Chip de glomérulo renal isogênico projetado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo para projetar um sistema personalizado de organ-on-a-chip que recapitula a estrutura e a função da barreira de filtração glomerular renal, integrando células endoteliais epiteliais e vasculares geneticamente combinadas diferenciadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Este sistema de bioengenharia pode avançar a medicina de precisão renal e aplicações relacionadas.

Resumo

A doença renal crônica (DRC) afeta 15% da população adulta dos EUA, mas o estabelecimento de terapias direcionadas tem sido limitado pela falta de modelos funcionais que possam prever com precisão as respostas biológicas humanas e a nefrotoxicidade. Os avanços na medicina de precisão renal podem ajudar a superar essas limitações. No entanto, modelos in vitro previamente estabelecidos do glomérulo renal humano - o local primário para a filtração do sangue e um alvo-chave de muitas doenças e toxicidades de drogas - normalmente empregam populações celulares heterogêneas com características funcionais limitadas e antecedentes genéticos incomparáveis. Essas características limitam significativamente sua aplicação para modelagem de doenças específicas do paciente e descoberta terapêutica.

Este trabalho apresenta um protocolo que integra o epitélio glomerular derivado de células-tronco pluripotente induzido por humanos (iPS) (podócitos) e endotélio vascular de um único paciente para projetar um chip de glomérulo renal microfluídico isogênico e vascularizado. O chip glomérulo resultante é composto de camadas de células endoteliais e epiteliais derivadas de células-tronco que expressam marcadores específicos de linhagem, produzem proteínas da membrana basal e formam uma interface tecido-tecido semelhante à barreira de filtração glomerular do rim. O chip de glomérulo modificado filtra seletivamente moléculas e recapitula a lesão renal induzida por drogas. A capacidade de reconstituir a estrutura e a função do glomérulo renal usando tipos de células isogênicas cria a oportunidade de modelar a doença renal com a especificidade do paciente e avançar a utilidade de órgãos em chips para medicina de precisão renal e aplicações relacionadas.

Introdução

Os dispositivos organ-on-a-chip são modelos dinâmicos 3D in vitro que empregam estimulação molecular e mecânica, bem como vascularização, para formar interfaces tecido-tecido que modelam a estrutura e a função de órgãos específicos. Dispositivos organ-on-a-chip previamente estabelecidos que visavam recapitular o glomérulo do rim (chips de glomérulo) consistiam em linhagens celulares animais¹ ou linhagens celulares primárias e imortalizadas humanas de fontes heterogêneas ^2,3. O uso de fontes celulares geneticamente heterogêneas apresenta variações que limitam significativamente os estudos de respostas específicas do paciente e genética ou mecanismos da doença ^4,5. Enfrentar esse desafio depende da disponibilidade de linhagens celulares isogênicas originárias de indivíduos específicos com perfis moleculares e genéticos preservados para fornecer um microambiente mais preciso para a engenharia de modelos in vitro ^2,3,6. Linhagens celulares isogênicas de origem humana agora podem ser facilmente geradas devido aos avanços na cultura de células iPS humanas. Como as células iPS humanas são tipicamente de origem não invasiva, podem se auto-renovar indefinidamente e se diferenciar em quase qualquer tipo de célula, elas servem como uma fonte atraente de células para o estabelecimento de modelos in vitro, como o chip glomérulo ^7,8. A barreira de filtração glomerular é o principal local para a filtração do sangue. O sangue é primeiro filtrado através do endotélio vascular, da membrana basal glomerular e, finalmente, através do epitélio especializado chamado podócitos. Todos os três componentes da barreira de filtração contribuem para a filtração seletiva de moléculas. Apresentamos aqui um protocolo para estabelecer um dispositivo organ-on-a-chip em interface com endotélio vascular e epitélio glomerular a partir de uma única fonte de célula iPS humana. Embora este protocolo seja especialmente útil para projetar um chip isogênico e vascularizado para recapitular a barreira de filtração glomerular, ele também fornece um modelo para o desenvolvimento de outros tipos de órgãos personalizados em chips e plataformas multi-órgãos, como um sistema isogênico "corpo-em-um-chip".

O protocolo aqui descrito começa com a diferenciação divergente de células iPS humanas em duas linhagens separadas - mesoderma lateral e mesoderma, que são posteriormente diferenciadas em endotélio vascular e epitélio glomerular, respectivamente. Para gerar células mesodérmicas laterais, as células iPS humanas foram semeadas em placas revestidas de matriz de membrana basal 1 e cultivadas por 3 dias (sem troca de mídia) em meio N2B27 suplementado com o ativador Wnt, CHIR 99021, e o potente indutor mesodérmico, osso-morfogenético 4 (BMP4). As células mesodérmicas laterais resultantes foram previamente caracterizadas pela expressão de braquiúria (T), homeobox pareada mista (MIXL) e eomesodermina (EOMES)⁹. Posteriormente, as células mesodérmicas laterais foram cultivadas por 4 dias em meio suplementado com VEGF165 e Forskolin para induzir células endoteliais vasculares que foram classificadas com base na expressão de VE-Caderrina e/ou PECAM-1 usando classificação celular ativada por magnetismo (MACS). As células endoteliais vasculares resultantes (viEC) foram expandidas cultivando-as em frascos de matriz de membrana basal de 3 revestimentos até estarem prontas para semear no dispositivo microfluídico.

Para gerar células mesodérmicas, células iPS humanas foram semeadas em placas revestidas de 2 placas revestidas de matriz de membrana basal e cultivadas por 2 dias em meio contendo Activin A e CHIR99021. As células mesodérmicas resultantes foram caracterizadas pela expressão de HAND1, goosecoid e brachury (T), conforme descrito anteriormente 2,10,11. Para induzir a diferenciação celular do mesoderma intermediário (IM), as células mesodérmicas foram cultivadas por 14 dias em meio suplementado com BMP-7 e CHIR99021. As células IM resultantes expressam o Tumor de Wilm 1 (WT1), o gene caixa emparelhada 2 (PAX2) e a proteína relacionada 1 (OSR-1)2,10,11.

