECs في القناة الشعرية لرقاقة الموائع الدقيقة باستخدام وسيط الصيانة البطانية قبل 1 يوم من اكتمال تحريض IM ، وتم قلب الشريحة رأسا على عقب لتمكين التصاق الخلايا على الجانب القاعدي من غشاء PDMS المطلي ب ECM. في اليوم الذي تم فيه الانتهاء من تحريض IM ، تم زرع الخلايا في القناة البولية لرقاقة الموائع الدقيقة باستخدام وسط مكمل ب BMP7 و Activin A و CHIR99021 و VEGF165 وجميع حمض الريتينويك العابر للحث على تمايز الخلايا البودوسية داخل الشريحة. في اليوم التالي ، تم ملء خزانات الوسائط بوسط تحريض Podocyte ووسط الصيانة البطانية ، وتم تطبيق إجهاد ميكانيكي بنسبة 10٪ عند 0.4 هرتز وتدفق السوائل (60 ميكرولتر / ساعة) على الرقائق.

تم استزراع رقائق الموائع الدقيقة الخلوية لمدة 5 أيام إضافية باستخدام وسيط تحريض Podocyte (في القناة البولية) ووسط الصيانة البطانية (في القناة الوعائية). تم استزراع رقائق كبيبات الكلى الناتجة لمدة تصل إلى 7 أيام إضافية في وسائط الصيانة لكل من الخلايا الكبدية والخلايا البطانية. عبرت الخلايا البدوية المتباينة بشكل إيجابي عن البروتينات الخاصة بالسلالة ، بما في ذلك البودوسين والنيفرين13,14 ، في حين عبرت viECs بشكل إيجابي عن بروتينات تحديد النسب PECAM-1 و VE-Cadherin ، وكلها جزيئات أساسية للحفاظ على سلامة حاجز الترشيح الكبيبي15,16 . تم العثور على كل من podocytes و viECs لإفراز بروتين الغشاء السفلي الكبيبي الأكثر وفرة ، الكولاجين الرابع ، وهو أمر مهم أيضا لنضج الأنسجة ووظيفتها.

تم العثور على النظام المكون من ثلاثة مكونات لحاجز الترشيح - البطانة ، الغشاء السفلي ، والظهارة - في رقائق الكبيبات لتصفية الجزيئات بشكل انتقائي والاستجابة لعلاج دوائي كيميائي سام للكلى. أشارت نتائج العلاج الدوائي إلى أنه يمكن استخدام رقاقة الكبيبات لدراسات السمية الكلوية ونمذجة الأمراض. يوفر هذا البروتوكول المبدأ التوجيهي العام لهندسة رقاقة كبيبات الكلى الموائع الدقيقة الوظيفية من مشتقات خلايا iPS متساوية المنشأ. يمكن إجراء التحليلات النهائية للرقاقة الهندسية حسب رغبة الباحث. لمزيد من المعلومات حول استخدام رقاقة الكبيبات لنمذجة الإصابة الكبيبية الناجمة عن المخدرات ، راجع المنشورات السابقة 2,12.

Protocol

1. إعداد حلول مصفوفة الغشاء السفلي والركائز المطلية

  1. إذابة مصفوفة الغشاء السفلي 1 بين عشية وضحاها على الجليد عند 4 درجات مئوية. Aliquot وفقا لاقتراح الشركة المصنعة لنسبة التخفيف. باستخدام أنبوب مخروطي وماصة سعة 50 مل ، امزج جيدا كمية مناسبة من مصفوفة الغشاء السفلي 1 في 25 مل من DMEM / F12 البارد حتى تذوب تماما وتذوب.
    1. لإذابة أليكوت مجمد ، خذ ~ 200 ميكرولتر من 25 مل من DMEM / F12 البارد وانقله إلى أنبوب أليكوت المجمد. ماصة لأعلى ولأسفل حتى يتم إذابة المصفوفة تماما وإذابتها. انقل محتوى الأنبوب الكامل لمصفوفة الغشاء السفلي 1 إلى بقية DMEM / F12 البارد.
  2. ماصة 1 مل من مصفوفة غشاء الطابق السفلي 1 محلول في كل بئر من لوحة 6 آبار. لاستخدام الألواح المطلية في نفس اليوم ، احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    1. بدلا من ذلك ، يمكن لف الألواح المطلية بالبارافيلم وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. عندما تكون جاهزة لاستخدام اللوحة المخزنة ، احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. تمييع مصفوفة الغشاء السفلي 2 في 9 مل من الماء المقطر المعقم لتحقيق تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل. ماصة 700 ميكرولتر من محلول مصفوفة الغشاء السفلي 2 في كل بئر من لوحة 12 بئرا. لف مصفوفة الغشاء السفلي 2-المغلفة لوحات مع parafilm وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  4. أعد تشكيل مصفوفة الغشاء السفلي المجفف بالتجميد 3 لتحقيق تركيز نهائي قدره 1 ملغم / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS و Ca+2-و Mg+2-free) على النحو الذي اقترحته الشركة المصنعة. قم بتخفيف واحد 250 ميكرولتر أليكوت إلى تركيز نهائي قدره 25 ميكروغرام / مل في 9.75 مل من PBS (Ca+2 و Mg+2 مجانا). استخدم 6 مل من هذا المحلول لتغطية قارورة T75 واحدة (تركيز نهائي قدره 2 ميكروغرام / سم2). قم بتخزين القوارير المطلية بالمصفوفة على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.

2. زراعة خلايا iPS البشرية

ملاحظة: تم اختبار خط DU11 المستخدم في هذا البروتوكول ووجد أنه خال من تشوهات الميكوبلازما والنمط النووي.

