ヒト人工多能性幹細胞から改変された同質遺伝子腎臓糸球体チップ

要約

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞から分化した遺伝的に一致する上皮細胞と血管内皮細胞を統合することにより、腎臓糸球体濾過バリアの構造と機能を要約するパーソナライズされた臓器チップシステムを設計するためのプロトコルを紹介します。このバイオエンジニアリングシステムは、腎臓精密医療および関連アプリケーションを進歩させることができます。

要約

慢性腎臓病(CKD)は米国の成人人口の15%に影響を及ぼしますが、ヒトの生物学的反応と腎毒性を正確に予測できる機能モデルがないため、標的療法の確立は制限されてきました。腎臓精密医療の進歩は、これらの制限を克服するのに役立つ可能性があります。しかし、以前に確立されたヒト腎臓糸球体の in vitro モデル(血液濾過の主要な部位であり、多くの疾患や薬物毒性の主要な標的)は、通常、限られた機能的特徴と比類のない遺伝的背景を持つ不均一な細胞集団を採用しています。これらの特性は、患者固有の疾患モデリングおよび治療法の発見への適用を大幅に制限します。

この論文では、ヒト人工多能性幹(iPS)細胞由来糸球体上皮(足細胞)と単一の患者の血管内皮を統合して、同質遺伝子および血管化マイクロ流体腎臓糸球体チップを設計するプロトコルを提示します。得られた糸球体チップは、幹細胞由来の内皮細胞層と上皮細胞層で構成されており、系統特異的マーカーを発現し、基底膜タンパク質を産生し、腎臓の糸球体濾過バリアに似た組織-組織界面を形成します。操作された糸球体チップは、分子を選択的にろ過し、薬物誘発性腎障害を再現します。同質遺伝子細胞型を使用して腎臓糸球体の構造と機能を再構成する能力は、患者の特異性で腎臓病をモデル化し、腎臓精密医療および関連アプリケーションのための臓器オンチップの有用性を促進する機会を生み出します。

概要

Organ-on-a-chipデバイスは、分子刺激と機械的刺激、血管新生を使用して、特定の臓器の構造と機能をモデル化する組織-組織界面を形成する動的な3Din vitroモデルです。腎臓糸球体(糸球体チップ)を再現することを目的とした以前に確立された臓器チップデバイスは、動物細胞株¹または不均一な供給源のヒト初代および不死化細胞株で構成されていました^2,3。遺伝的に不均一な細胞源の使用は、患者特異的反応および疾患の遺伝学またはメカニズムの研究を著しく制限する変動を提示する^4,5。この課題に対処するには、in vitroモデル^2,3,6を設計するためのより正確な微小環境を提供するために、保存された分子および遺伝的プロファイルを持つ特定の個人に由来する同質遺伝子細胞株の利用可能性にかかっています^。ヒトiPS細胞培養の進歩により、ヒト由来の同質遺伝子細胞株を容易に作製できるようになりました。ヒトiPS細胞は通常、非侵襲的に供給され、無期限に自己複製でき、ほぼすべての細胞型に分化できるため、糸球体チップ^7,8などのin vitroモデルを確立するための魅力的な細胞源として機能します。糸球体濾過バリアは、血液濾過の主要な部位である。血液は、最初に血管内皮、糸球体基底膜、そして最後にポドサイトと呼ばれる特殊な上皮を通してろ過されます。ろ過バリアの3つのコンポーネントすべてが、分子の選択的ろ過に貢献します。ここでは、単一のヒトiPS細胞源から血管内皮および糸球体上皮とインターフェースする臓器チップデバイスを確立するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、糸球体濾過バリアを再現するために同質遺伝子および血管化チップを設計するのに特に役立ちますが、同質遺伝子の「ボディオンチップ」システムなどの他のタイプのパーソナライズされた臓器オンチップおよび多臓器プラットフォームを開発するための青写真も提供します。

本明細書に記載されるプロトコルは、ヒトiPS細胞を2つの別々の系統(外側中胚葉細胞および中胚葉細胞)に分岐させることから始まり、その後、それぞれ血管内皮および糸球体上皮に分化する。側方中胚葉細胞を作製するために、ヒトiPS細胞を基底膜マトリックス1コートプレートに播種し、WntアクチベーターCHIR 99021および強力な中胚葉誘導剤である骨形成4(BMP4)を添加したN2B27培地中で3日間(培地交換なしで)培養した。得られた外側中胚葉細胞は、ブラキュリー(T)、ミックスペア様ホメオボックス(MIXL)、およびエオメソデルミン(EOMES)⁹の発現によって以前に特徴付けられました。続いて、VEGF165およびフォルスコリンを添加した培地で外側中胚葉細胞を4日間培養し、磁気活性化細胞選別(MACS)を用いてVE-カドヘリンおよび/またはPECAM-1発現に基づいて選別された血管内皮細胞を誘導した。得られた血管内皮細胞(viEC)を、マイクロ流体デバイスに播種する準備ができるまで基底膜マトリックス3コートフラスコ上で培養して増殖させた。

中胚葉細胞を作製するために、基底膜マトリックス2コートプレート上にヒトiPS細胞を播種し、アクチビンAおよびCHIR99021を含む培地で2日間培養した。得られた中胚葉細胞は、先に述べたようにHAND1、グースコイド、および腕管(T)の発現によって特徴付けられた²、^10、11。中間中胚葉(IM)細胞分化を誘導するために、中胚葉細胞をBMP-7およびCHIR99021を添加した培地中で14日間培養した。得られたIM細胞は、ウィルム腫瘍1(WT1)、ペアボックス遺伝子2(PAX2)、および奇数スキップ関連タンパク質1(OSR-1)2,10,11を発現する。