Um chip microfluídico à base de polidimetilsiloxano (PDMS) de dois canais foi projetado para recapitular a estrutura da barreira de filtração glomerular in vitro. O canal urinário é de 1.000 μm x 1.000 μm (a x h) e a dimensão do canal capilar é de 1.000 μm x 200 μm (a x h). Os ciclos cíclicos de alongamento e relaxamento foram facilitados pelas câmaras ocas presentes em cada lado dos canais fluídicos. As células foram semeadas em uma membrana PDMS flexível (50 μm de espessura) que separa os canais urinário e capilar. A membrana é equipada com poros hexagonais (7 μm de diâmetro, 40 μm de distância) para ajudar a promover a sinalização intercelular (Figura 1A)^2,12. Dois dias antes da indução do MI ser concluída, os cavacos microfluídicos foram revestidos com matriz de membrana basal 2. viECs foram semeados no canal capilar do chip microfluídico usando meio de Manutenção Endotelial 1 dia antes da indução IM ser concluída, e o chip foi virado de cabeça para baixo para permitir a adesão celular no lado basal da membrana PDMS revestida de ECM. No dia em que a indução do IM foi concluída, as células foram semeadas no canal urinário do chip microfluídico usando um meio suplementado com BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165 e todo o ácido retinóico trans para induzir a diferenciação de podócitos dentro do chip. No dia seguinte, os reservatórios do meio foram preenchidos com meio de Indução de Podócito e meio de Manutenção Endotelial, e 10% de deformação mecânica a 0,4 Hz e fluxo de fluido (60 μL/h) foram aplicados aos chips.

Os chips microfluídicos celularizados foram cultivados por mais 5 dias utilizando meio de Indução de Podócito (no canal urinário) e meio de Manutenção Endotelial (no canal vascular). Os chips de glomérulo renal resultantes foram cultivados por até 7 dias adicionais em meios de manutenção para as células podócitas e endoteliais. Os podócitos diferenciados expressaram positivamente proteínas específicas da linhagem, incluindo podocina e nefrina 13,14, enquanto os viECs expressaram positivamente as proteínas de identificação de linhagem PECAM-1 e VE-Caderina, todas moléculas essenciais para a manutenção da integridade da barreira de filtração glomerular ^15,16 . Verificou-se que os podócitos e os viECs secretam a proteína da membrana basal glomerular mais abundante, o colágeno IV, que também é importante para a maturação e função do tecido.

Descobriu-se que o sistema de três componentes da barreira de filtração - endotélio, membrana basal e epitélio - nos chips de glomérulo filtrava seletivamente as moléculas e respondia a um tratamento medicamentoso nefrotóxico quimioterápico. Os resultados do tratamento medicamentoso indicaram que o chip de glomérulo pode ser usado para estudos de nefrotoxicidade e para modelagem de doenças. Este protocolo fornece a diretriz geral para a engenharia de um chip funcional de glomérulo renal microfluídico a partir de derivados isogênicos de células iPS. Análises a jusante do chip de engenharia podem ser realizadas conforme desejado pelo pesquisador. Para obter mais informações sobre o uso do chip glomérulo para modelar a lesão glomerular induzida por medicamentos, consulte publicações anteriores ^2,12.

Protocolo

1. Preparar soluções de matriz de membrana basal e substratos revestidos

1. Descongelar a matriz da membrana basal 1 durante a noite sobre gelo a 4 °C. Alíquota de acordo com a sugestão do fabricante para a razão de diluição. Usando um tubo cônico de 50 mL e pipeta, misture cuidadosamente uma quantidade apropriada de matriz de membrana basal 1 em 25 mL de DMEM/F12 frio até descongelar completamente e dissolver.
   1. Para dissolver uma alíquota congelada, tome ~200 μL dos 25 mL de DMEM/F12 frio e transfira-o para o tubo de alíquota congelado. Pipetar para cima e para baixo até que a matriz esteja completamente descongelada e dissolvida. Transfira todo o conteúdo do tubo da matriz de membrana basal 1 para o resto do DMEM/F12 frio.
2. Pipetar 1 mL de matriz de membrana basal 1 solução para cada poço de uma placa de 6 poços. Para utilizar as placas revestidas no mesmo dia, incubar a 37 °C durante 2 h.
   1. Alternativamente, as placas revestidas podem ser embaladas com parafilme e armazenadas a 4 °C por até 2 semanas. Quando estiver pronta a utilizar a placa armazenada, incubar a 37 °C durante 30 min.
3. Diluir a matriz da membrana basal 2 em 9 mL de água destilada estéril para atingir uma concentração final de 5 μg/mL. Pipetar 700 μL de solução de matriz de membrana basal 2 em cada poço de uma placa de 12 poços. Envolver as placas revestidas de 2 placas revestidas da matriz da membrana basal com parafilme e conservar a 4 °C durante um período máximo de 2 semanas.
4. Reconstituir a matriz de membrana basal liofilizada 3 para atingir uma concentração final de 1 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS, Ca+2 e Mg^+2-livre), conforme sugerido pelo fabricante. Diluir uma alíquota de 250 μL até uma concentração final de 25 μg/mL em 9,75 mL de PBS (livre de Ca+2 e Mg⁺²). Utilizar 6 ml desta solução para revestir um balão de T75 (uma concentração final de 2 μg/cm²). Conservar os balões revestidos de matriz a 4 °C durante um período máximo de 1 semana.

2. Cultura de células iPS humanas

NOTA: A linha DU11 utilizada neste protocolo foi testada e mostrou-se livre de anormalidades de micoplasma e cariótipo.