  1. احتضان مصفوفة الغشاء السفلي 1-المغلفة لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
  2. اغسل كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار 3x ب 1 مل من DMEM / F12 الدافئ (37 درجة مئوية). أضف 2 مل من وسط زراعة خلايا iPS البشري (CCM) (الجدول التكميلي S1) إلى كل بئر من صفيحة ال 6 آبار. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية أثناء إعداد الخلايا للبذر كما هو موضح أدناه.
  3. اغسل كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار التي تحتوي على خلايا iPS بشرية مع 1 مل من DMEM / F12 الدافئة.
  4. شفط DMEM / F12. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لانفصال الخلايا الدافئة إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
  5. افحص بصريا كل بئر تحت المجهر بحثا عن الانفصال حول حواف مستعمرة الخلية. استنشق بعناية المخزن المؤقت لانفصال الخلية من الخلايا. اغسل كل بئر بلطف مع 1 مل من DMEM / F12 الدافئ.
  6. افحص الألواح تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا لم تنفصل تماما عن اللوحة أو تم شفطها عن طريق الخطأ.
  7. أضف 3 مل من iPS CCM البشري الدافئ إلى كل بئر من لوحة 6 آبار مع خلايا. باستخدام رافع الخلايا ، كشط المستعمرات بلطف. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، امزج تعليق الخلية بلطف في كل بئر لأعلى ولأسفل مرة واحدة.
  8. أخرج لوحة مصفوفة الغشاء السفلي الجديدة 1 المطلية من الحاضنة. نقل 0.5 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر من مصفوفة الغشاء السفلي الجديد 1-المغلفة لوحة. حرك اللوحة في حركة على شكل ثمانية لتوزيع الخلايا بالتساوي. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪.
  9. استنشق الوسط المستهلك واستبدله ب 3 مل من iPS CCM البشري كل يوم من الثقافة حتى تلتقي الخلايا بنسبة 70٪ (حوالي 4 أيام بعد المرور).

3. الأيام 0-16: تمايز iPSCs البشرية إلى خلايا الأديم المتوسط الوسيطة

  1. الأيام 0-2: تحريض الأديم المتوسط
    1. انقل مصفوفة الغشاء السفلي 2-المغلفة من 4 درجات مئوية إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة لتحقيق التوازن بعد التخزين.
    2. استنشاق الوسط المستهلك من كل بئر من صفيحة ال 6 آبار التي تحتوي على حوالي 70٪ من خلايا iPS البشرية المتقاربة. اغسل الخلايا بلطف 3x مع 1 مل من DMEM / F12 الدافئ.
    3. شفط DMEM / F12. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لانفصال الخلايا إلى كل بئر من صفيحة 6 آبار من خلايا iPS البشرية. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقائق.
    4. افحص بصريا كل بئر تحت المجهر بحثا عن الانفصال حول حواف مستعمرة الخلية. باستخدام رافع الخلايا ، كشط المستعمرات بلطف.
    5. انقل معلقات الخلايا من جميع آبار الصفيحة المكونة من 6 آبار إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل واستخدم P1000 للماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للحصول على تعليق أحادي الخلية لخلايا iPS.
    6. املأ تعليق الخلية في الأنبوب المخروطي إلى 14 مل باستخدام DMEM / F12. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم في درجة حرارة الغرفة.
    7. شفط السوبرناتانت. أعد تعليق حبيبات الخلايا في 14 مل من DMEM/F12 الدافئ. كرر الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم في درجة حرارة الغرفة.
    8. شفط السوبرناتانت. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط تحريض الأديم المتوسط (الجدول التكميلي S1). عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. تمييع في وسط تحريض الأديم المتوسط لتحقيق تركيز نهائي من 1 × 105 خلايا / مل.
    9. شفط الطلاء من مصفوفة غشاء الطابق السفلي 2-لوحة مغلفة. شطف كل بئر من مصفوفة الغشاء السفلي 2-المغلفة لوحة 2x مع 1 مل من DMEM / F12 الدافئة.
    10. ماصة بلطف تعليق الخلية لأعلى ولأسفل 2x. نقل 1 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر من مصفوفة الغشاء السفلي 2-المغلفة لوحة. حرك اللوحة برفق في حركة من ثمانية لتوزيع الخلايا بالتساوي.
    11. احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي (اليوم 1) ، قم بشفط الوسط المستنفد من كل بئر من لوحة البئر 12. استبدل ب 1 مل من وسط تحريض الأديم المتوسط الدافئ. تحضن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. الأيام 2-16: تحريض الأديم المتوسط
    1. شفط وسط تحريض الأديم المتوسط المستهلك. يستبدل ب 1 متر لتر من وسط تحريض الأديم المتوسط الدافئ (الجدول التكميلي S1). استنشق الوسط المستنفد واستبدله ب 1 مل من وسط تحريض الأديم المتوسط الدافئ كل يوم لمدة 14 يوما.