2チャンネルポリジメチルシロキサン(PDMS)ベースのマイクロ流体チップは、糸球体濾過バリアの構造をin vitroで再現するために設計されました。尿路は1,000 μm x 1,000 μm(幅 x 高さ)で、毛細血管チャネルの寸法は1,000 μm x 200 μm(幅 x 高さ)です。周期的な延伸および緩和サイクルは、流体チャネルの両側に存在する中空チャンバーによって促進された。細胞は、尿路と毛細血管チャネルを分離する柔軟なPDMS膜(厚さ50μm)に播種されました。メンブレンは、細胞間シグナル伝達を促進するために六角形の細孔(直径7 μm、間隔40 μm)を備えています(図1A)^2,12。IM誘導が完了する2日前に、マイクロ流体チップを基底膜マトリックス2でコーティングした。IM誘導が完了する1日前に、内皮維持培地を用いてマイクロ流体チップのキャピラリーチャネルにviECを播種し、チップを逆さまにして、ECMコーティングPDMS膜の基底側に細胞接着を可能にしました。IM誘導が完了した日に、BMP7、アクチビンA、CHIR99021、VEGF165、およびすべてのトランスレチノイン酸を添加した培地を使用して、細胞をマイクロ流体チップの尿路に播種し、チップ内でポドサイト分化を誘導しました。翌日、培地リザーバーにポドサイト誘導培地と内皮維持培地を充填し、0.4Hzで10%の機械的ひずみと流体の流れ(60 μL/h)をチップに加えました。

細胞化マイクロ流体チップを、ポドサイト誘導培地(尿路内)および内皮維持培地(血管チャネル内)を用いてさらに5日間培養した。得られた腎糸球体チップを、足細胞および内皮細胞の両方について維持培地中でさらに最大7日間培養した。分化したポドサイトは、ポドシンおよびネフリンを含む系統特異的タンパク質を正に発現し^13,14、一方、viECは、糸球体濾過バリアの完全性を維持するために必須の分子である系統識別タンパク質PECAM-1およびVE-Cadherinを陽性発現した^15,16。.ポドサイトとviECはどちらも、最も豊富な糸球体基底膜タンパク質であるコラーゲンIVを分泌することがわかり、これは組織の成熟と機能にも重要です。

糸球体チップの濾過バリアの3成分系(内皮、基底膜、上皮)は、分子を選択的に濾過し、化学療法、腎毒性薬物治療に反応することがわかりました。薬物治療の結果は、糸球体チップが腎毒性試験および疾患モデリングに使用できることを示した。このプロトコルは、同質遺伝子iPS細胞誘導体から機能的なマイクロ流体腎臓糸球体チップを設計するための一般的なガイドラインを提供します。設計されたチップの下流分析は、研究者が望むように実行できます。薬物誘発性糸球体損傷をモデル化するための糸球体チップの使用の詳細については、以前の出版物^2,12を参照してください。

プロトコル

1. 基底膜マトリックス溶液とコーティング基板の調製

1. 基底膜マトリックス1を氷上で4°Cで一晩解凍する。 希釈比に関するメーカーの提案に従ってアリコートします。50 mLのコニカルチューブとピペットを使用して、適量の基底膜マトリックス1を25 mLのコールドDMEM/F12に完全に解凍して溶解するまで十分に混合します。
   1. 凍結アリコートを溶解するには、25 mLのコールドDMEM/F12から~200 μLを採取し、凍結アリコートチューブに移します。マトリックスが完全に解凍および溶解するまでピペットで上下に動かします。基底膜マトリックス1の全チューブ内容物を残りのコールドDMEM/F12に移します。
2. 基底膜マトリックス1溶液1mLを6ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れる。コーティングされたプレートを同じ日に使用するには、37°Cで2時間インキュベートします。
   1. あるいは、コーティングされたプレートをパラフィルムで包み、4°Cで最大2週間保存することもできます。保存したプレートを使用する準備ができたら、37°Cで30分間インキュベートします。
3. 基底膜マトリックス2を9 mLの滅菌蒸留水で希釈し、最終濃度5 μg/mLを達成します。700 μLの基底膜マトリックス2溶液を12ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れます。基底膜マトリックス2コートプレートをパラフィルムで包み、4°Cで最大2週間保存します。
4. 凍結乾燥された基底膜マトリックス3を再構成して、製造業者が提案するようにリン酸緩衝生理食塩水(PBS、Ca⁺²-、およびMg⁺²フリー)で1 mg / mLの最終濃度を達成します。1 つの 250 μL アリコートを 9.75 mL の PBS (Ca+2 および Mg⁺² フリー) で最終濃度 25 μg/mL に希釈します。この溶液6 mLを使用して、1つのT75フラスコ(最終濃度2 μg/cm²)をコーティングします。マトリックスコーティングされたフラスコを4°Cで最大1週間保管します。

2. ヒトiPS細胞培養

注:このプロトコルで使用されているDU11ラインはテストされ、マイコプラズマおよび核型の異常がないことがわかりました。

1. 基底膜マトリックス1コーティングプレートを37°Cで1〜2時間インキュベートします。
2. 6ウェルプレートの各ウェルを1 mLの温かい(37°C)DMEM/F12で3回洗浄します。6ウェルプレートの各ウェルにヒトiPS細胞培養培地(CCM)(付表S1)2mLを加える。プレートを37°Cでインキュベートし、細胞を播種用に準備します(以下を参照)。
3. ヒトiPS細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルを1 mLの温かいDMEM/F12で洗浄します。
4. DMEM / F12を吸引します。1 mLの温かい細胞剥離バッファーを6ウェルプレートの各ウェルに加えます。37°Cで1分間インキュベートします。
5. 各ウェルを顕微鏡で目視検査し、細胞コロニーの縁の周りの解離を確認します。細胞剥離バッファーを細胞から慎重に吸引します。各ウェルを1 mLの温かいDMEM / F12で穏やかに洗浄します。
6. 顕微鏡でプレートを検査して、細胞がプレートから完全に外れていないか、誤って吸引されていないことを確認します。
7. 3 mLの温かいヒトiPS CCMを細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルに加えます。セルリフターを使用して、コロニーをそっとこすります。5 mLの血清学的ピペットを使用して、各ウェルの細胞懸濁液を1回上下に穏やかに混合します。
8. 新しい基底膜マトリックス1コーティングプレートをインキュベーターから取り出します。0.5mLの細胞懸濁液を新しい基底膜マトリックス1コーティングプレートの各ウェルに移す。プレートを8の字の動きで動かして、セルを均等に分散させます。5%_CO2 インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。
9. 使用済みの培地を吸引し、細胞が70%コンフルエントになるまで(継代後約4日)培養毎日3 mLのヒトiPS CCMに交換します。