1. Incubar placas de 1 revestimento da matriz de membrana basal a 37°C por 1-2 h.
2. Lave cada poço da placa de 6 poços 3x com 1 mL de DMEM/F12 morno (37 °C). Adicionar 2 mL de meio de cultura de células iPS humanas (MCC) (Tabela Suplementar S1) a cada poço da placa de 6 poços. Incubar as placas a 37 °C enquanto as células estão a ser preparadas para a semeadura, conforme descrito a seguir.
3. Lave cada poço da placa de 6 poços contendo células iPS humanas com 1 mL de DMEM/F12 quente.
4. Aspirar o DMEM/F12. Adicione 1 mL de tampão de descolamento de células quentes a cada poço da placa de 6 poços. Incubar a 37 °C durante 1 min.
5. Inspecione visualmente cada poço sob um microscópio para dissociação ao redor das bordas da colônia celular. Aspirar cuidadosamente o tampão de descolamento celular das células. Lave suavemente cada poço com 1 mL de DMEM/F12 morno.
6. Inspecione as placas sob o microscópio para garantir que as células não se separaram completamente da placa ou foram acidentalmente aspiradas.
7. Adicione 3 mL de iPS CCM humano quente a cada poço da placa de 6 poços com células. Usando um elevador de células, raspe suavemente as colônias. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, misture suavemente a suspensão celular em cada poço para cima e para baixo uma vez.
8. Retire a nova placa revestida de matriz de membrana basal 1 da incubadora. Transfira 0,5 mL da suspensão celular para cada poço da nova placa revestida de 1 matriz de membrana basal. Mova a placa em um movimento de figura de oito para distribuir as células uniformemente. Incubar a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5%.
9. Aspirar o meio gasto e substituir por 3 mL de iPS CCM humano todos os dias de cultura até que as células estejam 70% confluentes (aproximadamente 4 dias após a passagem).

3. Dias 0-16: diferenciação de iPSCs humanas em células mesodérmicas intermediárias

1. Dias 0-2: indução mesodérmica
   1. Mover as placas revestidas de 2 revestimentos da matriz de membrana basal de 4 °C para a temperatura ambiente durante 2 h para se equilibrar após o armazenamento.
   2. Aspirar o meio gasto de cada poço da placa de 6 poços contendo aproximadamente 70% de células iPS humanas confluentes. Lave suavemente as células 3x com 1 mL de DMEM/F12 morno.
   3. Aspirar o DMEM/F12. Adicione 1 mL de tampão de descolamento celular a cada poço da placa de 6 poços de células iPS humanas. Incubar a 37 °C durante 5-7 min.
   4. Inspecione visualmente cada poço sob um microscópio para dissociação ao redor das bordas da colônia celular. Usando um elevador de células, raspe suavemente as colônias.
   5. Transfira as suspensões celulares de todos os poços da placa de 6 poços para um tubo cônico de 15 mL e use um P1000 para pipetar para cima e para baixo várias vezes para obter uma suspensão unicelular das células iPS.
   6. Encher a suspensão celular no tubo cônico até 14 mL com DMEM/F12. Centrífuga durante 5 min a 200 × g à temperatura ambiente.
   7. Aspirar o sobrenadante. Ressuscite o pellet celular em 14 mL de DMEM/F12 morno. Repetir a centrifugação durante 5 min a 200 × g à temperatura ambiente.
   8. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL de meio de Indução Mesodérmica (Tabela Suplementar S1). Conte as células usando um hemocitômetro. Diluir em meio de indução mesoderma para atingir uma concentração final de 1 × 10⁵ células/mL.
   9. Aspirar o revestimento da matriz de membrana basal 2-placa revestida. Enxaguar cada poço da matriz de membrana basal 2-placa revestida 2x com 1 mL de DMEM/F12 morno.
   10. Pipete suavemente a suspensão da célula para cima e para baixo 2x. Transfira 1 mL da suspensão celular para cada poço da matriz de membrana basal com placa revestida com 2 revestimentos. Mova suavemente a placa em um movimento de figura de oito para distribuir as células uniformemente.
   11. Incubar a placa a 37 °C durante a noite. No dia seguinte (dia 1), aspirar o meio gasto de cada poço da placa de 12 poços. Substitua por 1 mL de meio quente de indução mesodérmica. Incubar a 37 °C durante a noite.
2. Dias 2-16: indução mesodérmica intermediária
   1. Aspirar o meio de indução mesodérmica gasto. Substitua por 1m L de meio de indução mesodérmica intermediário quente (Tabela Suplementar S1). Aspirar o meio gasto e substituir por 1 mL de meio quente de Indução Intermediária de Mesoderma todos os dias durante 14 dias.