4. الأيام 0-15: تمايز وتوسيع iPSCs البشرية في الخلايا البطانية الوعائية

  1. اليوم 0: بذر خلايا iPS البشرية
    1. تحضير 15 مل من iPS CCM البشري باستخدام مثبط ROCK (الجدول التكميلي S1). يحفظ دافئا عند 37 درجة مئوية.
    2. احتضان مصفوفة غشاء قبو واحدة 1-لوحة مغلفة لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية. شفط مصفوفة الغشاء السفلي 1. اغسل 3x مع 1 مل من DMEM / F12 الدافئة.
    3. شفط DMEM / F12. أضف 2 مل من iPS CCM البشري مع مثبط ROCK إلى كل بئر من لوحة 6 آبار. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية أثناء إعداد الخلايا للبذر كما هو موضح أدناه.
    4. استنشاق الوسط المستهلك من كل بئر من صفيحة ال 6 آبار التي تحتوي على حوالي 70٪ من خلايا iPS البشرية المتقاربة. اغسل الخلايا بلطف 3x مع 1 مل من DMEM / F12 الدافئ.
    5. شفط DMEM / F12. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لانفصال الخلايا إلى كل بئر من صفيحة 6 آبار من خلايا iPS البشرية. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقائق لفصل الخلايا إلى خلايا واحدة.
      ملاحظة: نظرا للاختلافات المتأصلة بين خطوط خلايا iPS ، سيحتاج المستخدم إلى فحص الخلايا بصريا بعد 5 دقائق لتحديد وقت الحضانة الأمثل.
    6. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. اجعل تعليق الخلية يصل إلى 14 مل مع DMEM/F12 الدافئ لتحييد المخزن المؤقت للانفصال. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200× جم في درجة حرارة الغرفة.
    7. شفط بلطف supernatant. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من iPS CCM البشري باستخدام مثبط ROCK. احسب العدد الإجمالي للخلايا باستخدام مقياس الدم.
    8. زرع الخلايا بين 37,000 إلى 47,000 خلية / سم2 (355,200 إلى 451,200 خلية / بئر من لوحة 6 آبار). تحضن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: نظرا للاختلافات المتأصلة بين خطوط خلايا iPS ، سيحتاج المستخدم إلى تحديد كثافة البذر المثلى.
  2. الأيام 1-3: تحريض الأديم المتوسط الجانبي
    1. في اليوم التالي (اليوم 1) ، قم بشفط الوسط المستنفد من كل بئر من لوحة 6 آبار من خلايا iPS البشرية. استبدل كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار ب 5 مل من وسط تحريض الأديم المتوسط الجانبي (الجدول التكميلي S1). عند توسيع نطاق وعاء الاستزراع (على سبيل المثال ، القوارير) ، بشكل عام ، استبدل بحجم العمل في وعاء الاستزراع ب 3 أضعاف.
    2. لا تقم بتغيير هذا الوسط لمدة 3 أيام.
      ملاحظة: عادة ما يتغير لون وسط تحريض الأديم المتوسط الجانبي في الآبار من الأحمر إلى الأصفر حيث تستهلك الخلايا العناصر الغذائية. ومع ذلك ، فإن الوسط الغائم أو الوسط مع نمو البكتيريا ليس طبيعيا ويجب تطهيره والتخلص منه على هذا النحو.
  3. الأيام 4-6: تحريض الخلايا البطانية
    1. استنشاق الوسط المستنفد من كل بئر من لوحة 6 آبار. استبدل كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار ب 3 مل من وسط الحث البطاني الدافئ (الجدول التكميلي S1). احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    2. لمدة 2 أيام التالية (أيام 5 و 6) ، جمع الوسط المستنفد من جميع الآبار في أنبوب مخروطي 50 مل. تخزين الأنبوب المخروطي في 4 درجات مئوية. قم بتجديد الخلايا ب 3 مل من وسط الحث البطاني الدافئ. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية.
  4. اليوم 7: فرز الخلايا البطانية (viEC)
    1. أخرج مصفوفة الغشاء السفلي 3 قوارير واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    2. قم بإعداد 50 مل من المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS (الجدول التكميلي S1).
    3. ضع المخزن المؤقت لانفصال الخلايا ، والمخزن المؤقت MACS ، و CCM البطاني ، و PBS (Ca2 + و Mg2+ مجانا) على الجليد في غطاء زراعة الأنسجة.
    4. ضع المغناطيس على حامل MACS. ضع أنبوبين مخروطي سعة 50 مل وأنبوب مخروطي 15 مل في حامل أنبوب مخروطي.
    5. ضع حامل MACS (مع توصيل المغناطيس) وعمود LS واحد في غطاء محرك الأنسجة. قم بإعداد حامل الأنبوب المخروطي (مع أنابيب مخروطية بالداخل) على حامل MACS ، أسفل المغناطيس (الشكل التكميلي S1A).
    6. اجمع الوسط المستهلك من كل بئر من صفيحة البئر ال 6 في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل من الخطوة 4.3.2. اغسل كل بئر من الطبق المكون من 6 آبار باستخدام PBS (Ca 2+ و Mg2+ مجانا).
    7. شفط PBS. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لانفصال الخلايا. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقائق لفصل الخلايا بالكامل.
    8. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل. اجعل تعليق الخلية يصل إلى 15 مل مع CCM البطاني البارد. جهاز طرد مركزي في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    9. شفط السوبرناتانت. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من مخزن MACS البارد. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    10. أضف 10 مل من المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS إلى تعليق الخلية. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم في درجة حرارة الغرفة.
    11. شفط السوبرناتانت. أعد تعليق الخلايا في 80 ميكرولتر من مخزن MACS المؤقت لكل 10 ملايين خلية. أضف 20 ميكرولتر لكل 10 ملايين خلية من كاشف حجب FcR وميكروبيدات CD31 وميكروبيدات CD144. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.
    12. أثناء احتضان تعليق الخلية ، قم بالطرد المركزي للوسط الذي تم جمعه من الحث البطاني (الخطوة 4.3.2) عند 200 × جم لمدة 10 دقائق.
    13. جمع supernatant في مرشح فراغ 500 مل 0.22 ميكرومتر. تحضير الوسط المشروط البطاني (الجدول التكميلي S1). قم بتصفية الوسط تحت ظروف معقمة وحافظ على دفء الوسط عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: سيبدأ معدل تكاثر الخلايا البطانية في الانخفاض بعد المرور 3. لتحقيق النمو الأسي بعد المقطع 3 ، يمكن استكمال وسط الصيانة والصيانة البطاني بمثبط 10 ميكرومتر TGF-Beta (SB431542) بدءا من الممر 1.
    14. بعد 15 دقيقة من الحضانة في الخطوة 4.4.11، أضف 10 مل من المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS لكل 10 ملايين خلية (بحد أقصى 30 مل من المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS) إلى تعليق الخلية. جهاز طرد مركزي على ارتفاع 200 × غرام لمدة 5 دقائق.
    15. شفط السوبرناتانت. إعادة التعليق في 1 مل من المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS.
    16. خذ عمود LS واسحب المكبس من المحقنة. ضع المكبس مرة أخرى في الغلاف البلاستيكي. ضع العمود على المغناطيس.
    17. ضع أول أنبوب مخروطي سعة 50 مل تحت العمود. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS إلى العمود. جمع في أنبوب مخروطي 50 مل تحتها.
    18. دع السائل يتدفق من خلاله ، وإن لم يكن تماما لمنع العمود من التجفيف. عندما تبدأ قطرات السائل في التسرب ببطء ، أضف تعليق الخلية إلى العمود. جمع التدفق في نفس الأنبوب المخروطي 50 مل.
    19. عندما تبدأ قطرات السائل في التسرب ببطء ، ضع الأنبوب المخروطي التالي سعة 50 مل تحت العمود. أضف التدفق الأولي (الخطوة 4.4.18) إلى العمود. جمع في أنبوب مخروطي 50 مل تحتها.
    20. عندما تبدأ قطرات السائل في التسرب ببطء ، أضف 500 ميكرولتر من مخزن MACS المؤقت 3x لغسل العمود.
    21. قم بإزالة العمود من المغناطيس. ضع العمود على الأنبوب المخروطي 15 مل. أضف 1 مل من PBS البارد إلى العمود.
    22. لجمع الخلايا ، خذ المكبس من الغلاف البلاستيكي وادفعه بقوة إلى العمود.
    23. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. اجعل تعليق الخلية يصل إلى 5 مل باستخدام PBS. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم.
    24. بينما تخضع الخلايا للطرد المركزي ، اغسل مصفوفة الغشاء السفلي 3 قارورة مغلفة 3x مع 5 مل من PBS للتحضير لبذر الخلايا. استنشاق PBS وإضافة 20 مل من الوسط البطاني المشروط إلى مصفوفة الغشاء السفلي 3-المغلفة قارورة.
    25. قم بإزالة الخلايا من جهاز الطرد المركزي وشفط السوبرنات. أعد تعليق الخلايا في الوسط البطاني المشروط ليتم زرعها عند 26000 خلية / سم2 (1.95 × 106 خلايا / قارورة T75). زرع الخلايا.
    26. لحساب كفاءة الفرز وإنتاجية الخلايا، اقسم عدد الخلايا من الخطوة 4.4.23 على عدد الخلايا من الخطوة 4.4.9.
  5. الأيام 8-15: توسيع نطاق viECs
    1. في اليوم التالي (اليوم 8) ، استنشق الوسط الذي تم إنفاقه من القارورة. استبدل ب 10 مل من الوسط المشروط البطاني. استبدل الوسط البطاني المكيف كل يومين حتى تلتقي القارورة بنسبة 90٪ أو حتى يتم استخدام زجاجة الوسط البطانية المكيفة بالكامل.
    2. قم بشفط الوسط المستهلك واستبدله ب 10 مل من وسيط الصيانة البطانية (الجدول التكميلي S1) كل يومين للتوسع المستمر.
    3. لتمرير viECs ، قم بإعداد اثنين من قوارير T75 المغلفة بمصفوفة غشاء الطابق السفلي 3. اترك القوارير في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. اغسل جيدا القوارير الطازجة 3x مع 5 مل من PBS.
    4. شفط PBS. أضف 10 مل من وسط الصيانة البطانية الدافئ إلى كل قارورة طازجة. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية أثناء إعداد الخلايا للبذر كما هو موضح أدناه.
    5. أضف 5 مل من المخزن المؤقت لانفصال الخلايا إلى قارورة T75 المتقاربة بنسبة 90٪ من viECs. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقائق. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أضف 5 مل من DMEM/F12 الدافئ. جهاز طرد مركزي في 200 × غرام لمدة 5 دقائق.
    6. شفط السوبرناتانت. أعد التعليق في 1 مل من وسط الصيانة البطانية الدافئ. أضف 500 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل قارورة T75 الطازجة.
    7. في اليوم التالي ، استنشق الوسط الذي تم إنفاقه. استبدل ب 10 مل من وسط الصيانة البطانية. استنشق الوسط المستهلك واستبدله ب 10 مل من وسيط الصيانة البطانية كل يومين حتى تلتقي القارورة بنسبة 90٪.