3. 0〜16日目:ヒトiPS細胞の中間中胚葉細胞への分化

1. 0〜2日目:中胚葉誘導
   1. 基底膜マトリックス2コーティングプレートを4°Cから室温に2時間移動させ、保存後に平衡化させます。
   2. 約70%コンフルエントなヒトiPS細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルから使用済み培地を吸引する。細胞を1 mLの温かいDMEM / F12で3回穏やかに洗浄します。
   3. DMEM / F12を吸引します。ヒトiPS細胞の6ウェルプレートの各ウェルに1 mLの細胞剥離バッファーを加える。37°Cで5〜7分間インキュベートします。
   4. 各ウェルを顕微鏡で目視検査し、細胞コロニーの縁の周りの解離を確認します。セルリフターを使用して、コロニーをそっとこすります。
   5. 6ウェルプレートのすべてのウェルから細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、P1000を使用して数回ピペットで上下させ、iPS細胞のシングルセル懸濁液を得ました。
   6. コニカルチューブ内の細胞懸濁液をDMEM/F12で14 mLまで充填します。室温で200 × g で5分間遠心分離します。
   7. 上澄み液を吸引する。細胞ペレットを14 mLの温かいDMEM/F12に再懸濁します。室温で200 × g で5分間遠心分離を繰り返します。
   8. 上澄み液を吸引する。細胞を1mLの中胚葉誘導培地に再懸濁する(付表S1)。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。中胚葉誘導培地で希釈して、1×10⁵ 細胞/ mLの最終濃度を達成します。
   9. 基底膜マトリックス2被覆板から塗膜を吸引する。基底膜マトリックス2コーティングプレートの各ウェルを2 mLの温かいDMEM / F12ですすいでください。
   10. 細胞懸濁液を2倍にゆっくりと上下にピペットで入れます。細胞懸濁液1mLを基底膜マトリックス2コートプレートの各ウェルに移す。プレートを8の字の動きでゆっくりと動かして、セルを均等に分散させます。
   11. プレートを37°Cで一晩インキュベートします。翌日(1日目)に、12ウェルプレートの各ウェルから使用済み培地を吸引する。1 mLの温かい中胚葉誘導培地と交換してください。.37°Cで一晩インキュベートします。
2. 2〜16日目:中間中胚葉誘導
   1. 使用済みの中胚葉誘導培地を吸引します。1mLの温かい中間中胚葉誘導培地と交換してください(補足表S1)。使用済みの培地を吸引し、14日間毎日1mLの温かい中間中胚葉誘導培地と交換します。