4. Dias 0-15: diferenciação e expansão de iPSCs humanas em células endoteliais vasculares

1. Dia 0: semeadura de células iPS humanas
   1. Preparar 15 mL de iPS CCM humano com inibidor de ROCK (Tabela Suplementar S1). Manter aquecido a 37 °C.
   2. Incubar uma matriz de membrana basal 1-placa revestida por 1-2 h a 37 °C. Aspirar a matriz da membrana basal 1. Lave 3x com 1 mL de DMEM/F12 morno.
   3. Aspirar o DMEM/F12. Adicione 2 mL de iPS CCM humano com inibidor de ROCK a cada poço da placa de 6 poços. Incubar as placas a 37 °C enquanto as células estão a ser preparadas para a semeadura, conforme descrito abaixo.
   4. Aspirar o meio gasto de cada poço da placa de 6 poços contendo aproximadamente 70% de células iPS humanas confluentes. Lave suavemente as células 3x com 1 mL de DMEM/F12 morno.
   5. Aspirar o DMEM/F12. Adicione 1 mL de tampão de descolamento celular a cada poço da placa de 6 poços de células iPS humanas. Incubar a 37 °C durante 5-7 min para dissociar as células em células únicas.
      NOTA: Devido às diferenças inerentes entre as linhas celulares iPS, o usuário precisará inspecionar visualmente as células após 5 minutos para determinar o tempo de incubação ideal.
   6. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Levar a suspensão celular até 14 ml com DMEM/F12 quente para neutralizar o tampão de descolamento. Centrífuga durante 5 min a 200× g à temperatura ambiente.
   7. Aspirar suavemente o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL de CCM iPS humano com inibidor de ROCK. Conte o número total de células usando um hemocitômetro.
   8. Semeia as células entre 37.000 a 47.000 células/cm² (355.200 a 451.200 células/poço de uma placa de 6 poços). Incubar a 37 °C durante a noite.
      NOTA: Devido às diferenças inerentes entre as linhas celulares iPS, o usuário precisará determinar a densidade de semeadura ideal.
2. Dias 1-3: indução do mesoderma lateral
   1. No dia seguinte (dia 1), aspirar o meio gasto de cada poço da placa de 6 poços de células iPS humanas. Substitua cada poço da placa de 6 poços por 5 mL de meio de indução mesodérmica lateral (Tabela Suplementar S1). Ao aumentar a escala do vaso de cultura (por exemplo, frascos), geralmente, substitua por 3x o volume de trabalho no vaso de cultura.
   2. Não altere este meio por 3 dias.
      NOTA: O meio de indução lateral do mesoderma nos poços normalmente mudará de cor de vermelho para amarelo à medida que as células usam os nutrientes. No entanto, o meio turvo ou meio com crescimento bacteriano não é normal e deve ser descontaminado e descartado como tal.
3. Dias 4-6: indução de células endoteliais
   1. Aspirar o meio gasto de cada poço da placa de 6 poços. Substitua cada poço da placa de 6 poços por 3 mL de meio de Indução Endotelial quente (Tabela Suplementar S1). Incubar a placa a 37 °C durante a noite.
   2. Para os 2 dias seguintes (dias 5 e 6), colete o meio gasto de todos os poços em um tubo cônico de 50 mL. Conservar o tubo cónico a 4 °C. Reabasteça as células com 3 mL de meio de Indução Endotelial quente. Incubar a placa a 37 °C.
4. Dia 7: classificação das células endoteliais (viEC)
   1. Retire a matriz da membrana basal de 3 frascos e deixe à temperatura ambiente durante 1 h.
   2. Preparar 50 mL de tampão MACS (Tabela Suplementar S1).
   3. Coloque o tampão de descolamento celular, o tampão MACS, o CCM endotelial e o PBS (livre de Ca 2⁺ e Mg² +) no gelo no exaustor de cultura de tecidos.
   4. Coloque o ímã no suporte MACS. Coloque dois tubos cônicos de 50 mL e um tubo cônico de 15 mL em um suporte de tubo cônico.
   5. Coloque o suporte MACS (com ímã ligado) e uma coluna LS no exaustor de cultura de tecidos. Configure o suporte do tubo cônico (com tubos cônicos dentro) no suporte MACS, abaixo do ímã (Figura suplementar S1A).
   6. Recolher o meio gasto de cada poço da placa de 6 poços para o tubo cónico de 50 ml a partir do passo 4.3.2. Lave cada poço da placa de 6 poços com PBS (Ca 2+ e Mg²⁺ livre).
   7. Aspirar o PBS. Adicionar 1 mL de tampão de descolamento celular. Incubar a 37 °C durante 5-7 min para dissociar totalmente as células.
   8. Transfira as células para um tubo cônico de 50 mL. Levar a suspensão celular a 15 ml com CCM endotelial frio. Centrífuga a 200 × g durante 5 min à temperatura ambiente.
   9. Aspirar o sobrenadante. Ressuspeite as células em 1 mL de tampão MACS frio. Conte as células com um hemocitômetro.
   10. Adicione 10 mL de tampão MACS à suspensão celular. Centrifugar durante 5 min a 200 × g à temperatura ambiente.
   11. Aspirar o sobrenadante. Ressuspenda as células em 80 μL de tampão MACS por 10 milhões de células. Adicione 20 μL por 10 milhões de células de Reagente Bloqueador FcR, microesferas CD31 e microesferas CD144. Incubar por 15 min no gelo.
   12. Enquanto a suspensão celular estiver incubando, centrifugar o meio coletado da indução endotelial (etapa 4.3.2) a 200 × g por 10 min.
   13. Recolher o sobrenadante num filtro de vácuo de 500 ml 0,22 μm. Preparar o meio Endotelial Condicionado (Tabela Suplementar S1). Filtrar o meio em condições estéreis e mantê-lo quente a 37 °C.
       NOTA: A taxa de proliferação de células endoteliais começará a diminuir após a passagem 3. Para alcançar o crescimento exponencial após a passagem 3, o meio endotelial condicionado e de manutenção pode ser suplementado com inibidor de TGF-Beta de 10 μM (SB431542) a partir da passagem 1.
   14. Após a incubação de 15 minutos na etapa 4.4.11, adicionar 10 mL de tampão MACS por 10 milhões de células (máximo de 30 mL de tampão MACS) à suspensão celular. Centrífuga a 200 × g durante 5 min.
   15. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender em 1 mL de tampão MACS.
   16. Pegue a coluna LS e puxe o êmbolo para fora da seringa. Coloque o êmbolo de volta na manga de plástico. Coloque a coluna sobre o ímã.
   17. Posicione o primeiro tubo cônico de 50 mL sob a coluna. Adicione 1 mL de buffer MACS à coluna. Recolher no tubo cónico de 50 ml por baixo.
   18. Deixe o líquido fluir, embora não completamente para evitar que a coluna seque. Quando as gotas de líquido começarem a escorrer lentamente, adicione a suspensão celular à coluna. Recolher o caudal no mesmo tubo cónico de 50 ml.
   19. Quando as gotas de líquido começarem a escorrer lentamente, posicione o próximo tubo cônico de 50 mL sob a coluna. Adicione o fluxo inicial (etapa 4.4.18) à coluna. Recolher no tubo cónico de 50 ml por baixo.
   20. Quando as gotas de líquido começarem a escorrer lentamente, adicione 500 μL de tampão MACS 3x para lavar a coluna.
   21. Remova a coluna do ímã. Coloque a coluna no tubo cônico de 15 mL. Adicione 1 mL de PBS frio à coluna.
   22. Para coletar as células, pegue o êmbolo da manga de plástico e empurre-o firmemente para dentro da coluna.
   23. Conte as células usando um hemocitômetro. Levar a suspensão celular a 5 ml com PBS. Centrífuga por 5 min a 200 × g.
   24. Enquanto as células estão sendo submetidas à centrifugação, lave o frasco 3-revestido da matriz da membrana basal 3x com 5 mL de PBS para se preparar para a semeadura celular. Aspirar o PBS e adicionar 20 mL de meio condicionado endotelial ao frasco de 3 revestimentos da matriz da membrana basal.
   25. Remova as células da centrífuga e aspirar o sobrenadante. Resuspender as células em meio condicionado endotelial a semear a 26.000 células/cm² (1,95 × 10⁶ células/frasco T75). Semeie as células.
   26. Para calcular a eficiência de classificação e o rendimento de células, divida a contagem de células da etapa 4.4.23 pela contagem de células da etapa 4.4.9.
5. Dias 8-15: expansão dos viECs
   1. No dia seguinte (dia 8), aspirar o meio gasto do frasco. Substitua por 10 mL de meio Endotelial Condicionado. Substitua o meio condicionado endotelial em dias alternados até que o balão esteja 90% confluente ou até que o frasco médio condicionado endotelial seja completamente utilizado.
   2. Aspirar o meio gasto e substituir por 10 mL de meio de Manutenção Endotelial (Tabela Suplementar S1) em dias alternados para expansão contínua.
   3. Para a passagem dos viECs, preparar dois frascos T75 de matriz de membrana basal com 3 revestimentos. Deixar os frascos à temperatura ambiente durante 1 h. Lavar bem os frascos acabados de preparar 3x com 5 ml de PBS.
   4. Aspirar o PBS. Adicionar 10 ml de meio quente de Manutenção Endotelial a cada balão acabado de preparar. Incubar as placas a 37 °C enquanto as células estão a ser preparadas para a semeadura, conforme descrito abaixo.
   5. Adicionar 5 ml de tampão de descolamento celular a um balão T75 90% confluente de viECs. Incubar a 37 °C durante 5-7 min. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Adicione 5 mL de DMEM/F12 morno. Centrífuga a 200 × g por 5 min.
   6. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender em 1 mL de meio de Manutenção Endotelial quente. Adicionar 500 μL da suspensão celular a cada um dos balões T75 preparados na hora.
   7. No dia seguinte, aspirar o meio gasto. Substitua por 10 mL de meio de Manutenção Endotelial. Aspirar o meio gasto e substituir por 10 mL de meio de Manutenção Endotelial em dias alternados até que o balão esteja 90% confluente.