5. اليوم 14: إعداد أجهزة رقاقة الأعضاء الموائع الدقيقة لزراعة الخلايا

  1. معالجة البلازما ومصفوفة الغشاء السفلي 2 طلاء
    1. إعداد محلول مصفوفة الغشاء السفلي 2 (الخطوة 1.3). ضعه جانبا.
    2. في غطاء رأس زراعة الأنسجة المعقمة، قم بتفريغ طبق بتري الدائري المعقم مقاس 100 مم × 15 مم. ضع الجزء العلوي من طبق بتري ، متجها لأسفل ، تحت قاع طبق بتري (الشكل التكميلي S1B).
    3. باستخدام الملقط ، أخرج رقائق الموائع الدقيقة من العبوة وضعها داخل طبق بتري. أغلق طبق بتري باستخدام الغطاء من أسفل الطبق.
    4. عند آلة البلازما ، ضع غطاء طبق بتري تحت الطبق ، ووجهه إلى الأسفل ، مع الاحتفاظ بها معا كوحدة واحدة. ضع وحدة طبق بتري في حجرة آشر البلازما. ابدأ تشغيل البلازما بالأكسجين عند 100 واط ، 15 سم مكعب ، 30 ثانية.
    5. حساس للوقت: بمجرد اكتمال العلاج ، أخرج وحدة طبق بتري من آشر البلازما. امسح غطاء طبق بتري بسرعة وبرفق مع رش 70٪ من الإيثانول على منديل المختبر. غطي طبق بتري بغطائه.
    6. أحضري طبق بتري إلى غطاء محرك السيارة المعقم لزراعة الأنسجة. أضف بلطف 25 ميكرولتر من محلول مصفوفة الغشاء السفلي 2 إلى القناة البولية (العلوية) للرقاقة. أضف 20 ميكرولتر من محلول مصفوفة الغشاء السفلي 2 إلى القناة الشعرية (السفلية) للرقاقة.
    7. خذ غطاءين معقمين من الأنبوب المخروطي سعة 15 مل واملأهما بالماء المقطر المعقم (~ 500 ميكرولتر). ضع الغطاء في طبق بتري لمنع قنوات الرقاقة والغشاء من الجفاف. ضع الغطاء على الطبق. تحضن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