4. 0〜15日目:ヒトiPS細胞の血管内皮細胞への分化と増殖

1. 0日目:ヒトiPS細胞の播種
   1. ROCK阻害剤を含むヒトiPS CCMを15mL調製する(補足表S1)。37°Cで保温してください。
   2. 1枚の基底膜マトリックス1コーティングプレートを37°Cで1〜2時間インキュベートします。 基底膜マトリックス1を吸引する。1 mLの温かいDMEM / F12で3回洗浄します。
   3. DMEM / F12を吸引します。ROCK阻害剤を含むヒトiPS CCMを2 mLの6ウェルプレートの各ウェルに加えます。プレートを37°Cでインキュベートし、細胞を播種用に準備します(以下を参照)。
   4. 約70%コンフルエントなヒトiPS細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルから使用済み培地を吸引する。細胞を1 mLの温かいDMEM / F12で3回穏やかに洗浄します。
   5. DMEM / F12を吸引します。ヒトiPS細胞の6ウェルプレートの各ウェルに1 mLの細胞剥離バッファーを加える。37°Cで5〜7分間インキュベートして、細胞を単一細胞に解離させます。
      注:iPS細胞株間の固有の違いにより、ユーザーは最適なインキュベーション時間を決定するために5分後に細胞を目視検査する必要があります。
   6. 細胞を15 mLのコニカルチューブに移します。細胞懸濁液を温かいDMEM/F12で14 mLまで持ってきて、剥離バッファーを中和します。室温で200×g で5分間遠心分離する。
   7. 上清を静かに吸引します。細胞をROCK阻害剤を含むヒトiPS CCM1 mLに再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞の総数を数えます。
   8. 37,000〜47,000細胞/cm² (6ウェルプレートの355,200〜451,200細胞/ウェル)の細胞を播種します。37°Cで一晩インキュベートします。
      注:iPS細胞株間の固有の違いにより、ユーザーは最適な播種密度を決定する必要があります。
2. 1〜3日目:側方中胚葉誘導
   1. 翌日(1日目)、ヒトiPS細胞の6ウェルプレートの各ウェルから使用済み培地を吸引する。6ウェルプレートの各ウェルを5mLの側方中胚葉誘導培地と交換する(補足表S1)。培養容器(例えばフラスコ)をスケールアップする場合、一般に、培養容器内の作業容積を3倍に交換する。
   2. この培地を3日間交換しないでください。
      注:ウェル内の側方中胚葉誘導培地は、細胞が栄養素を使い果たすにつれて、通常、色が赤から黄色に変わります。ただし、曇った培地または細菌の増殖を伴う培地は正常ではないため、除染して廃棄する必要があります。
3. 4〜6日目:内皮細胞誘導
   1. 6ウェルプレートの各ウェルから使用済み培地を吸引する。6ウェルプレートの各ウェルを3 mLの温かい内皮誘導培地と交換します(補足表S1)。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
   2. 次の2日間(5日目と6日目)、すべてのウェルから使用済み培地を50 mLのコニカルチューブに回収します。円錐管は4°Cで保管してください。 細胞に3 mLの温かい内皮誘導培地を補充します。プレートを37°Cでインキュベートします。
4. 7日目:内皮細胞(viEC)ソーティング
   1. 地下膜マトリックス3フラスコを取り出し、室温で1時間放置する。
   2. 50mLのMACSバッファーを調製する(補足表S1)。
   3. 細胞剥離バッファー、MACSバッファー、内皮CCM、およびPBS(Ca2+および^Mg2+遊離)を組織培養フード内の氷上に置きます。
   4. マグネットをMACSスタンドに置きます。2つの50 mLコニカルチューブと1つの15 mLコニカルチューブをコニカルチューブホルダーに入れます。
   5. MACSスタンド(マグネットが取り付けられている状態)と1つのLSカラムを組織培養フードに配置します。円錐形のチューブホルダー(内部に円錐形のチューブがある)を磁石の下のMACSスタンドに設置します(補足図S1A)。
   6. 使用済み培地を6ウェルプレートの各ウェルからステップ4.3.2の50 mLコニカルチューブに回収します。6ウェルプレートの各ウェルをPBS(^Ca2+ および^Mg2+ 遊離)で洗浄する。
   7. PBSを吸引します。1 mLの細胞剥離バッファーを追加します。37°Cで5〜7分間インキュベートして、細胞を完全に解離させます。
   8. 細胞を50 mLコニカルチューブに移します。細胞懸濁液を冷たい内皮CCMで15mLにする。室温で200 × g で5分間遠心分離します。
   9. 上澄み液を吸引する。細胞を1 mLの冷たいMACSバッファーに再懸濁します。血球計算盤で細胞を数えます。
   10. 10 mLのMACSバッファーを細胞懸濁液に加えます。室温で200 × g で5分間遠心分離します。
   11. 上澄み液を吸引する。1,000万細胞あたり80 μLのMACSバッファーに細胞を再懸濁します。FcRブロッキング試薬、CD31マイクロビーズ、およびCD144マイクロビーズの1,000万細胞あたり20 μLを追加します。氷上で15分間インキュベートします。
   12. 細胞懸濁液がインキュベートされている間に、内皮誘導から回収した培地を200 × g で10分間遠心分離する(ステップ4.3.2)。
   13. 上清を500 mLの0.22 μm真空フィルターに集めます。内皮馴化培地を調製する(付表S1)。無菌条件下で培地をろ過し、培地を37°Cで保温します。
       注:内皮細胞の増殖率は、継代3以降に減少し始めます。継代3後に指数関数的成長を達成するために、内皮馴化および維持培地に、継代1から10μM TGF-β阻害剤(SB431542)を補充することができます。
   14. ステップ4.4.11で15分間インキュベートした後、1000万細胞あたり10 mLのMACSバッファー(最大30 mLのMACSバッファー)を細胞懸濁液に加えます。200 × g で5分間遠心分離します。
   15. 上澄み液を吸引する。1 mLのMACSバッファーに再懸濁します。
   16. LSカラムを取り、プランジャーをシリンジから引き出します。プランジャーをプラスチックスリーブに戻します。カラムを磁石の上に置きます。
   17. 最初の50 mLコニカルチューブをカラムの下に配置します。1 mLのMACSバッファーをカラムに加えます。下の50mLコニカルチューブに集めます。
   18. カラムの乾燥を防ぐために完全ではありませんが、液体を流します。液滴がゆっくりと滴り始めたら、細胞懸濁液をカラムに加えます。フロースルーを同じ50 mLコニカルチューブに集めます。
   19. 液滴がゆっくりと滴り始めたら、次の50 mLコニカルチューブをカラムの下に配置します。初期フロースルー (ステップ 4.4.18) を列に追加します。下の50mLコニカルチューブに集めます。
   20. 液滴がゆっくりと滴り始めたら、500 μLのMACSバッファーを3x加えてカラムを洗浄します。
   21. マグネットからカラムを取り外します。カラムを15 mLのコニカルチューブに置きます。1 mLのコールドPBSをカラムに加えます。
   22. 細胞を集めるには、プラスチックスリーブからプランジャーを取り出し、しっかりとカラムに押し込みます。
   23. 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞懸濁液をPBSで5mLにする。200 × gで5分間遠心分離します。
   24. 細胞が遠心分離を受けている間に、基底膜マトリックス3コーティングフラスコを5 mLのPBSで3回洗浄し、細胞播種の準備をします。PBSを吸引し、20 mLの内皮馴化培地を基底膜マトリックス3コーティングフラスコに加えます。
   25. 遠心分離機から細胞を取り除き、上清を吸引します。細胞を内皮馴化培地に再懸濁し、26,000細胞/^cm2 (1.95 ×^{10 6} 細胞/T75フラスコ)で播種します。細胞に種をまきます。
   26. ソート効率とセル収量を計算するには、ステップ4.4.23のセル数をステップ4.4.9のセル数で割ります。
5. 8〜15日目:viECの拡張
   1. 翌日(8日目)、使用済み培地をフラスコから吸引する。10 mLの内皮馴化培地と交換してください。.フラスコが90%コンフルエントになるまで、または内皮馴化培地ボトルが完全に使用されるまで、内皮馴化培地を1日おきに交換します。
   2. 使用済みの培地を吸引し、1日おきに10 mLの内皮維持培地(補足表S1)と交換して、継続的な拡張を行います。.
   3. viECを継代するには、2つの基底膜マトリックス3コーティングT75フラスコを準備します。フラスコを室温で1時間放置します。調製したてのフラスコを5 mLのPBSで3回完全に洗浄します。
   4. PBSを吸引します。10 mLの温かい内皮維持培地を新しく調製した各フラスコに加えます。プレートを37°Cでインキュベートし、細胞を播種用に準備します(以下を参照)。
   5. 5 mLの細胞剥離バッファーをviECの90%コンフルエントT75フラスコに加えます。37°Cで5〜7分間インキュベートします。細胞を15 mLのコニカルチューブに移します。5 mLの温かいDMEM / F12を加えます。200 × g で5分間遠心分離します。
   6. 上澄み液を吸引する。1 mLの温かい内皮維持培地に再懸濁します。.500 μLの細胞懸濁液を、新たに調製したT75フラスコのそれぞれに加えます。
   7. 翌日、使用済みの培地を吸引します。10 mLの内皮維持培地と交換してください。.使用済みの培地を吸引し、フラスコが90%コンフルエントになるまで1日おきに10 mLの内皮維持培地と交換します。.