5. Dia 14: preparação de dispositivos de chip de órgão microfluídico para cultura de células

1. Tratamento a plasma e revestimento de matriz de membrana basal 2
   1. Preparar a solução de matriz de membrana basal 2 (passo 1.3). Deixe-o de lado.
   2. Em um exaustor de cultura de tecidos estéril, desembale a placa de Petri redonda estéril de 100 mm x 15 mm. Coloque a placa de Petri no topo, virada para baixo, sob a parte inferior da placa de Petri (Figura suplementar S1B).
   3. Usando uma pinça, retire os chips microfluídicos da embalagem e coloque-os dentro da placa de Petri. Feche a placa de Petri usando a tampa por baixo do prato.
   4. No monitor de plasma, coloque a tampa da placa de Petri sob o prato, de cima para baixo, mantendo-os juntos como uma unidade. Coloque a unidade de placa de Petri na câmara de asher de plasma. Inicie o asher de plasma com oxigênio a 100 W, 15 SCCM, 30 s.
   5. Sensível ao tempo: Uma vez que o tratamento esteja completo, retire a unidade de placa de Petri do asher de plasma. Limpe rápida e levemente a tampa da placa de Petri com etanol a 70% pulverizado em uma toalha de laboratório. Cubra a placa de Petri com a tampa.
   6. Traga a placa de Petri para o capuz de cultura de tecidos estéreis. Adicione suavemente 25 μL de solução de matriz de membrana basal 2 no canal urinário (superior) do chip. Adicionar 20 μL de solução de matriz de membrana basal 2 no canal capilar (inferior) do chip.
   7. Pegue duas tampas de tubo cônico estéreis de 15 mL e encha-as com água destilada estéril (~500 μL). Coloque a tampa na placa de Petri para evitar que os canais de cavacos e a membrana sequem. Coloque a tampa no prato. Incubar a 37 °C durante a noite.