6. بذر viECs وخلايا الأديم المتوسط الوسيطة في أجهزة الموائع الدقيقة

  1. اليوم 15: viECs
    1. استنشاق الوسط من قوارير T75 التي تحتوي على 90٪ من viECs المتقاربة. أضف 5 مل من المخزن المؤقت لمفرزة الخلايا واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقائق.
    2. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أضف 5 مل من DMEM/F12. جهاز طرد مركزي في 200 × غرام لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: كل قارورة T75 مع ما يقرب من 90٪ من viECs المتقاربة سوف تنتج ~ 3 ملايين خلية.
    3. شفط السوبرناتانت. أعد تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من وسيط الصيانة البطانية للحصول على ما يقرب من 2 مليون خلية / 300 ميكرولتر. ضع تعليق الخلية جانبا.
    4. انقل طبق بتري الذي يحتوي على رقائق الموائع الدقيقة إلى غطاء محرك الأنسجة. قم بتوصيل طرف حاجز P200 بطرف الشافطة.
    5. اغسل كل من القنوات العلوية والسفلية لشريحة الموائع الدقيقة باستخدام 200 ميكرولتر من DMEM / F12 مع سحب محيط المخرج في نفس الوقت.
    6. أمسك الشريحة بإحكام باستخدام طرف الحاجز P200 المتصل بالشافط، بعيدا عن مخرج القناة السفلية. حقن 20 ميكرولتر من تعليق viEC بقوة مع ما يقرب من 134000 خلية في القناة الشعرية (السفلية) للرقاقة. استنشق بعناية الوسط من محيط المنفذ.
    7. تحقق تحت المجهر من وجود فقاعات أو كثافة بذر viEC غير متساوية.
    8. اقلب الشريحة برفق لعكسها بحيث يمكن ل viECs الالتصاق بالجانب القاعدي لغشاء PDMS المرن. ضع الشريحة في خرطوشة الحامل. أضف 3 مل من PBS إلى خرطوشة حامل الشريحة لمنع الغشاء من الجفاف. احتضن الشريحة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
    9. تحقق من القناة السفلية تحت المجهر بحثا عن طبقة متقاربة من viECs متصلة بغشاء PDMS المرن. أسقط 200 ميكرولتر من وسيط الصيانة البطانية على مدخل القناة السفلية واتركه يتدفق عبر القناة لغسل قناة الخلايا البطانية غير المتصلة أثناء الشفط بعناية من محيط منفذ القناة الشعرية (السفلية).
    10. أعد تركيب الشريحة مرة أخرى في خرطوشة الحامل. تحضن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. اليوم 16: خلايا الأديم المتوسط الوسيطة (IM)
    1. اغسل القناة الشعرية (السفلية) بلطف باستخدام 200 ميكرولتر من وسيط الصيانة البطانية مع سحب محيط منفذ المخرج بعناية.
    2. اغسل القناة البولية (العلوية) ب 200 ميكرولتر من DMEM / F12 أثناء شفط محيط المخرج بعناية. إسقاط ~ 50 ميكرولتر من DMEM / F12 على منافذ المدخل والمخرج.
    3. استنشاق وسط تحريض الأديم المتوسط المتوسط من كل بئر من الصفيحة المكونة من 12 بئرا.
      ملاحظة: كل بئر في نهاية التمايز يعطي ما يقرب من 1.5 مليون خلية IM.
    4. أضف 1 مل من التربسين-EDTA إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 12 بئرا واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    5. كشط الخلايا بلطف باستخدام رافع الخلايا ، وماصة لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا باستخدام P1000. أضف 2 مل من محلول تحييد التربسين (الجدول التكميلي S1) إلى كل بئر. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل. ارفع حجم تعليق الخلية إلى 50 مل باستخدام DMEM / F12 وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    6. شفط السوبرناتانت. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من وسط تحريض الأديم المتوسط المتوسط للحصول على ما يقرب من 3 ملايين خلية / 500 ميكرولتر.
    7. أمسك الشريحة بإحكام باستخدام طرف الحاجز P200 المتصل بالشافطة، بعيدا عن مخرج القناة البولية (العلوية). حقن بقوة 25 ميكرولتر من تعليق الخلايا مع ما يقرب من 112500 خلية IM في القناة البولية (العلوية) للرقاقة ، وشفط الوسط بعناية من محيط المخرج.
    8. تحقق تحت المجهر من وجود فقاعات أو كثافة بذر خلايا IM غير متساوية. أضف 3 مل من PBS إلى خرطوشة حامل الشريحة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
    9. اغسل كلتا القناتين ب 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الخاص بكل منهما مع استنشاق محيط منافذ الشريحة بعناية للمساعدة في منع التدفق الخلفي للوسط المستهلك وحطام الخلية.
    10. قم بتوصيل أطراف حاجز P200 الفارغة في كل من منافذ القنوات البولية والشعيرات الدموية. ماصة 200 ميكرولتر من وسط الصيانة البطانية وحقن نصفها في مدخل القناة الشعرية. حرر طرف الماصة داخل المدخل بحيث يتم الآن توصيل كل من مدخل ومخرج القناة بأطراف ماصة مملوءة بمتوسطة.
    11. ماصة 200 ميكرولتر من وسيط صيانة IM وحقن نصفها في مدخل القناة البولية. حرر طرف الماصة داخل المدخل بحيث يتم الآن توصيل كل من مدخل ومخرج القناة بأطراف ماصة مملوءة بمتوسطة. احتضن الرقائق مع نصائح مدمجة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. قم بتوصيل الرقائق بالمفاعل الحيوي لرقاقة الأعضاء لتطبيق تدفق السوائل والإجهاد الميكانيكي.
    1. إزالة نصائح P200 من القنوات البولية والشعيرات الدموية. أضف قطرات من الوسائط المعنية إلى مدخل ومخرج القنوات البولية والشعرية لمنع التجفيف.
    2. أضف 3 مل من وسط تحريض Podocyte الدافئ (الجدول التكميلي S1) إلى خزان مدخل البول. أضف 3 مل من وسط الصيانة البطانية الدافئ إلى خزان مدخل الشعيرات الدموية.
    3. أضف 300 ميكرولتر من وسط تحريض Podocyte الدافئ إلى خزان مخرج القناة البولية مباشرة فوق منفذ المخرج. أضف 300 ميكرولتر من وسيط الصيانة البطانية الدافئ إلى خزان مخرج القناة الشعرية مباشرة فوق منفذ المخرج.
    4. حرك القرون على الدرج وفي المفاعل الحيوي لرقاقة العضو.
    5. استخدم القرص الدوار الموجود في المفاعل الحيوي لرقاقة الأعضاء لتحديد الدورة الرئيسية وتشغيلها (2 دقيقة). افحص بصريا الجانب السفلي من الجراب بحثا عن قطرات صغيرة في جميع المنافذ المائعة الأربعة.
    6. لتحقيق ملامسة السوائل بين الجانب السفلي من البود ومنافذ رقاقة الموائع الدقيقة، حرك حامل الشريحة برفق في الجرعة. اضغط برفق على علامة التبويب حامل الشريحة للداخل ولأعلى. شفط الوسط الزائد من سطح الشريحة.
    7. اضبط معدل تدفق المفاعل الحيوي لرقاقة الجهاز على 60 ميكرولتر / ساعة. اضبط السلالة الدورية على 10٪ عند 0.4 هرتز. استخدم القرص الدوار الموجود في المفاعل الحيوي لرقاقة الأعضاء لتحديد دورة التنظيم وتشغيله لمدة 2 ساعة.
    8. افحص بصريا خزانات المخرج بحثا عن زيادة في مستوى الوسط.
    9. استخدم القرص الدوار الموجود في المفاعل الحيوي لرقاقة الجهاز لتحديد دورة التنظيم.