5. 14日目:細胞培養用マイクロ流体臓器チップデバイスの作製

1. プラズマ処理及び基底膜マトリックス2コーティング
   1. 基底膜マトリックス2溶液を調製する(ステップ1.3)。脇に置きます。
   2. 滅菌組織培養フードで、滅菌済みの100 mm x 15 mmの丸いペトリ皿を開梱します。ペトリ皿の上部を下向きにして、ペトリ皿の下部の下に置きます(補足図S1B)。
   3. ピンセットを使用して、パッケージからマイクロ流体チップを取り出し、ペトリ皿の中に置きます。皿の下から蓋を使ってペトリ皿を閉じます。
   4. プラズマアッシャーで、ペトリ皿の蓋を皿の下に置き、上を下に向けて、それらを1つのユニットとしてまとめます。ペトリ皿ユニットをプラズマアッシャーチャンバーに入れます。プラズマアッシャーを酸素で100 W、15 SCCM、30秒で始動します。
   5. 時間に敏感:治療が完了したら、プラズマアッシャーからペトリ皿ユニットを取り出します。実験室用ワイプにスプレーした70%エタノールでペトリ皿の蓋をすばやく軽く拭きます。ペトリ皿を蓋で覆います。
   6. ペトリ皿を滅菌組織培養フードに持ってきます。25 μLの基底膜マトリックス2溶液をチップの尿(上部)チャネルに穏やかに追加します。20 μLの基底膜マトリックス2溶液をチップのキャピラリー(下部)チャネルに追加します。
   7. 滅菌済みの15 mLコニカルチューブキャップを2つ取り、滅菌蒸留水(~500 μL)で満たします。キャップをペトリ皿に入れて、チップチャネルとメンブレンが乾燥しないようにします。皿に蓋をします。37°Cで一晩インキュベートします。