6. Semeadura de viECs e células mesodérmicas intermediárias nos dispositivos microfluídicos

1. Dia 15: viECs
   1. Aspirar o meio a partir de frascos de T75 contendo viECs 90% confluentes. Adicionar 5 ml de tampão de descolamento celular e incubar a 37 °C durante 5-7 min.
   2. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Adicione 5 mL de DMEM/F12. Centrífuga a 200 × g durante 5 min.
      NOTA: Cada balão T75 com viECs aproximadamente 90% confluentes produzirá ~3 milhões de células.
   3. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 300 μL de meio de Manutenção Endotelial para obter aproximadamente 2 milhões de células/300 μL. Conte as células com um hemocitômetro. Deixe a suspensão da célula de lado.
   4. Transfira a placa de Petri contendo os chips microfluídicos para o capuz de cultura de tecidos. Anexe uma ponta de barreira P200 à ponta de um aspirador.
   5. Lave os canais superior e inferior do chip microfluídico com 200 μL de DMEM/F12 enquanto aspira simultaneamente a periferia da saída.
   6. Segure o chip firmemente com a ponta de barreira P200 presa ao aspirador, longe da saída do canal inferior. Injete firmemente 20 μL da suspensão viEC com aproximadamente 134.000 células no canal capilar (inferior) do chip. Aspirar cuidadosamente o meio da periferia da tomada.
   7. Verifique sob o microscópio se há bolhas ou uma densidade de semeadura viEC desigual.
   8. Vire suavemente o chip para invertê-lo de modo que os viECs possam aderir ao lado basal da membrana PDMS flexível. Coloque o chip no cartucho do suporte. Adicione 3 mL de PBS no cartucho do suporte do chip para evitar que a membrana seque. Incubar o cavaco a 37 °C durante 3 h.
   9. Verifique o canal inferior sob o microscópio para uma camada confluente de viECs ligados à membrana PDMS flexível. Solte 200 μL de meio de Manutenção Endotelial na entrada do canal inferior e permita que ele flua através do canal para lavar o canal de células endoteliais desanexadas enquanto aspira cuidadosamente da periferia da saída do canal capilar (inferior).
   10. Substitua o chip de volta ao cartucho do suporte. Incubar a 37 °C durante a noite.
2. Dia 16: células mesodérmicas intermediárias (IM)
   1. Lave suavemente o canal capilar (inferior) com 200 μL de meio de Manutenção Endotelial enquanto aspira cuidadosamente a periferia da porta de saída.
   2. Lave o canal urinário (superior) com 200 μL de DMEM/F12 enquanto aspira cuidadosamente a periferia da tomada. Solte ~50 μL de DMEM/F12 nas portas de entrada e saída.
   3. Aspirar o meio de Indução Mesodérmica Intermediária de cada poço da placa de 12 poços.
      NOTA: Cada poço no final da diferenciação dá aproximadamente 1,5 milhões de células IM.
   4. Adicionar 1 ml de tripsina-EDTA a cada alvéolo da placa de 12 poços e incubar a 37 °C durante 5 minutos.
   5. Raspe suavemente as células usando um elevador de células e pipete para cima e para baixo para dissociar as células usando um P1000. Adicione 2 mL de solução de neutralização de tripsina (Tabela Suplementar S1) a cada poço. Transfira as células para um tubo cônico de 50 mL. Levar o volume de suspensão celular para 50 mL com DMEM/F12 e centrifugar a 200 × g por 5 min.
   6. Aspirar o sobrenadante. Resuspender as células em 500 μL de meio de Indução Mesodérmica Intermediária para obter aproximadamente 3 milhões de células/500 μL. Conte as células com um hemocitômetro.
   7. Segure o chip firmemente com a ponta de barreira P200 presa ao aspirador, longe da saída do canal urinário (superior). Injete firmemente 25 μL de suspensão celular com aproximadamente 112.500 células IM no canal urinário (superior) do chip e aspirar cuidadosamente o meio da periferia da saída.
   8. Verifique sob o microscópio se há bolhas ou uma densidade de semeadura de células IM irregular. Adicione 3 mL de PBS no cartucho do suporte do chip. Incubar a 37 °C durante 3 h.
   9. Lave ambos os canais com 200 μL de seu respectivo meio de cultura celular enquanto aspira cuidadosamente a periferia das saídas de cavaco para ajudar a evitar o fluxo para trás do meio gasto e dos detritos celulares.
   10. Fixe as pontas de barreira P200 vazias em ambas as saídas dos canais urinário e capilar. Pipetar 200 μL de meio de Manutenção Endotelial e injetar metade dele na entrada do canal capilar. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada de tal forma que tanto a entrada quanto a saída do canal estejam agora presas às pontas da pipeta cheias de meio.
   11. Pipetar 200 μL de meio de manutenção IM e injetar metade na entrada do canal urinário. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada de tal forma que tanto a entrada quanto a saída do canal estejam agora presas às pontas da pipeta cheias de meio. Incubar os cavacos com pontas embutidas a 37 °C durante a noite.
3. Conecte os chips ao Biorreator de Chip de Órgão para aplicar o fluxo de fluido e a tensão mecânica.
   1. Remova as pontas do P200 dos canais urinário e capilar. Adicione gotículas dos respectivos meios à entrada e saída dos canais urinário e capilar para evitar a secagem.
   2. Adicionar 3 mL de meio quente de indução de podócitos (Tabela Suplementar S1) ao reservatório de entrada urinária. Adicionar 3 mL de meio de Manutenção Endotelial quente ao reservatório de entrada capilar.
   3. Adicione 300 μL de meio quente de indução de podócitos ao reservatório de saída do canal urinário diretamente sobre a porta de saída. Adicione 300 μL de meio de Manutenção Endotelial quente ao reservatório de saída do canal capilar diretamente sobre a porta de saída.
   4. Deslize as cápsulas para a bandeja e para o Biorreator de Chip de Órgão.
   5. Use o mostrador rotativo no biorreator do chip de órgão para selecionar e iniciar o ciclo primário (2 min). Inspecione visualmente a parte inferior do pod em busca de pequenas gotículas em todas as quatro portas fluídicas.
   6. Para obter contato fluido-fluido entre a parte inferior do Pod e as portas do chip microfluídico, deslize suavemente o portador do chip para o Pod. Pressione suavemente a aba do portador do chip para dentro e para cima. Aspirar o excesso de meio da superfície do chip.
   7. Defina a vazão do Biorreator Organ Chip para 60 μL/h. Defina a deformação cíclica para 10% a 0,4 Hz. Use o Mostrador Rotativo no Biorreator do Chip de Órgão para selecionar o Ciclo de Regulação e funcionar por 2 h.
   8. Inspecione visualmente os reservatórios de saída para um aumento no nível do meio.
   9. Use o mostrador rotativo no Biorreator de Chip de Órgão para selecionar o ciclo Regular.

7. Dias 17-21 e além: indução de podócitos e manutenção de cavacos

1. Aspirar o meio dos reservatórios de saída do canal urinário diagonalmente longe do porto, mas manter algum meio no reservatório todos os dias de cultura. Reabasteça o reservatório de entrada do canal urinário com até 3 mL de meio de indução de podócitos a cada 2 dias durante 5 dias.
   1. Após 5 dias, aspirar o meio do canal urinário, mas manter algum meio no reservatório. Reabasteça o reservatório de entrada do canal urinário diariamente com 3 mL de meio de Manutenção de Podocitos.
2. Aspirar o meio dos reservatórios de saída do canal capilar diagonalmente longe do porto, mas manter algum meio no reservatório todos os dias de cultura. Reabastecer o reservatório de entrada do canal capilar diariamente com até 3 mL de meio de Manutenção Endotelial.

8. Ensaio funcional e imagem de imunofluorescência

NOTA: Consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter detalhes sobre a análise de citometria de fluxo, ELISA para efluentes de chip e isolamento de mRNA.

1. Ensaio funcional (filtração molecular) utilizando inulina e albumina
   1. Aspirar o meio do reservatório de saída do canal capilar diagonalmente longe do porto, mas manter algum meio no reservatório. Substitua por 3 mL de meio de Manutenção Endotelial suplementado com inulina e albumina (Tabela Suplementar S1) por 6 h.
   2. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, meça o volume (em mL) do meio do canal urinário e transfira para um tubo cônico de 15 mL. Envolva o tubo em papel alumínio para proteger da luz e minimizar o fotobranqueamento da inulina e albumina conjugadas com fluoróforos. Reabastecer o reservatório com 3 mL de meio de Manutenção de Podocitos.
   3. Preparar uma solução-mãe de inulina em meio de manutenção de podócitos. A partir de 25 μg/mL de Inulina, prepare oito padrões de inulina através de uma diluição seriada de 2x em meio de Manutenção de Podocitos.
   4. Da mesma forma, prepare uma solução de estoque de albumina em meio de manutenção de podócitos. A partir de 150 μg/mL de albumina, prepare oito padrões de albumina através de uma diluição seriada de 2x em meio de Manutenção de Podocitos.
   5. Pipetar em duplicado 100 μL de cada concentração padrão de inulina em cada poço de uma placa preta de 96 poços (ou 16 poços totais de inulina). Pipetar em duplicata 100 μL de cada concentração padrão de albumina em cada poço da mesma placa de 96 poços (16 poços totais de albumina). Pipeta em meio duplicado de Manutenção de Podócito de 100 μL para servir como o espaço em branco (ou dois poços totais de meio de Manutenção de Podocitos).
   6. Pipetar em duplicata 100 μL de meio efluente do canal urinário para cada poço da mesma placa de 96 poços. Pipeta em duplicata de 100 μL de meio efluente do canal capilar.
   7. Inserir a placa no leitor de placas e medir a fluorescência da albumina à excitação de 550 nm e à emissão de 615 nm. Medir a mesma placa para inulina na excitação 513 nm e emissão 577 nm.
   8. A partir dos dados gerados, a média das medições duplicadas (por chip). Subtraia o valor em branco correspondente a essa leitura da chapa do resto dos dados na folha.
   9. Plotar os valores correspondentes aos padrões de albumina para criar uma curva padrão com concentração [μg/mL] no eixo x e fluorescência no eixo y. Plotar os valores correspondentes aos padrões de inulina para criar uma curva padrão com concentração [μg/mL] no eixo x e fluorescência no eixo y.
   10. Utilizar um pacote de software de análise estatística e interpolação linear para determinar a concentração urinária de inulina e albumina, respectivamente, no meio efluente dos chips.
   11. Determinar a depuração urinária da inulina/albumina dos chips utilizando a equação (1)²:
       Depuração Urinária = ([U] × UV) / [P] (1)
       Onde [U] é a concentração urinária da etapa 8.1.10, UV é o volume de efluente do canal urinário coletado da etapa 8.1.2, e [P] é a concentração capilar de inulina ou albumina (10 μg/mL de inulina ou 100 μg/mL de albumina).
2. Imagem de imunofluorescência
   1. Injete uma ponta P200 vazia nas portas de saída dos canais urinário e capilar. Para fixar as células, pipete 200 μL de formaldeído a 4% e injete metade dele na entrada do canal inferior. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada.
   2. Pipetar 200 μL de formaldeído a 4% e injetar metade dele na entrada do canal urinário. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada de tal forma que tanto a entrada quanto a saída do canal estejam agora presas às pontas da pipeta cheias de fixador.
   3. Incubar os cavacos à temperatura ambiente durante 20 min.
   4. Após 20 min, descarte todas as pontas da pipeta. Injete pontas P200 limpas e vazias nas portas de saída dos canais urinário e capilar. Para permeabilizar as células, pipetar 200 μL de Triton X-100/PBS a 0,125% e injetar metade dele na entrada do canal capilar. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada.
   5. Pipeta 200 μL de 0,125% Triton X-100/PBS e injete metade dele na entrada do canal urinário. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada. Incubar o chip à temperatura ambiente durante 5 min.
   6. Descarte todas as pontas da pipeta. Injete pontas P200 limpas e vazias nas portas de saída dos canais urinário e capilar. Para bloquear as células, pipetar 200 μL de albumina sérica bovina a 1% (BSA) em Triton X-100/PBS a 0,125% e injetar metade dela na entrada do canal capilar. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada.
   7. Pipeta 200 μL de 1% BSA em 0,125% Triton X-100/PBS e injetar metade dele na entrada do canal urinário. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
   8. Descarte todas as pontas da pipeta. Lave ambos os canais 3x pipetando 200 μL de 0,125% Triton X-100/PBS em cada canal e incubando à temperatura ambiente por 5 min.
   9. Preparar 100 μL de anticorpos primários por canal com a diluição recomendada pelo fabricante em Triton X-100/PBS a 0,125%. Injete pontas P200 limpas e vazias nas portas de saída dos canais urinário e capilar. Pipetar 100 μL de anticorpo primário e injetar metade nos respectivos canais. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada.
   10. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente ou, para melhores resultados, durante a noite a 4 °C.
       NOTA: Múltiplos anticorpos primários podem ser aplicados de uma só vez; no entanto, a solução primária de anticorpos deve ser diluída de acordo com as instruções do fabricante.
   11. Lave os canais 3 x 10 minutos conforme descrito na etapa 8.2.8.
   12. Preparar 100 μL de anticorpos secundários por canal com o fator de diluição recomendado pelo fabricante em Triton X-100/PBS a 0,125%. Injete pontas P200 limpas e vazias nas portas de saída dos canais urinário e capilar. Pipetar 100 μL de anticorpo secundário e injetar metade nos respectivos canais. Solte as pontas da pipeta dentro da entrada. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
       NOTA: Cada anticorpo secundário deve ser aplicado separadamente. Lavar pelo menos 3 x 10 minutos entre cada aplicação, de acordo com a etapa 8.2.8.
   13. Lave os canais 3 x 10 minutos conforme descrito na etapa 8.2.8.
   14. Lave ambos os canais uma vez com 200 μL de água destilada enquanto aspira o fluido residual da periferia das portas de saída do chip.
   15. Injete P200 limpo e vazio nas portas de saída dos canais urinário e capilar. Para contra-manchar as células, pipetar 200 μL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, diluição 1:1.000 em água destilada) e injetar metade do mesmo na entrada do canal capilar. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada e pipete 200 μL de DAPI e injete metade dela na entrada do canal urinário. Solte a ponta da pipeta dentro da entrada e incube à temperatura ambiente por 5 min.
   16. Descarte todas as pontas da pipeta. Injete pontas P200 limpas e vazias nas portas de saída dos canais urinário e capilar. Para contracorar as células, pipetar 200 μL de faloidina (diluição de 1:1.000 em PBS sem Ca 2+ e Mg²⁺) e injetar metade dela na entrada do canal capilar e liberar a ponta da pipeta dentro da entrada. Pipetar 200 μL de faloidina (diluição de 1:1.000 em PBS sem Ca 2+ e Mg²⁺) e injetar metade dela na entrada do canal urinário e liberar a ponta da pipeta dentro da entrada. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
   17. Lave os canais 3x com 200 μL de PBS sem Ca 2+ e Mg²⁺ e aspirar o excesso de fluido da periferia das portas de saída.
   18. Visualize os chips.

Resultados

Aqui mostramos que um modelo funcional 3D in vitro do glomérulo pode ser vascularizado e epitelizado a partir de uma fonte isogênica de células iPS humanas. Especificamente, este protocolo fornece instruções sobre como aplicar a tecnologia de células iPS humanas, particularmente sua capacidade de se diferenciar em tipos de células especializadas, para gerar epitélio glomerular renal (podócitos) e endotélio vascular (viECs) que podem ser integrados com dispositivos microfluídicos para modelar a estrutu...

Discussão

Neste relatório, delineamos um protocolo para derivar o endotélio vascular e o epitélio glomerular (podócitos) de uma linhagem celular iPS humana isogênica e o uso dessas células para projetar um sistema de órgão em um chip 3D que imita a estrutura, a interface tecido-tecido e a função de filtração molecular do glomérulo renal. Este chip de glomérulo é equipado com endotélio e epitélio glomerular que, juntos, fornecem uma barreira para filtrar seletivamente as moléculas.

Os ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo/Life Technologies	A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Collagen IV	Thermo/Life Technologies	14-9871-82
Nephrin	Progen	GP-N2
PECAM-1	R&D Systems	AF806
Podocin	Abcam	ab50339
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, Human	Corning	356008	Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment	Iwai North America	N8922012	Basement membrane matrix (2)
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial	BD Biosciences	354277	Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation
Cells
DU11 human iPS cells			The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
2-Mercaptoethanol	Thermo/Life Technologies	21985023
Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate	Thermo/Life Technologies	A23017
All-trans retinoic acid (500 mg)	Stem Cell Technologies	72262
B27 serum-free supplement	Thermo/Life Technologies	17504044
B-27 supplement (50x) without Vitamin A	Thermo/Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418
CHIR99021	Stemgent	04-0004	May show lot-to-lot variation
Complete medium kit with CultureBoost-R	Cell Systems	4Z0-500-R	Podocyte maintenance media
DMEM/F12	Thermo/Life Technologies	12634028
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement	Thermo/Life Technologies	10565042	DMEM/F12 with glutamine
Forskolin (Adenylyl cyclase activator)	Abcam	ab120058
GlutaMAX supplement	Thermo/Life Technologies	35050061	glutamine supplement
Heat-inactivated FBS	Thermo/Life Technologies	10082147
Heparin solution	Stem Cell Technologies	7980
Human Activin A	Thermo/Life Technologies	PHC9544
Human BMP4	Preprotech	120-05ET
Human BMP7	Thermo/Life Technologies	PHC9544
Human VEGF	Thermo/Life Technologies	PHC9394
Inulin-FITC	Sigma-Aldrich	F3272
mTeSR1 medium	Stem Cell Technologies	05850	Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C.
N-2 Supplement (100x)	Thermo/Life Technologies	17502048
Neurobasal media	Thermo/Life Technologies	21103049	Lateral mesoderm basal media
PBS (Phosphate-buffered saline)	Thermo/Life Technologies	14190-250
Penicillin-streptomycin, liquid (100x)	Thermo/Life Technologies	15140-163
ROCK inhibitor (Y27632)	Tocris	1254
StemPro-34 SFM	Thermo/Life Technologies	10639011	Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months.
TGF-Beta inhibitor (SB431542)	Stem Cell Technologies	72234
Enzymes and other reagents
Accutase	Thermo/Life Technologies	A1110501	Cell detachment buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2438
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade	VWR	97065-058
Paraformaldehyde (PFA)	Thermo/Life Technologies	28906
Sterile distilled water	Thermo/Life Technologies	15230162
Triton X-100	VWR	97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05%	Thermo/Life Technologies	25300-120
(Orb) Hub module	Emulate	ORB-HM1
100mm x 15 mm round petri dish	Fisherbrand	FB087579B
120 x 120 mm square cell culture dish	VWR	688161
Accuri C6	BD Biosciences
Aspirating pipettes, individually wrapped	Corning	29442-462
Aspirating Unit	SP Bel-Art	F19917-0150
Avanti J-15R Centrifuge	Beckman Coulter	B99516
Conical centrifuge tube, 15 mL	Corning	352097
Conical centrifuge tube, 50 mL	Corning	352098
EVOS M7000	Thermo/Life Technologies	AMF7000	Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.
Hemocytometer	VWR	100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo/Life Technologies	51030403
Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera	Carl Zeiss Micrscopy	491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)
Kimberly-Clark nitrile gloves	VWR	40101-346
Kimwipes, large	VWR	21905-049
Leoca SP8 Upright Confocal Microscope
Media reservoir (POD Portable Module)	Emulate	POD-1
Microplate shaker	VWR	12620-926
Organ-chip	Emulate	S-1 Chip
Organ-chip holder	Emulate	AK-CCR
P10 precision barrier pipette tips	Denville Scientific	P1096-FR
P100 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1125
P1000 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1121
P20 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1122
P200 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1122
Plasma Asher	Quorum tech	K1050X RF	This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).
Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap	Corning	352235
Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped	Corning	356551
Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped	Corning	356525
Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped	Corning	356543
Steriflip, 0.22 µm, PES	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile Microcentrifuge tubes	Thomas Scientific	1138W14
T75cm2 cell culture flask with vent cap	Corning	430641U
Tissue culture-treated 12 well plates	Corning	353043
Tissue culture-treated 6 well plates	Corning	353046
Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module)	Emulate	ZOE-CM1	Organ Chip Bioreactor
VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated	Miltenyi Biotec	130-126-010
Wide-beveled cell lifter	Corning	3008
MACS
CD144 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-097-857
CD31 MicroBead Kit, human	Miltenyi Biotec	130-091-935
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401