7. الأيام 17-21 وما بعدها: تحريض podocyte وصيانة رقاقة

  1. قم بشفط الوسط من خزانات مخرج القناة البولية قطريا بعيدا عن الميناء ولكن احتفظ ببعض الوسائط في الخزان كل يوم من أيام الثقافة. قم بتجديد خزان مدخل القناة البولية بما يصل إلى 3 مل من وسيط تحريض Podocyte كل يومين لمدة 5 أيام.
    1. بعد 5 أيام ، استنشق الوسط من القناة البولية ولكن احتفظ ببعض الوسائط في الخزان. قم بتجديد خزان مدخل القناة البولية يوميا باستخدام 3 مل من وسيط صيانة Podocyte.
  2. قم بشفط الوسط من خزانات مخرج القناة الشعرية قطريا بعيدا عن الميناء ولكن احتفظ ببعض الوسائط في الخزان كل يوم من أيام الثقافة. قم بتجديد خزان مدخل القناة الشعرية يوميا بما يصل إلى 3 مل من وسط الصيانة البطانية.

8. الفحص الوظيفي والتصوير المناعي

ملاحظة: راجع الملف التكميلي 1 للحصول على تفاصيل حول تحليل قياس التدفق الخلوي، ELISA للنفايات السائلة للرقاقة، وعزل mRNA.