6. viECおよび中間中胚葉細胞のマイクロ流体デバイスへの播種

1. 15日目: viEC
   1. 90%コンフルエントなviECを含むT75フラスコから培地を吸引します。5 mLの細胞剥離バッファーを加え、37°Cで5〜7分間インキュベートします。
   2. 細胞を15 mLのコニカルチューブに移します。5 mL の DMEM/F12 を追加します。200 × g で5分間遠心分離します。
      注:約90%のコンフルエントなviECを含む各T75フラスコは、~300万個の細胞を生成します。
   3. 上澄み液を吸引する。細胞を300 μLの内皮維持培地に再懸濁して、約200万細胞/300 μLを取得します。 血球計算盤で細胞を数えます。セル懸濁液を脇に置きます。
   4. マイクロ流体チップを入れたシャーレを組織培養フードに移します。P200バリアチップをアスピレーターの先端に取り付けます。
   5. マイクロ流体チップの上部と下部の両方のチャネルを200 μLのDMEM/F12でフラッシュすると同時に、出口の周囲を吸引します。
   6. P200バリアチップをアスピレーターに取り付けて、下部チャネルの出口から離してチップをしっかりと保持します。約134,000個の細胞を含む20 μLのviEC懸濁液をチップのキャピラリー(下部)チャネルにしっかりと注入します。出口の周囲から慎重に媒体を吸引します。
   7. 顕微鏡で気泡や不均一なviEC播種密度がないか確認します。
   8. チップを静かに裏返して反転させ、viECが柔軟なPDMSメンブレンの基底側に接着できるようにします。チップをホルダーカートリッジに入れます。メンブレンが乾燥するのを防ぐために、チップホルダーカートリッジに3 mLのPBSを追加します。チップを37°Cで3時間インキュベートします。
   9. 顕微鏡下でボトムチャンネルをチェックして、フレキシブルPDMSメンブレンに結合したviECのコンフルエント層を確認します。200 μLの内皮維持培地をボトムチャネルの入口に滴下し、チャネルを流して、キャピラリー(ボトム)チャネル出口の周辺から慎重に吸引しながら、付着していない内皮細胞のチャネルを洗浄します。
   10. チップをホルダーカートリッジに戻します。37°Cで一晩インキュベートします。
2. 16日目:中間中胚葉(IM)細胞
   1. キャピラリー(下部)チャネルを200 μLの内皮維持培地で静かに洗い流し、出口ポートの周囲を注意深く吸引します。
   2. 出口の周囲を注意深く吸引しながら、尿(上)チャネルを200 μLのDMEM / F12で洗い流します。入口ポートと出口ポートに~50 μLのDMEM/F12をドロップします。
   3. 12ウェルプレートの各ウェルから中間中胚葉誘導培地を吸引する。
      注:分化終了時の各ウェルは、約150万個のIM細胞を提供します。
   4. 12ウェルプレートの各ウェルに1 mLのトリプシン-EDTAを加え、37°Cで5分間インキュベートします。
   5. セルリフターを使用して細胞を静かにこすり、P1000を使用してピペットで上下に細胞を解離します。2 mLのトリプシン中和溶液(補足表S1)を各ウェルに追加します。細胞を50 mLコニカルチューブに移します。細胞懸濁液をDMEM/F12で50 mLにし、200 × g で5分間遠心分離します。
   6. 上澄み液を吸引する。細胞を500 μLの中間中胚葉誘導培地に再懸濁して、約300万細胞/500 μLを取得します。 血球計算盤で細胞を数えます。
   7. P200バリアチップをアスピレーターに取り付けて、尿(上部)チャネルの出口から離してチップをしっかりと保持します。約112,500IM細胞を含む25 μLの細胞懸濁液をチップの尿路(上部)チャネルにしっかりと注入し、出口の周辺から培地を注意深く吸引します。
   8. 顕微鏡で気泡やIM細胞の播種密度が不均一でないか確認します。チップホルダーカートリッジに3mLのPBSを追加します。37°Cで3時間インキュベートします。
   9. 使用済み培地と細胞破片の逆流を防ぐために、チップ出口の周囲を注意深く吸引しながら、両方のチャネルをそれぞれの細胞培養培地200 μLで洗い流します。
   10. 空のP200バリアチップを尿路と毛細血管チャネルの両方の出口に取り付けます。内皮維持培地200 μLをピペットし、その半分をキャピラリーチャネル入口に注入します。ピペットチップを入口の内側に放し、チャネルの入口と出口の両方が培地で満たされたピペットチップに取り付けられるようにします。
   11. 200 μLのIM維持培地をピペットし、半分を尿路入口に注入します。ピペットチップを入口の内側に放し、チャネルの入口と出口の両方が培地で満たされたピペットチップに取り付けられるようにします。チップを埋め込み、37°Cで一晩インキュベートします。
3. チップをオルガンチップバイオリアクターに接続して、流体の流れと機械的ひずみを加えます。
   1. 尿路と毛細血管チャネルからP200チップを取り外します。乾燥を防ぐために、尿路と毛細血管チャネルの入口と出口にそれぞれの媒体の液滴を追加します。
   2. 3 mLの温かい足細胞誘導培地(補足表S1)を尿入口リザーバーに追加します。.3 mLの温かい内皮維持培地をキャピラリーインレットリザーバーに追加します。
   3. 300 μLの温かい足細胞誘導培地を、出口ポートの真上にある尿路出口リザーバーに追加します。300 μLの温かい内皮維持培地を、出口ポートの真上にあるキャピラリーチャネル出口リザーバーに追加します。
   4. ポッドをトレイにスライドさせ、オルガンチップバイオリアクターに入れます。
   5. オルガンチップバイオリアクターの ロータリーダイヤル を使用して、 プライムサイクル (2分)を選択して開始します。ポッドの下側に、4つの流体ポートすべてに小さな液滴がないか目視検査します。
   6. Podの下側とマイクロ流体チップポートの間に流体と流体の接触を実現するには、チップキャリアをPodにゆっくりとスライドさせます。チップキャリアタブをゆっくりと押し込みます。チップ表面から余分な媒体を吸引します。
   7. 臓器チップバイオリアクターの流量を60 μL / hに設定します。周期ひずみを0.4Hzで10%に設定します。オルガンチップバイオリアクターのロータリーダイヤルを使用して、調整サイクルを選択し、2時間実行します。
   8. 出口リザーバーを目視検査して、媒体のレベルが上昇します。
   9. オルガンチップバイオリアクターの 回転ダイヤル を使用して、 調整サイクルを選択します。

7. 17〜21日目以降:足細胞誘導とチップメンテナンス

1. ポートから斜め離れた尿路出口リザーバーから培地を吸引しますが、培養の毎日、リザーバーに培地を保管してください。尿路入口リザーバーに最大3 mLのポドサイト誘導培地を2日ごとに5日間補充します。.
   1. 5日後、尿路から培地を吸引しますが、一部の培地をリザーバーに保管します。尿路入口リザーバーに3 mLのポドサイト維持培地を毎日補充します。.
2. キャピラリーチャネル出口リザーバーからポートから斜めに離れた培地を吸引しますが、培養の毎日、リザーバーに培地を保管してください。キャピラリーチャネル入口リザーバーに最大3 mLの内皮維持培地を毎日補充します。.

