Chip de glomérulo renal isogênico projetado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo para projetar um sistema personalizado de organ-on-a-chip que recapitula a estrutura e a função da barreira de filtração glomerular renal, integrando células endoteliais epiteliais e vasculares geneticamente combinadas diferenciadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Este sistema de bioengenharia pode avançar a medicina de precisão renal e aplicações relacionadas.

Resumo

A doença renal crônica (DRC) afeta 15% da população adulta dos EUA, mas o estabelecimento de terapias direcionadas tem sido limitado pela falta de modelos funcionais que possam prever com precisão as respostas biológicas humanas e a nefrotoxicidade. Os avanços na medicina de precisão renal podem ajudar a superar essas limitações. No entanto, modelos in vitro previamente estabelecidos do glomérulo renal humano - o local primário para a filtração do sangue e um alvo-chave de muitas doenças e toxicidades de drogas - normalmente empregam populações celulares heterogêneas com características funcionais limitadas e antecedentes genéticos incomparáveis. Essas características limitam significativamente sua aplicação para modelagem de doenças específicas do paciente e descoberta terapêutica.

Este trabalho apresenta um protocolo que integra o epitélio glomerular derivado de células-tronco pluripotente induzido por humanos (iPS) (podócitos) e endotélio vascular de um único paciente para projetar um chip de glomérulo renal microfluídico isogênico e vascularizado. O chip glomérulo resultante é composto de camadas de células endoteliais e epiteliais derivadas de células-tronco que expressam marcadores específicos de linhagem, produzem proteínas da membrana basal e formam uma interface tecido-tecido semelhante à barreira de filtração glomerular do rim. O chip de glomérulo modificado filtra seletivamente moléculas e recapitula a lesão renal induzida por drogas. A capacidade de reconstituir a estrutura e a função do glomérulo renal usando tipos de células isogênicas cria a oportunidade de modelar a doença renal com a especificidade do paciente e avançar a utilidade de órgãos em chips para medicina de precisão renal e aplicações relacionadas.

Introdução

Os dispositivos organ-on-a-chip são modelos dinâmicos 3D in vitro que empregam estimulação molecular e mecânica, bem como vascularização, para formar interfaces tecido-tecido que modelam a estrutura e a função de órgãos específicos. Dispositivos organ-on-a-chip previamente estabelecidos que visavam recapitular o glomérulo do rim (chips de glomérulo) consistiam em linhagens celulares animais¹ ou linhagens celulares primárias e imortalizadas humanas de fontes heterogêneas ^2,3. O uso de fontes celulares geneticamente heterogêneas apresenta variações que limitam significativamente ....

Protocolo

1. Preparar soluções de matriz de membrana basal e substratos revestidos

1. Descongelar a matriz da membrana basal 1 durante a noite sobre gelo a 4 °C. Alíquota de acordo com a sugestão do fabricante para a razão de diluição. Usando um tubo cônico de 50 mL e pipeta, misture cuidadosamente uma quantidade apropriada de matriz de membrana basal 1 em 25 mL de DMEM/F12 frio até descongelar completamente e dissolver.
   1. Para dissolver uma alíquota congelada, tome ~200 μL dos 25 mL de DMEM/F12 frio e transfira-o para o tubo de alíquota congelado. Pipetar para cima e para baixo até que a matriz esteja completamente descongelada e dissolvida. Trans....

Resultados

Aqui mostramos que um modelo funcional 3D in vitro do glomérulo pode ser vascularizado e epitelizado a partir de uma fonte isogênica de células iPS humanas. Especificamente, este protocolo fornece instruções sobre como aplicar a tecnologia de células iPS humanas, particularmente sua capacidade de se diferenciar em tipos de células especializadas, para gerar epitélio glomerular renal (podócitos) e endotélio vascular (viECs) que podem ser integrados com dispositivos microfluídicos para modelar a estrutu.......

Discussão

Neste relatório, delineamos um protocolo para derivar o endotélio vascular e o epitélio glomerular (podócitos) de uma linhagem celular iPS humana isogênica e o uso dessas células para projetar um sistema de órgão em um chip 3D que imita a estrutura, a interface tecido-tecido e a função de filtração molecular do glomérulo renal. Este chip de glomérulo é equipado com endotélio e epitélio glomerular que, juntos, fornecem uma barreira para filtrar seletivamente as moléculas.

Os .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo/Life Technologies	A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Collagen IV	Thermo/Life Technologies	14-9871-82
Nephrin	Progen	GP-N2
PECAM-1	R&D Systems	AF806
Podocin	Abcam	ab50339
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, Human	Corning	356008	Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment	Iwai North America	N8922012	Basement membrane matrix (2)
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial	BD Biosciences	354277	Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation
Cells
DU11 human iPS cells			The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
2-Mercaptoethanol	Thermo/Life Technologies	21985023
Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate	Thermo/Life Technologies	A23017
All-trans retinoic acid (500 mg)	Stem Cell Technologies	72262
B27 serum-free supplement	Thermo/Life Technologies	17504044
B-27 supplement (50x) without Vitamin A	Thermo/Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418
CHIR99021	Stemgent	04-0004	May show lot-to-lot variation
Complete medium kit with CultureBoost-R	Cell Systems	4Z0-500-R	Podocyte maintenance media
DMEM/F12	Thermo/Life Technologies	12634028
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement	Thermo/Life Technologies	10565042	DMEM/F12 with glutamine
Forskolin (Adenylyl cyclase activator)	Abcam	ab120058
GlutaMAX supplement	Thermo/Life Technologies	35050061	glutamine supplement
Heat-inactivated FBS	Thermo/Life Technologies	10082147
Heparin solution	Stem Cell Technologies	7980
Human Activin A	Thermo/Life Technologies	PHC9544
Human BMP4	Preprotech	120-05ET
Human BMP7	Thermo/Life Technologies	PHC9544
Human VEGF	Thermo/Life Technologies	PHC9394
Inulin-FITC	Sigma-Aldrich	F3272
mTeSR1 medium	Stem Cell Technologies	05850	Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C.
N-2 Supplement (100x)	Thermo/Life Technologies	17502048
Neurobasal media	Thermo/Life Technologies	21103049	Lateral mesoderm basal media
PBS (Phosphate-buffered saline)	Thermo/Life Technologies	14190-250
Penicillin-streptomycin, liquid (100x)	Thermo/Life Technologies	15140-163
ROCK inhibitor (Y27632)	Tocris	1254
StemPro-34 SFM	Thermo/Life Technologies	10639011	Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months.
TGF-Beta inhibitor (SB431542)	Stem Cell Technologies	72234
Enzymes and other reagents
Accutase	Thermo/Life Technologies	A1110501	Cell detachment buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2438
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade	VWR	97065-058
Paraformaldehyde (PFA)	Thermo/Life Technologies	28906
Sterile distilled water	Thermo/Life Technologies	15230162
Triton X-100	VWR	97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05%	Thermo/Life Technologies	25300-120
(Orb) Hub module	Emulate	ORB-HM1
100mm x 15 mm round petri dish	Fisherbrand	FB087579B
120 x 120 mm square cell culture dish	VWR	688161
Accuri C6	BD Biosciences
Aspirating pipettes, individually wrapped	Corning	29442-462
Aspirating Unit	SP Bel-Art	F19917-0150
Avanti J-15R Centrifuge	Beckman Coulter	B99516
Conical centrifuge tube, 15 mL	Corning	352097
Conical centrifuge tube, 50 mL	Corning	352098
EVOS M7000	Thermo/Life Technologies	AMF7000	Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.
Hemocytometer	VWR	100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo/Life Technologies	51030403
Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera	Carl Zeiss Micrscopy	491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)
Kimberly-Clark nitrile gloves	VWR	40101-346
Kimwipes, large	VWR	21905-049
Leoca SP8 Upright Confocal Microscope
Media reservoir (POD Portable Module)	Emulate	POD-1
Microplate shaker	VWR	12620-926
Organ-chip	Emulate	S-1 Chip
Organ-chip holder	Emulate	AK-CCR
P10 precision barrier pipette tips	Denville Scientific	P1096-FR
P100 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1125
P1000 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1121
P20 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1122
P200 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1122
Plasma Asher	Quorum tech	K1050X RF	This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).
Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap	Corning	352235
Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped	Corning	356551
Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped	Corning	356525
Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped	Corning	356543
Steriflip, 0.22 µm, PES	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile Microcentrifuge tubes	Thomas Scientific	1138W14
T75cm2 cell culture flask with vent cap	Corning	430641U
Tissue culture-treated 12 well plates	Corning	353043
Tissue culture-treated 6 well plates	Corning	353046
Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module)	Emulate	ZOE-CM1	Organ Chip Bioreactor
VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated	Miltenyi Biotec	130-126-010
Wide-beveled cell lifter	Corning	3008
MACS
CD144 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-097-857
CD31 MicroBead Kit, human	Miltenyi Biotec	130-091-935
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401