  1. الفحص الوظيفي (الترشيح الجزيئي) باستخدام الأنسولين والألبومين
    1. قم بشفط الوسط من خزان مخرج القناة الشعرية قطريا بعيدا عن الميناء ولكن احتفظ ببعض الوسائط في الخزان. استبدل ب 3 مل من وسيط الصيانة البطانية المكمل بالأنسولين والألبومين (الجدول التكميلي S1) لمدة 6 ساعات.
    2. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، قم بقياس حجم (بالمل) من الوسط من القناة البولية ونقله إلى أنبوب مخروطي 15 مل. لف الأنبوب بورق الألومنيوم للحماية من الضوء وتقليل التبييض الضوئي للإينولين والألبومين المقترنين بالفلوروفور. قم بتجديد الخزان ب 3 مل من وسيط صيانة Podocyte.
    3. إعداد محلول مخزون من الأنسولين في وسيط صيانة Podocyte. بدءا من 25 ميكروغرام / مل من الإينولين ، قم بإعداد ثمانية معايير من الأنسولين عبر تخفيف تسلسلي 2x في وسط صيانة Podocyte.
    4. وبالمثل ، قم بإعداد حل مخزون من الألبومين في وسيط صيانة Podocyte. بدءا من 150 ميكروغرام / مل من الألبومين ، قم بإعداد ثمانية معايير من الألبومين عبر تخفيف تسلسلي 2x في وسيط صيانة Podocyte.
    5. ماصة في تكرار 100 ميكرولتر من كل تركيز الأنسولين القياسي في كل بئر من صفيحة سوداء 96 بئرا (أو 16 بئرا إجمالا من الأنسولين). ماصة في تكرار 100 ميكرولتر من كل تركيز الألبومين القياسي في كل بئر من نفس لوحة 96 بئر (16 بئرا إجمالا من الألبومين). ماصة في مكررة 100 ميكرولتر Podocyte صيانة الوسط لتكون بمثابة فارغة (أو اثنين من الآبار الإجمالية من وسيط صيانة Podocyte).
    6. ماصة في تكرار 100 ميكرولتر من وسط النفايات السائلة من القناة البولية إلى كل بئر من نفس لوحة 96 بئر. ماصة في تكرار 100 ميكرولتر من وسط النفايات السائلة من القناة الشعرية.
    7. أدخل اللوحة في قارئ الألواح وقم بقياس التألق للألبومين عند الإثارة 550 نانومتر والانبعاثات 615 نانومتر. قم بقياس نفس اللوحة للإنولين عند الإثارة 513 نانومتر والانبعاثات 577 نانومتر.
    8. من البيانات التي تم إنشاؤها، متوسط القياسات المكررة (لكل شريحة). اطرح القيمة الفارغة المقابلة لقراءة اللوحة من بقية البيانات الموجودة على الورقة.
    9. ارسم القيم المقابلة لمعايير الألبومين لإنشاء منحنى قياسي بتركيز [ميكروغرام/مل] على المحور x وتألق على المحور y. ارسم القيم المقابلة لمعايير الأنسولين لإنشاء منحنى قياسي بتركيز [ميكروغرام/مل] على المحور x وتألق على المحور y.
    10. استخدم حزمة برامج التحليل الإحصائي والاستيفاء الخطي لتحديد التركيز البولي للإينولين والألبومين ، على التوالي ، في وسط النفايات السائلة من الرقائق.
    11. أوجد الخلوص البولي للإينولين/الألبومين من الرقائق باستخدام المعادلة (1)2:
      إزالة البول = ([U] × UV) / [P] (1)
      حيث [U] هو التركيز البولي من الخطوة 8.1.10 ، الأشعة فوق البنفسجية هي حجم النفايات السائلة للقناة البولية المجمعة من الخطوة 8.1.2 ، و [P] هي التركيز الشعري للإينولين أو الألبومين (10 ميكروغرام / مل من الأنولين أو 100 ميكروغرام / مل من الألبومين).
  2. التصوير المناعي
    1. حقن طرف P200 فارغ في منافذ مخرج القنوات البولية والشعيرية الدموية. لإصلاح الخلايا ، ماصة 200 ميكرولتر من الفورمالديهايد 4 ٪ وحقن نصفها في مدخل القناة السفلية. حرر طرف الماصة داخل المدخل.
    2. ماصة 200 ميكرولتر من الفورمالديهايد 4٪ وحقن نصفها في مدخل القناة البولية. حرر طرف الماصة داخل المدخل بحيث يتم الآن توصيل كل من مدخل ومخرج القناة بأطراف ماصة مملوءة بالمثبتات.
    3. احتضان الرقائق في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    4. بعد 20 دقيقة ، تخلص من جميع نصائح الماصة. حقن أطراف P200 نظيفة وفارغة في منافذ المخرج للقنوات البولية والشعيرات الدموية. لتخلل الخلايا ، ماصة 200 ميكرولتر من 0.125 ٪ Triton X-100 / PBS وحقن نصفها في مدخل القناة الشعرية. حرر طرف الماصة داخل المدخل.
    5. ماصة 200 ميكرولتر من 0.125٪ Triton X-100 / PBS وحقن نصفها في مدخل القناة البولية. حرر طرف الماصة داخل المدخل. احتضن الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    6. تخلص من جميع نصائح الماصة. حقن أطراف P200 نظيفة وفارغة في منافذ المخرج للقنوات البولية والشعيرات الدموية. لمنع الخلايا ، ماصة 200 ميكرولتر من 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في 0.125٪ Triton X-100 / PBS وحقن نصفها في مدخل القناة الشعرية. حرر طرف الماصة داخل المدخل.
    7. ماصة 200 ميكرولتر من 1٪ BSA في 0.125٪ Triton X-100 / PBS وحقن نصفها في مدخل القناة البولية. حرر طرف الماصة داخل المدخل. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    8. تخلص من جميع نصائح الماصة. اغسل كلتا القناتين 3x عن طريق سحب 200 ميكرولتر بنسبة 0.125٪ Triton X-100 / PBS في كل قناة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    9. تحضير 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية لكل قناة مع التخفيف الموصى به من قبل الشركة المصنعة في 0.125٪ Triton X-100 / PBS. حقن أطراف P200 نظيفة وفارغة في منافذ المخرج للقنوات البولية والشعيرات الدموية. ماصة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية وحقن نصفها في القنوات المعنية. حرر طرف الماصة داخل المدخل.
    10. احتضن لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو ، للحصول على نتائج أفضل ، بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تطبيق العديد من الأجسام المضادة الأولية في وقت واحد. ومع ذلك ، يجب تخفيف محلول الأجسام المضادة الأساسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    11. اغسل القنوات لمدة 3 × 10 دقائق كما هو موضح في الخطوة 8.2.8.
    12. تحضير 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية لكل قناة مع عامل التخفيف الموصى به من قبل الشركة المصنعة في 0.125٪ Triton X-100 / PBS. حقن أطراف P200 نظيفة وفارغة في منافذ المخرج للقنوات البولية والشعيرات الدموية. ماصة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية وحقن نصفها في القنوات المعنية. حرر أطراف الماصة داخل المدخل. حضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يجب تطبيق كل جسم مضاد ثانوي بشكل منفصل. اغسل ما لا يقل عن 3 × 10 دقائق بين كل تطبيق وفقا للخطوة 8.2.8.
    13. اغسل القنوات لمدة 3 × 10 دقائق كما هو موضح في الخطوة 8.2.8.
    14. اغسل كلتا القناتين مرة واحدة باستخدام 200 ميكرولتر من الماء المقطر أثناء شفط السائل المتبقي من محيط منافذ مخرج الشريحة.
    15. حقن P200 نظيفة وفارغة في منافذ المخرج للقنوات البولية والشعيرات الدموية. لمواجهة الخلايا ، ماصة 200 ميكرولتر من 4'،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ، 1: 1000 تخفيف في الماء المقطر) وحقن نصفها في مدخل القناة الشعرية. حرر طرف الماصة داخل المدخل ، وماصة 200 ميكرولتر من DAPI وحقن نصفها في مدخل القناة البولية. حرر طرف الماصة داخل المدخل ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    16. تخلص من جميع نصائح الماصة. حقن أطراف P200 نظيفة وفارغة في منافذ المخرج للقنوات البولية والشعيرات الدموية. لمواجهة الخلايا ، ماصة 200 ميكرولتر من الفلويدين (1: 1000 تخفيف في PBS بدون Ca 2 + و Mg2 +) وحقن نصفها في مدخل القناة الشعرية وإطلاق طرف الماصة داخل المدخل. ماصة 200 ميكرولتر من الفيلويدين (1:1000 تخفيف في PBS بدون Ca 2+ و Mg2+) وحقن نصفها في مدخل القناة البولية وإطلاق طرف الماصة داخل المدخل. تحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    17. اغسل القنوات 3x ب 200 ميكرولتر من PBS بدون Ca 2+ و Mg2+ ، واستنشق السوائل الزائدة من محيط منافذ المخرج.
    18. تصور الرقائق.

النتائج

هنا نظهر أن نموذج 3D وظيفي في المختبر من الكبيبات يمكن أن تكون الأوعية الدموية والظهارية من مصدر متساوي المنشأ من خلايا iPS البشرية. على وجه التحديد ، يوفر هذا البروتوكول تعليمات حول كيفية تطبيق تقنية خلايا iPS البشرية ، وخاصة قدرتها على التمييز إلى أنواع الخلايا المتخصصة ، لتوليد ظهارة ?...

Discussion

في هذا التقرير ، نوجز بروتوكولا لاشتقاق بطانة الأوعية الدموية والظهارة الكبيبية (podocytes) من خط خلايا iPS بشري متساوي المنشأ واستخدام هذه الخلايا لهندسة نظام 3D organ-on-a-chip الذي يحاكي البنية ، وواجهة الأنسجة والأنسجة ، ووظيفة الترشيح الجزيئي لكبيبات الكلى. تم تجهيز رقاقة الكبيبات هذه بالظهارة ال...