8. 機能アッセイと免疫蛍光イメージング

注:フローサイトメトリー解析、チップ流出液のELISA、およびmRNAの分離の詳細については、 補足ファイル1 を参照してください。

1. イヌリンとアルブミンを用いた機能アッセイ(分子ろ過)
   1. キャピラリーチャネル出口リザーバーからポートから斜め離れた場所に培地を吸引しますが、一部の培地をリザーバーに保持します。イヌリンとアルブミンを添加した3 mLの内皮維持培地(補足表S1)と6時間交換します。.
   2. 5 mLの血清学的ピペットを使用して、尿路からの培地の量(mL単位)を測定し、15 mLのコニカルチューブに移します。チューブをアルミホイルで包み、光から保護し、蛍光色素結合イヌリンとアルブミンの光退色を最小限に抑えます。リザーバーに3 mLのポドサイト維持培地を補充します。
   3. ポドサイト維持培地にイヌリンのストック溶液を調製する。25 μg/mLのイヌリンから始めて、ポドサイト維持培地で2倍の段階希釈 を介して イヌリンの8つの標準を調製します。
   4. 同様に、ポドサイト維持培地にアルブミンのストック溶液を調製する。150 μg/mLアルブミンから始めて、Podocyte維持培地で2倍の段階希釈 を介して 8つの標準アルブミンを調製します。
   5. 各標準イヌリン濃度の100 μLを黒色の96ウェルプレートの各ウェル(またはイヌリンの合計16ウェル)にピペットで入れます。各標準アルブミン濃度の100 μLを同じ96ウェルプレートの各ウェル(合計16ウェルのアルブミン)にピペットで入れます。ブランクとして機能するように複製した100μLポドサイト維持培地(またはポドサイト維持培地の合計2ウェル)にピペットを入れる。
   6. 尿路から同じ96ウェルプレートの各ウェルに100 μLの廃液培地を複製してピペットで入れます。キャピラリーチャネルからの流出培地100 μLを複製したピペット。
   7. プレートをプレートリーダーに挿入し、励起550 nmおよび発光615 nmでのアルブミンの蛍光を測定します。励起513 nmおよび発光577 nmでのイヌリンについて同じプレートを測定します。
   8. 生成されたデータから、重複する測定値を(チップごと)平均します。シート上の残りのデータから、そのプレートの読み取り値に対応する空白値を減算します。
   9. アルブミン標準に対応する値をプロットして、x軸に濃度[μg/mL]、y軸に蛍光の検量線を作成します。イヌリン標準に対応する値をプロットして、x軸に濃度[μg/mL]、y軸に蛍光の検量線を作成します。
   10. 統計解析ソフトウェアパッケージと線形補間を使用して、チップからの流出培地中のイヌリンとアルブミンの尿中濃度をそれぞれ測定します。
   11. 式(1)²を使用して、チップからのイヌリン/アルブミンの尿中クリアランスを決定します。
       尿中クリアランス = ([U] × UV) / [P] (1)
       ここで、[U]はステップ8.1.10からの尿中濃度、UVはステップ8.1.2から収集された尿路排水の量、[P]はイヌリンまたはアルブミン(10μg/mLイヌリンまたは100μg/mLアルブミン)の毛細血管濃度です。
2. 免疫蛍光イメージング
   1. 空のP200チップを尿路と毛細血管チャネルの出口ポートに注入します。細胞を固定するには、200 μLの4%ホルムアルデヒドをピペットで送り、その半分をボトムチャンネルインレットに注入します。インレット内のピペットチップを解放します。
   2. 200μLの4%ホルムアルデヒドをピペットし、その半分を尿路入口に注入します。ピペットチップを入口の内側に放し、チャネルの入口と出口の両方が固定液で満たされたピペットチップに取り付けられるようにします。
   3. チップを室温で20分間インキュベートします。
   4. 20分後、すべてのピペットチップを廃棄します。清潔で空のP200チップを尿路と毛細血管チャネルの出口ポートに注入します。細胞を透過処理するには、200 μLの0.125%Triton X-100/PBSをピペットでピペットし、その半分をキャピラリーチャネル入口に注入します。インレット内のピペットチップを解放します。
   5. 200 μLの0.125%トリトンX-100/PBSをピペットで入れ、その半分を尿路入口に注入します。インレット内のピペットチップを解放します。チップを室温で5分間インキュベートします。
   6. すべてのピペットチップを廃棄します。清潔で空のP200チップを尿路と毛細血管チャネルの出口ポートに注入します。細胞をブロックするには、0.125% Triton X-100/PBS中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)200 μLをピペットで送り、その半分をキャピラリーチャネルインレットに注入します。インレット内のピペットチップを解放します。
   7. 0.125%トリトンX-100/PBS中の1%BSA200 μLをピペットし、その半分を尿路入口に注入します。インレット内のピペットチップを解放します。室温で30分間インキュベートします。
   8. すべてのピペットチップを廃棄します。200 μLの0.125%Triton X-100/PBSを各チャンネルにピペッティングし、室温で5分間インキュベートすることにより、両方のチャンネルを3回洗浄します。
   9. 0.125% Triton X-100/PBSでメーカーが推奨する希釈液で、チャンネルあたり100 μLの一次抗体を調製します。清潔で空のP200チップを尿路と毛細血管チャネルの出口ポートに注入します。一次抗体100 μLをピペットし、それぞれのチャネルに半分を注入します。インレット内のピペットチップを解放します。
   10. 室温で1時間インキュベートするか、より良い結果を得るには、4°Cで一晩インキュベートします。
       注:複数の一次抗体を一度に適用できます。ただし、一次抗体溶液は製造元の指示に従って希釈する必要があります。
   11. 手順3の説明に従って、チャネルを10 x 8.2.8分洗浄します。
   12. 0.125% Triton X-100/PBSでメーカーが推奨する希釈係数で、チャンネルあたり100 μLの二次抗体を調製します。清潔で空のP200チップを尿路と毛細血管チャネルの出口ポートに注入します。100 μLの二次抗体をピペットし、半分をそれぞれのチャンネルに注入します。インレット内のピペットチップを解放します。室温で1時間インキュベートします。
       注:各二次抗体は別々に適用する必要があります。ステップ8.2.8に従って、各アプリケーションの間に少なくとも3 x 10分を洗浄します。
   13. 手順3の説明に従って、チャネルを10 x 8.2.8分洗浄します。
   14. チップ出口ポートの周辺から残留液を吸引しながら、200μLの蒸留水で両方のチャネルを1回フラッシュします。
   15. 清潔で空のP200を尿路と毛細血管チャネルの出口ポートに注入します。細胞を対比染色するには、200 μLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、蒸留水で1:1,000希釈)をピペットで塗布し、その半分をキャピラリーチャネルインレットに注入します。ピペットチップをインレット内に放し、200 μLのDAPIをピペットし、その半分を尿路インレットに注入します。ピペットチップを入口内に放し、室温で5分間インキュベートします。
   16. すべてのピペットチップを廃棄します。清潔で空のP200チップを尿路と毛細血管チャネルの出口ポートに注入します。細胞を対比染色するには、200 μLのファロイジン(^Ca2+ およびMg²⁺を含まないPBSで1:1,000希釈)をピペットし、その半分をキャピラリーチャネルインレットに注入し、ピペットチップをインレット内に放出します。200 μLのファロイジン(^Ca2+ およびMg²⁺を含まないPBSで1:1,000希釈)をピペットし、その半分を尿路入口に注入し、注入口内のピペットチップを解放します。室温で15分間インキュベートします。
   17. ^Ca2+およびMg 2+を含まない200μLのPBSでチャネルを3x洗浄し、出口ポートの周囲から余分な液体を吸引します。
   18. チップを視覚化します。

結果

ここでは、糸球体の機能的な3Din vitroモデルが、ヒトiPS細胞の同質遺伝子源から血管新生および上皮化できることを示しています。具体的には、ヒトiPS細胞技術、特に特殊な細胞型への分化能力を適用して、マイクロ流体デバイスと統合して患者固有のレベルでヒト腎臓の構造と機能をモデル化できる腎糸球体上皮(ポドサイト)と血管内皮(viEC)を生成する方法に関する指示を提供します?...

ディスカッション

本報告では、同質遺伝子ヒトiPS細胞株から血管内皮および糸球体上皮(ポドサイト)を誘導するためのプロトコルと、これらの細胞を使用して、腎臓糸球体の構造、組織-組織界面、および分子ろ過機能を模倣する3D臓器チップシステムを設計する方法について概説します。この糸球体チップには内皮と糸球体上皮が装備されており、これらが一緒になって分子を選択的にろ過するためのバリア?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo/Life Technologies	A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Collagen IV	Thermo/Life Technologies	14-9871-82
Nephrin	Progen	GP-N2
PECAM-1	R&D Systems	AF806
Podocin	Abcam	ab50339
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, Human	Corning	356008	Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment	Iwai North America	N8922012	Basement membrane matrix (2)
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial	BD Biosciences	354277	Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation
Cells
DU11 human iPS cells			The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
2-Mercaptoethanol	Thermo/Life Technologies	21985023
Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate	Thermo/Life Technologies	A23017
All-trans retinoic acid (500 mg)	Stem Cell Technologies	72262
B27 serum-free supplement	Thermo/Life Technologies	17504044
B-27 supplement (50x) without Vitamin A	Thermo/Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418
CHIR99021	Stemgent	04-0004	May show lot-to-lot variation
Complete medium kit with CultureBoost-R	Cell Systems	4Z0-500-R	Podocyte maintenance media
DMEM/F12	Thermo/Life Technologies	12634028
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement	Thermo/Life Technologies	10565042	DMEM/F12 with glutamine
Forskolin (Adenylyl cyclase activator)	Abcam	ab120058
GlutaMAX supplement	Thermo/Life Technologies	35050061	glutamine supplement
Heat-inactivated FBS	Thermo/Life Technologies	10082147
Heparin solution	Stem Cell Technologies	7980
Human Activin A	Thermo/Life Technologies	PHC9544
Human BMP4	Preprotech	120-05ET
Human BMP7	Thermo/Life Technologies	PHC9544
Human VEGF	Thermo/Life Technologies	PHC9394
Inulin-FITC	Sigma-Aldrich	F3272
mTeSR1 medium	Stem Cell Technologies	05850	Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C.
N-2 Supplement (100x)	Thermo/Life Technologies	17502048
Neurobasal media	Thermo/Life Technologies	21103049	Lateral mesoderm basal media
PBS (Phosphate-buffered saline)	Thermo/Life Technologies	14190-250
Penicillin-streptomycin, liquid (100x)	Thermo/Life Technologies	15140-163
ROCK inhibitor (Y27632)	Tocris	1254
StemPro-34 SFM	Thermo/Life Technologies	10639011	Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months.
TGF-Beta inhibitor (SB431542)	Stem Cell Technologies	72234
Enzymes and other reagents
Accutase	Thermo/Life Technologies	A1110501	Cell detachment buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2438
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade	VWR	97065-058
Paraformaldehyde (PFA)	Thermo/Life Technologies	28906
Sterile distilled water	Thermo/Life Technologies	15230162
Triton X-100	VWR	97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05%	Thermo/Life Technologies	25300-120
(Orb) Hub module	Emulate	ORB-HM1
100mm x 15 mm round petri dish	Fisherbrand	FB087579B
120 x 120 mm square cell culture dish	VWR	688161
Accuri C6	BD Biosciences
Aspirating pipettes, individually wrapped	Corning	29442-462
Aspirating Unit	SP Bel-Art	F19917-0150
Avanti J-15R Centrifuge	Beckman Coulter	B99516
Conical centrifuge tube, 15 mL	Corning	352097
Conical centrifuge tube, 50 mL	Corning	352098
EVOS M7000	Thermo/Life Technologies	AMF7000	Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.
Hemocytometer	VWR	100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo/Life Technologies	51030403
Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera	Carl Zeiss Micrscopy	491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)
Kimberly-Clark nitrile gloves	VWR	40101-346
Kimwipes, large	VWR	21905-049
Leoca SP8 Upright Confocal Microscope
Media reservoir (POD Portable Module)	Emulate	POD-1
Microplate shaker	VWR	12620-926
Organ-chip	Emulate	S-1 Chip
Organ-chip holder	Emulate	AK-CCR
P10 precision barrier pipette tips	Denville Scientific	P1096-FR
P100 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1125
P1000 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1121
P20 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1122
P200 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1122
Plasma Asher	Quorum tech	K1050X RF	This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).
Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap	Corning	352235
Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped	Corning	356551
Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped	Corning	356525
Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped	Corning	356543
Steriflip, 0.22 µm, PES	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile Microcentrifuge tubes	Thomas Scientific	1138W14
T75cm2 cell culture flask with vent cap	Corning	430641U
Tissue culture-treated 12 well plates	Corning	353043
Tissue culture-treated 6 well plates	Corning	353046
Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module)	Emulate	ZOE-CM1	Organ Chip Bioreactor
VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated	Miltenyi Biotec	130-126-010
Wide-beveled cell lifter	Corning	3008
MACS
CD144 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-097-857
CD31 MicroBead Kit, human	Miltenyi Biotec	130-091-935
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401