Disclosures

S.M. هو مخترع على براءة اختراع تتعلق بتمايز الخلايا البودوسية عن خلايا iPS البشرية. المؤلف الآخر ليس لديه ما يفصح عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل كلية برات للهندسة في جامعة ديوك ، وقسم أمراض الكلى في قسم الطب في ديوك ، ومنحة وايتهيد في البحوث الطبية الحيوية ، وجائزة أبحاث Genentech ل S. Musah. حصل Y. Roye على منحة جامعة ديوك - مؤسسة ألفريد بي سلون وزمالة ويليام إم "مونتي" رايشرت للدراسات العليا من قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة ديوك. تم إنشاء خط خلايا iPS DU11 (استنساخ جامعة ديوك # 11) في منشأة Duke iPSC الأساسية وتم توفيره لنا من قبل مختبر Bursac في جامعة ديوك. ويشكر المؤلفون ن. أبوتالب وج. هولمز ور. بهاتاشاريا وي. تشو على المساعدة التقنية والمناقشات المفيدة. كما يود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر موسى على تعليقاتهم المفيدة على المخطوطة. يشكر المؤلفون مختبر Segura Lab على هدية مقياس التدفق الخلوي Acuri C6.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodiesThermo/Life TechnologiesA32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Collagen IVThermo/Life Technologies14-9871-82
NephrinProgenGP-N2
PECAM-1R&D SystemsAF806
PodocinAbcamab50339
VE-CadherinSanta Cruzsc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, HumanCorning356008Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragmentIwai North AmericaN8922012Basement membrane matrix (2)
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vialBD Biosciences354277Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation
Cells
DU11 human iPS cellsThe DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
2-MercaptoethanolThermo/Life Technologies21985023
Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugateThermo/Life TechnologiesA23017
All-trans retinoic acid (500 mg)Stem Cell Technologies72262
B27 serum-free supplementThermo/Life Technologies17504044
B-27 supplement (50x) without Vitamin AThermo/Life Technologies12587010
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9418
CHIR99021Stemgent04-0004May show lot-to-lot variation
Complete medium kit with CultureBoost-RCell Systems4Z0-500-RPodocyte maintenance media
DMEM/F12Thermo/Life Technologies12634028
DMEM/F12 with GlutaMAX supplementThermo/Life Technologies10565042DMEM/F12 with glutamine
Forskolin (Adenylyl cyclase activator)Abcamab120058
GlutaMAX supplementThermo/Life Technologies35050061glutamine supplement
Heat-inactivated FBSThermo/Life Technologies10082147
Heparin solutionStem Cell Technologies7980
Human Activin AThermo/Life TechnologiesPHC9544
Human BMP4Preprotech120-05ET
Human BMP7Thermo/Life TechnologiesPHC9544
Human VEGFThermo/Life TechnologiesPHC9394
Inulin-FITCSigma-AldrichF3272
mTeSR1 mediumStem Cell Technologies05850Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C.
N-2 Supplement (100x)Thermo/Life Technologies17502048
Neurobasal mediaThermo/Life Technologies21103049Lateral mesoderm basal media
PBS (Phosphate-buffered saline)Thermo/Life Technologies14190-250
Penicillin-streptomycin, liquid (100x)Thermo/Life Technologies15140-163
ROCK inhibitor (Y27632)Tocris1254
StemPro-34 SFMThermo/Life Technologies10639011Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months.
TGF-Beta inhibitor (SB431542)Stem Cell Technologies72234
Enzymes and other reagents
AccutaseThermo/Life TechnologiesA1110501Cell detachment buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology gradeVWR97065-058
Paraformaldehyde (PFA)Thermo/Life Technologies28906
Sterile distilled waterThermo/Life Technologies15230162
Triton X-100VWR97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05%Thermo/Life Technologies25300-120
(Orb) Hub moduleEmulateORB-HM1
100mm x 15 mm round petri dishFisherbrandFB087579B
120 x 120 mm square cell culture dishVWR688161
Accuri C6BD Biosciences
Aspirating pipettes, individually wrappedCorning29442-462
Aspirating UnitSP Bel-ArtF19917-0150
Avanti J-15R CentrifugeBeckman CoulterB99516
Conical centrifuge tube, 15 mLCorning352097
Conical centrifuge tube, 50 mLCorning352098
EVOS M7000Thermo/Life TechnologiesAMF7000Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.
HemocytometerVWR100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 incubatorThermo/Life Technologies51030403
Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 cameraCarl Zeiss Micrscopy491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)
Kimberly-Clark nitrile glovesVWR40101-346
Kimwipes, largeVWR21905-049
Leoca SP8 Upright Confocal Microscope
Media reservoir (POD Portable Module)EmulatePOD-1
Microplate shakerVWR12620-926
Organ-chipEmulateS-1 Chip
Organ-chip holderEmulateAK-CCR
P10 precision barrier pipette tipsDenville ScientificP1096-FR
P100 barrier pipette tipsDenville ScientificP1125
P1000 barrier pipette tipsDenville ScientificP1121
P20 barrier pipette tipsDenville ScientificP1122
P200 barrier pipette tipsDenville ScientificP1122
Plasma AsherQuorum techK1050X RFThis Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).
Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap capCorning352235
Serological pipette, 10 mL, indivdually wrappedCorning356551
Serological pipette, 25 mL, indivdually wrappedCorning356525
Serological pipette, 5 mL, indivdually wrappedCorning356543
Steriflip, 0.22 µm, PESEMD MilliporeSCGP00525
Sterile Microcentrifuge tubesThomas Scientific1138W14
T75cm2 cell culture flask with vent capCorning430641U
Tissue culture-treated 12 well platesCorning353043
Tissue culture-treated 6 well platesCorning353046
Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module)EmulateZOE-CM1Organ Chip Bioreactor
VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugatedMiltenyi Biotec130-126-010
Wide-beveled cell lifterCorning3008
MACS
CD144 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec130-097-857
CD31 MicroBead Kit, humanMiltenyi Biotec130-091-935
LS columnsMiltenyi Biotec130-042-401

References

  1. Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
  2. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).
  3. Petrosyan, A., et al. A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier. Nature Communications. 10 (1), 3656 (2019).
  4. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling. 9, 12 (2011).
  5. Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: when do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
  6. Da Sacco, S., et al. A novel source of cultured podocytes. PloS One. 8 (12), 81812 (2013).
  7. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  10. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  11. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).
  12. Roye, Y. A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium. Micromachines. 12 (8), 967 (2021).
  13. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).
  14. Ruotsalainen, V., et al. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).
  15. Privratsky, J. R., Newman, P. J. PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  16. Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. The glomerular filtration barrier: components and crosstalk. International Journal of Nephrology. 2012, 749010 (2012).
  17. Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress. STAR Protocols. 2 (2), 100394 (2021).
  18. Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. The productivity crisis in pharmaceutical R&D. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).
  19. Atchison, L., et al. iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

189

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved