İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Üretilen İzojenik Böbrek Glomerulus Çipi

Özet

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden farklılaşan genetik olarak eşleşen epitel ve vasküler endotel hücrelerini entegre ederek böbrek glomerüler filtrasyon bariyerinin yapısını ve işlevini özetleyen kişiselleştirilmiş bir çip üzerinde organ sistemi tasarlamak için bir protokol sunulmaktadır. Bu biyomühendislik sistemi, böbrek hassas tıbbını ve ilgili uygulamaları ilerletebilir.

Özet

Kronik böbrek hastalığı (KBH), ABD yetişkin nüfusunun% 15'ini etkilemektedir, ancak hedefe yönelik tedavilerin kurulması, insan biyolojik yanıtlarını ve nefrotoksisiteyi doğru bir şekilde tahmin edebilen fonksiyonel modellerin eksikliği ile sınırlandırılmıştır. Böbrek hassas tıbbındaki gelişmeler bu sınırlamaların üstesinden gelmeye yardımcı olabilir. Bununla birlikte, daha önce kurulmuş olan insan böbrek glomerulusunun in vitro modelleri - kan filtrasyonu için birincil bölge ve birçok hastalık ve ilaç toksisitesinin kilit bir hedefi - tipik olarak sınırlı fonksiyonel özelliklere ve eşsiz genetik geçmişlere sahip heterojen hücre popülasyonlarını kullanır. Bu özellikler, hastaya özgü hastalık modellemesi ve terapötik keşif için uygulamalarını önemli ölçüde sınırlar.

Bu yazıda, izojenik ve vaskülarize mikroakışkan böbrek glomerulus çipi mühendisliği için tek bir hastadan insan kaynaklı pluripotent kök (iPS) hücre kaynaklı glomerüler epitel (podositler) ve vasküler endoteli entegre eden bir protokol sunulmaktadır. Ortaya çıkan glomerulus çipi, soya özgü belirteçleri eksprese eden, bazal membran proteinleri üreten ve böbreğin glomerüler filtrasyon bariyerine benzeyen bir doku-doku arayüzü oluşturan kök hücre kaynaklı endotel ve epitel hücre katmanlarından oluşur. Tasarlanmış glomerulus çipi, molekülleri seçici olarak filtreler ve ilaca bağlı böbrek hasarını özetler. İzojenik hücre tiplerini kullanarak böbrek glomerulusunun yapısını ve işlevini yeniden oluşturma yeteneği, böbrek hastalığını hastaya özgüllükle modelleme ve böbrek hassas tıbbı ve ilgili uygulamalar için çip üzerindeki organların faydasını geliştirme fırsatı yaratır.

Giriş

Çip üzerinde organ cihazları, belirli organların yapısını ve işlevini modelleyen doku-doku arayüzleri oluşturmak için moleküler ve mekanik stimülasyonun yanı sıra vaskülarizasyon kullanan dinamik 3D in vitro modellerdir. Böbreğin glomerulusunu (glomerulus çipleri) özetlemeyi amaçlayan daha önce kurulmuş çip üzerinde organ cihazları, hayvan hücre hatları¹ veya heterojen kaynakların insan birincil ve ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarından oluşuyordu ^2,3. Genetik olarak heterojen hücre kaynaklarının kullanımı, hastaya özgü yanıtlar ve hastalığın genetiği veya mekanizmaları üzerine yapılan çalışmaları önemli ölçüde sınırlayan varyasyonlar ortaya koymaktadır ^4,5. Bu zorluğun ele alınması, in vitro modellerin mühendisliği için daha doğru bir mikro ortam sağlamak için korunmuş moleküler ve genetik profillere sahip belirli bireylerden kaynaklanan izojenik hücre hatlarının mevcudiyetine bağlıdır ^2,3,6. İnsan kökenli izojenik hücre hatları, insan iPS hücre kültüründeki ilerlemeler nedeniyle artık kolayca üretilebilir. İnsan iPS hücreleri tipik olarak invaziv olmayan bir şekilde kaynaklandığından, süresiz olarak kendi kendini yenileyebildiğinden ve hemen hemen her hücre tipine farklılaşabildiğinden, glomerulus çipi ^7,8 gibi in vitro modellerin kurulması için çekici bir hücre kaynağı olarak hizmet ederler. Glomerüler filtrasyon bariyeri, kan filtrasyonu için birincil bölgedir. Kan önce vasküler endotel, glomerüler bazal membran ve son olarak podositler adı verilen özel epitel yoluyla süzülür. Filtrasyon bariyerinin her üç bileşeni de moleküllerin seçici filtrasyonuna katkıda bulunur. Burada, tek bir insan iPS hücre kaynağından vasküler endotel ve glomerüler epitel ile arayüz oluşturan çip üzerinde organ cihazı oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, glomerüler filtrasyon bariyerini özetlemek için izojenik ve vaskülarize bir çip mühendisliği yapmak için özellikle yararlı olsa da, aynı zamanda diğer kişiselleştirilmiş çip üstü organ türlerini ve izojenik bir 'çip üzerinde vücut' sistemi gibi çok organlı platformları geliştirmek için bir plan sağlar.

Burada açıklanan protokol, insan iPS hücrelerinin iki ayrı soya - lateral mezoderm ve mezoderm hücrelerine - daha sonra sırasıyla vasküler endotel ve glomerüler epitel olarak farklılaşmasıyla başlar. Yanal mezoderm hücreleri üretmek için, insan iPS hücreleri bazal membran matrisi 1 kaplı plakalar üzerine tohumlandı ve Wnt aktivatörü, CHIR 99021 ve güçlü mezoderm indükleyicisi, kemik-morfogenetik 4 (BMP4) ile desteklenen N2B27 ortamında 3 gün boyunca (ortam değişimi olmadan) kültürlendi. Ortaya çıkan lateral mezoderm hücreleri daha önce brachyury (T), karışım çiftli benzeri homeobox (MIXL) ve eomesodermin (EOMES)⁹ ekspresyonu ile karakterize edildi. Daha sonra, lateral mezoderm hücreleri, manyetik aktive hücre sıralama (MACS) kullanılarak VE-Kadherin ve / veya PECAM-1 ekspresyonuna göre sıralanan vasküler endotel hücrelerini indüklemek için VEGF165 ve Forskolin ile desteklenmiş bir ortamda 4 gün boyunca kültürlendi. Elde edilen vasküler endotel hücreleri (viEC), mikroakışkan cihazda tohumlanmaya hazır olana kadar bazal membran matrisi 3 kaplı şişeler üzerinde kültürlenerek genişletildi.

Mezoderm hücreleri üretmek için, insan iPS hücreleri bazal membran matrisi 2 kaplı plakalar üzerine tohumlandı ve Activin A ve CHIR99021 içeren bir ortamda 2 gün boyunca kültürlendi. Elde edilen mezoderm hücreleri, daha önce^tarif edildiği gibi HAND1, goosecoid ve brachury (T) ekspresyonu ile karakterize edildi ^2,10,11. Ara mezoderm (IM) hücre farklılaşmasını indüklemek için, mezoderm hücreleri BMP-7 ve CHIR99021 ile desteklenmiş bir ortamda 14 gün boyunca kültürlendi. Elde edilen IM hücreleri, Wilm Tümörü 1 (WT1), eşleştirilmiş kutu geni 2 (PAX2) ve tek atlanan ilişkili protein 1 (OSR-1) ^2,10,11'i eksprese eder.

İki kanallı polidimetilsiloksan (PDMS) bazlı mikroakışkan çip, glomerüler filtrasyon bariyerinin yapısını in vitro olarak özetlemek için tasarlanmıştır. İdrar kanalı 1.000 μm x 1.000 μm (g x y) ve kılcal kanal boyutu 1.000 μm x 200 μm (g x y) şeklindedir. Döngüsel gerilme ve gevşeme döngüleri, akışkan kanalların her iki tarafında bulunan içi boş odalar tarafından kolaylaştırıldı. Hücreler, idrar ve kılcal kanalları ayıran esnek, PDMS membranına (50 μm kalınlığında) tohumlandı. Membran, hücreler arası sinyalleşmeyi teşvik etmeye yardımcı olmak için altıgen gözeneklerle (7 μm çaplı, 40 μm aralıklı) donatılmıştır (Şekil 1A)^2,12. IM indüksiyonu tamamlanmadan iki gün önce, mikroakışkan çipler bazal membran matrisi 2 ile kaplandı. viEC'ler, IM indüksiyonu tamamlanmadan 1 gün önce Endotel Bakım ortamı kullanılarak mikroakışkan çipin kılcal kanalına tohumlandı ve çip, ECM kaplı PDMS membranının bazal tarafında hücre yapışmasını sağlamak için baş aşağı çevrildi. IM indüksiyonunun tamamlandığı gün, hücreler, çip içinde podosit farklılaşmasını indüklemek için BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165 ve tüm trans Retinoik Asit ile desteklenmiş bir ortam kullanılarak mikroakışkan çipin idrar kanalına tohumlandı. Ertesi gün, ortam rezervuarları Podosit İndüksiyon ortamı ve Endotel Bakım ortamı ile dolduruldu ve yongalara 0.4 Hz'de% 10 mekanik gerinim ve sıvı akışı (60 μL / s) uygulandı.

Hücreselleştirilmiş mikroakışkan çipler, Podosit İndüksiyon ortamı (idrar kanalında) ve Endotel Bakım ortamı (vasküler kanalda) kullanılarak 5 gün daha kültürlendi. Elde edilen böbrek glomerulus çipleri, hem podosit hem de endotel hücreleri için bakım ortamında 7 güne kadar kültürlendi. Farklılaşmış podositler, podocin ve nefrin^13,14 dahil olmak üzere soya özgü proteinleri pozitif olarak ifade ederken^, viEC'ler, hepsi glomerüler filtrasyon bariyerinin bütünlüğünü korumak için gerekli moleküller olan PECAM-1 ve VE-Cadherin'i pozitif olarak ifade etti. . Podositlerin ve viEC'lerin her ikisinin de doku olgunlaşması ve fonksiyonu için de önemli olan en bol glomerüler bazal membran proteini olan kollajen IV'ü salgıladığı bulunmuştur.

Glomerulus yongalarındaki filtrasyon bariyerinin üç bileşenli sisteminin - endotel, bazal membran ve epitel - molekülleri seçici olarak filtrelediği ve kemoterapötik, nefrotoksik ilaç tedavisine yanıt verdiği bulunmuştur. İlaç tedavisinden elde edilen sonuçlar, glomerulus çipinin nefrotoksisite çalışmaları ve hastalık modellemesi için kullanılabileceğini göstermiştir. Bu protokol, izojenik iPS hücre türevlerinden fonksiyonel bir mikroakışkan böbrek glomerulus çipinin mühendisliği için genel kılavuz sağlar. Tasarlanan çipin aşağı akış analizleri, araştırmacı tarafından istenildiği gibi gerçekleştirilebilir. İlaca bağlı glomerüler yaralanmayı modellemek için glomerulus çipinin kullanımı hakkında daha fazla bilgi için, önceki yayınlara bakın ^2,12.

Protokol

1. Bodrum membran matris çözeltileri ve kaplamalı substratlar hazırlayın

1. Bodrum membran matrisi 1'i 4 °C'de buz üzerinde gece boyunca çözün. Aliquot, seyreltme oranı için üreticinin önerisine göre. 50 mL'lik bir konik tüp ve pipet kullanarak, tamamen çözülene ve çözülene kadar uygun miktarda bazal membran matrisi 1'i 25 mL soğuk DMEM/F12'ye iyice karıştırın.
   1. Dondurulmuş bir aliquot'u çözmek için, 25 mL'lik soğuk DMEM / F12'den ~ 200 μL alın ve dondurulmuş aliquot tüpüne aktarın. Matris iyice çözülene ve çözülene kadar pipeti yukarı ve aşağı doğru çekin. Bodrum membranı matrisi 1'in tüm tüp içeriğini soğuk DMEM/F12'nin geri kalanına aktarın.
2. Pipet 1 mL bazal membran matrisi 1 çözeltisi 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna yerleştirilir. Kaplanmış plakaları aynı gün kullanmak için, 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   1. Alternatif olarak, kaplanmış plakalar parafilm ile sarılabilir ve 2 haftaya kadar 4 ° C'de saklanabilir. Depolanan plakayı kullanmaya hazır olduğunda, 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
3. 5 μg/mL'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için bazal membran matrisi 2'yi 9 mL steril damıtılmış suda seyreltin. Pipet 700 μL bazal membran matrisi 2 çözeltisi 12 delikli bir plakanın her bir kuyuğuna yerleştirilir. Bodrum membran matrisi 2 kaplamalı plakaları parafilm ile sarın ve 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
4. Liyofilize bazal membran matrisi 3'ü, üretici tarafından önerildiği gibi fosfat tamponlu salinde (PBS, Ca + 2 ^{ve Mg + 2} içermeyen) 1 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için yeniden oluşturun. Bir adet 250 μL aliquot'u 9.75 mL PBS'de (Ca+2 ^{ve Mg}+2 içermeyen) ²⁵ μg/mL'lik son konsantrasyona kadar seyreltin. Bir T75 şişesini kaplamak için bu çözeltinin 6 mL'sini kullanın (2 μg /^cm2'lik son konsantrasyon). Matris kaplı şişeleri 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.

2. İnsan iPS hücre kültürü

NOT: Bu protokolde kullanılan DU11 hattı test edilmiş ve mikoplazma ve karyotip anormallikleri içermediği bulunmuştur.

1. Bodrum membran matrisi 1 kaplamalı plakaları 37°C'de 1-2 saat boyunca inkübe edin.
2. 6 delikli plakanın her bir oyuğunu 3x, 1 mL ılık (37 ° C) DMEM / F12 ile yıkayın. 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 2 mL insan iPS hücre kültürü ortamı (CCM) (Ek Tablo S1) ekleyin. Hücreler aşağıda açıklandığı gibi tohumlama için hazırlanırken plakaları 37 ° C'de inkübe edin.
3. İnsan iPS hücreleri içeren 6 delikli plakanın her bir kuyusunu 1 mL sıcak DMEM / F12 ile yıkayın.
4. DMEM/F12'yi aspire edin. 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL sıcak hücre ayrılma tamponu ekleyin. 1 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin.
5. Hücre kolonisi kenarlarının etrafındaki ayrışma için mikroskop altında her bir kuyuyu görsel olarak inceleyin. Hücre ayrılma tamponunu hücrelerden dikkatlice aspire edin. Her bir kuyucuğu 1 mL ılık DMEM / F12 ile nazikçe yıkayın.
6. Hücrelerin plakadan tamamen ayrılmadığından veya yanlışlıkla aspire edilmediğinden emin olmak için plakaları mikroskop altında inceleyin.
7. Hücreli 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 3 mL sıcak insan iPS CCM ekleyin. Bir hücre kaldırıcı kullanarak, kolonileri yavaşça kazıyın. 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu her bir kuyucukta bir kez yukarı ve aşağı doğru yavaşça karıştırın.
8. Yeni bazal membran matrisi 1 kaplamalı plakayı inkübatörden çıkarın. Hücre süspansiyonunun 0,5 mL'sini yeni bazal membran matrisi 1 kaplamalı plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı sekiz rakamlı bir hareketle hareket ettirin. % 5 CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
9. Harcanan ortamı aspire edin ve hücreler% 70 kaynaşana kadar (geçişten yaklaşık 4 gün sonra) kültürün her günü 3 mL insan iPS CCM ile değiştirin.

3. Gün 0-16: İnsan iPSC'lerinin ara mezoderm hücrelerine farklılaşması

1. 0-2. Gün: mezoderm indüksiyonu
   1. Bodrum membran matrisi 2 kaplamalı plakaları, depolamadan sonra dengelemek için 4 °C'den 2 saat oda sıcaklığına taşıyın.
   2. Harcanan ortamı, yaklaşık% 70 akan insan iPS hücresi içeren 6 delikli plakanın her bir kuyucuğundan aspire edin. Hücreleri 1 mL ılık DMEM / F12 ile 3 kat nazikçe yıkayın.
   3. DMEM/F12'yi aspire edin. İnsan iPS hücrelerinin 6 delikli plakasının her bir kuyucuğuna 1 mL hücre ayrılma tamponu ekleyin. 5-7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   4. Hücre kolonisi kenarlarının etrafındaki ayrışma için mikroskop altında her bir kuyuyu görsel olarak inceleyin. Bir hücre kaldırıcı kullanarak, kolonileri yavaşça kazıyın.
   5. Hücre süspansiyonlarını 6 delikli plakanın tüm kuyucuklarından 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve iPS hücrelerinin tek hücreli bir süspansiyonunu elde etmek için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yapmak için bir P1000 kullanın.
   6. Konik tüpteki hücre süspansiyonunu DMEM / F12 ile 14 mL'ye doldurun. Oda sıcaklığında 200 × g'da 5 dakika santrifüj.
   7. Süper natantı aspire edin. Hücre peletini 14 mL sıcak DMEM / F12 içinde yeniden askıya alın. Santrifüjlemeyi oda sıcaklığında 200 × g'da 5 dakika tekrarlayın.
   8. Süper natantı aspire edin. Hücreleri 1 mL Mezoderm İndüksiyon ortamında yeniden askıya alın (Ek Tablo S1). Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. 1 × 10⁵ hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için Mesoderm İndüksiyon ortamında seyreltin.
   9. Kaplamayı bodrum membran matrisi 2 kaplamalı plakadan aspire edin. Bodrum membran matrisi 2 kaplamalı plakanın her bir oyuğunu 1 mL sıcak DMEM / F12 ile 2x durulayın.
   10. Hücre süspansiyonunu 2 kat yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini bodrum membran matrisi 2 kaplı plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı yavaşça sekiz rakamlı bir hareketle hareket ettirin.
   11. Plakayı gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün (1. gün), harcanan ortamı 12 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğundan aspire edin. 1 mL ılık Mesoderm İndüksiyon ortamı ile değiştirin. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
2. 2-16. Günler: Orta mezoderm indüksiyonu
   1. Harcanan Mesoderm İndüksiyon ortamını aspire edin. 1m L sıcak Orta Mezoderm İndüksiyon ortamı (Ek Tablo S1) ile değiştirin. Harcanan ortamı aspire edin ve 14 gün boyunca her gün 1 mL sıcak Orta Mezoderm İndüksiyon ortamı ile değiştirin.

4. Gün 0-15: İnsan iPSC'lerinin vasküler endotel hücrelerine farklılaşması ve genişlemesi

1. 0. Gün: insan iPS hücre tohumlaması
   1. ROCK İnhibitörü ile 15 mL insan iPS CCM'si hazırlayın (Ek Tablo S1). 37 °C'de sıcak tutun.
   2. Bir bodrum membran matrisi 1 kaplamalı plakayı 37 ° C'de 1-2 saat boyunca inkübe edin. Bodrum membran matrisini aspire edin 1. 3x'i 1 mL sıcak DMEM/F12 ile yıkayın.
   3. DMEM/F12'yi aspire edin. 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna ROCK İnhibitörü ile 2 mL insan iPS CCM ekleyin. Hücreler aşağıda açıklandığı gibi tohumlama için hazırlanırken plakaları 37 ° C'de inkübe edin.
   4. Harcanan ortamı, yaklaşık% 70 akan insan iPS hücresi içeren 6 delikli plakanın her bir kuyucuğundan aspire edin. Hücreleri 1 mL ılık DMEM / F12 ile 3 kat nazikçe yıkayın.
   5. DMEM/F12'yi aspire edin. İnsan iPS hücrelerinin 6 delikli plakasının her bir kuyucuğuna 1 mL hücre ayrılma tamponu ekleyin. Hücreleri tek hücrelere ayırmak için 5-7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: iPS hücre hatları arasındaki doğal farklılıklar nedeniyle, kullanıcının optimum inkübasyon süresini belirlemek için 5 dakika sonra hücreleri görsel olarak incelemesi gerekecektir.
   6. Hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Ayrılma tamponunu nötralize etmek için hücre süspansiyonunu sıcak DMEM / F12 ile 14 mL'ye kadar getirin. Oda sıcaklığında 200× g'da 5 dakika santrifüj.
   7. Süper natantı nazikçe aspire edin. ROCK inhibitörü ile 1 mL İnsan iPS CCM'deki hücreleri yeniden askıya alın. Bir hemositometre kullanarak toplam hücre sayısını sayın.
   8. Hücreleri 37.000 ila 47.000 hücre /^cm2 (355.200 ila 451.200 hücre / 6 delikli bir plakanın kuyusu) arasında tohumlayın. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: iPS hücre hatları arasındaki doğal farklılıklar nedeniyle, kullanıcının optimum tohumlama yoğunluğunu belirlemesi gerekecektir.
2. 1-3. Gün: lateral mezoderm indüksiyonu
   1. Ertesi gün (1. gün), harcanan ortamı, insan iPS hücrelerinin 6 delikli plakasının her bir kuyucuğundan aspire edin. 6 delikli plakanın her bir kuyucuğunu 5 mL Yanal Mezoderm İndüksiyon ortamı ile değiştirin (Ek Tablo S1). Kültür kabının ölçeğini yükseltirken (örneğin, şişeler), genellikle kültür kabındaki çalışma hacminin 3 katı ile değiştirin.
   2. Bu ortamı 3 gün boyunca değiştirmeyin.
      NOT: Kuyucuklardaki Lateral Mesoderm İndüksiyon Ortamı, hücreler besinleri kullandıkça normalde kırmızıdan sarıya renk değiştirecektir. Bununla birlikte, bakteriyel büyüme ile bulutlu orta veya orta normal değildir ve bu şekilde dekontamine edilmeli ve atılmalıdır.
3. 4-6. Gün: endotel hücre indüksiyonu
   1. Harcanan ortamı 6 delikli plakanın her bir kuyucuğundan aspire edin. 6 delikli plakanın her bir kuyucuğunu 3 mL sıcak Endotelyal İndüksiyon ortamı ile değiştirin (Ek Tablo S1). Plakayı gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   2. Takip eden 2 gün boyunca (5. ve 6. günler), harcanan ortamı tüm kuyulardan 50 mL'lik bir konik tüpe toplayın. Konik tüpü 4 °C'de saklayın. Hücreleri 3 mL sıcak Endotelyal İndüksiyon ortamı ile doldurun. Plakayı 37 ° C'de inkübe edin.
4. 7. Gün: Endotel hücresi (viEC) ayıklama
   1. Bodrum membran matrisi 3 şişelerini çıkarın ve oda sıcaklığında 1 saat bekletin.
   2. 50 mL MACS arabelleği hazırlayın (Ek Tablo S1).
   3. Hücre dekolmanı tamponu, MACS tamponu, Endotelyal CCM ve PBS'yi (Ca 2+ ve Mg²⁺ serbest) doku kültürü başlığındaki buz üzerine yerleştirin.
   4. Mıknatısı MACS standına yerleştirin. İki adet 50 mL konik tüp ve bir adet 15 mL konik tüp tutucuya yerleştirin.
   5. MACS standını (mıknatıs takılıyken) ve bir LS sütununu doku kültürü başlığına yerleştirin. Konik tüp tutucuyu (içinde konik tüpler ile) MACS standında, mıknatısın altına yerleştirin (Ek Şekil S1A).
   6. Harcanan ortamı 6 delikli plakanın her bir kuyucuğundan 4.3.2 adımından itibaren 50 mL konik tüpe toplayın. 6 delikli plakanın her bir oyuğunu PBS ile yıkayın (Ca 2+ ve Mg²⁺ içermez).
   7. PBS'yi aspire edin. 1 mL hücre ayrılma tamponu ekleyin. Hücreleri tamamen ayırmak için 5-7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   8. Hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Soğuk Endotelyal CCM ile hücre süspansiyonunu 15 mL'ye getirin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj.
   9. Süper natantı aspire edin. Hücreleri 1 mL soğuk MACS tamponunda yeniden askıya alın. Hücreleri bir hemositometre ile sayın.
   10. Hücre süspansiyonuna 10 mL MACS arabelleği ekleyin. Oda sıcaklığında 200 × g'da 5 dakika santrifüj.
   11. Süper natantı aspire edin. Hücreleri, 10 milyon hücre başına 80 μL MACS tamponunda yeniden askıya alın. 10 milyon hücre başına 20 μL FcR Bloke Reaktifi, CD31 mikroboncuk ve CD144 mikroboncuk ekleyin. Buz üzerinde 15 dakika kuluçkaya yatırın.
   12. Hücre süspansiyonu inkübe olurken, endotel indüksiyonundan (adım 4.3.2) toplanan ortamı 10 dakika boyunca 200 × g'de santrifüj edin.
   13. Süpernatantı 500 mL 0,22 μm vakum filtresinde toplayın. Endotelyal Şartlandırılmış ortamı hazırlayın (Ek Tablo S1). Ortamı steril koşullar altında filtreleyin ve ortamı 37 ° C'de sıcak tutun.
       NOT: Endotel hücre proliferasyon hızı 3. geçişten sonra azalmaya başlayacaktır. Pasaj 3'ten sonra üstel büyüme elde etmek için, endotel şartlandırılmış ve bakım ortamı, pasaj 1'den itibaren 10 μM TGF-Beta inhibitörü (SB431542) ile desteklenebilir.
   14. Adım 4.4.11'deki 15 dakikalık inkübasyondan sonra, hücre süspansiyonuna 10 milyon hücre başına 10 mL MACS tamponu (maksimum 30 mL MACS tamponu) ekleyin. 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj.
   15. Süper natantı aspire edin. 1 mL MACS arabelleğinde yeniden askıya alın.
   16. LS kolonunu alın ve pistonu şırıngadan dışarı çekin. Pistonu tekrar plastik kılıfa yerleştirin. Sütunu mıknatısın üzerine yerleştirin.
   17. İlk 50 mL konik tüpü sütunun altına yerleştirin. Sütuna 1 mL MACS arabelleği ekleyin. Altındaki 50 mL konik tüpte toplayın.
   18. Kolonun kurumasını önlemek için tamamen olmasa da sıvının akmasına izin verin. Sıvı damlaları yavaşça damlamaya başladığında, hücre süspansiyonunu sütuna ekleyin. Akışı aynı 50 mL konik tüpte toplayın.
   19. Sıvı damlaları yavaşça damlamaya başladığında, bir sonraki 50 mL konik tüpü sütunun altına yerleştirin. İlk akışı (adım 4.4.18) sütuna ekleyin. Altındaki 50 mL konik tüpte toplayın.
   20. Sıvı damlaları yavaşça damlamaya başladığında, sütunu yıkamak için 500 μL MACS tamponu 3x ekleyin.
   21. Sütunu mıknatıstan çıkarın. Kolonu 15 mL konik tüpe yerleştirin. Sütuna 1 mL soğuk PBS ekleyin.
   22. Hücreleri toplamak için, pistonu plastik manşondan alın ve sıkıca sütuna itin.
   23. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. PBS ile hücre süspansiyonunu 5 mL'ye getirin. 200 × g'da 5 dakika santrifüj.
   24. Hücreler santrifüjlemeye tabi tutulurken, hücre tohumlamasına hazırlanmak için bazal membran matrisi 3 kaplı şişeyi 5 mL PBS ile 3x yıkayın. PBS'yi aspire edin ve bazal membran matrisi 3 kaplamalı şişeye 20 mL Endotelyal Şartlandırılmış ortam ekleyin.
   25. Hücreleri santrifüjden çıkarın ve süpernatanı aspire edin. Endotelyal Şartlandırılmış ortamdaki hücreleri 26.000 hücre^/ cm2'de (1.95 × 10⁶ hücre / T75 şişe) tohumlanacak şekilde yeniden askıya alın. Hücreleri tohumlayın.
   26. Sıralama verimliliğini ve hücre verimini hesaplamak için, adım 4.4.23'teki hücre sayısını, adım 4.4.9'daki hücre sayısına bölün.
5. 8-15. günler: viEC'lerin genişletilmesi
   1. Ertesi gün (8. gün), harcanan ortamı şişeden aspire edin. 10 mL Endotelyal Şartlandırılmış ortam ile değiştirin. Endotel Şartlandırılmış ortamı, şişe% 90 akıcı olana kadar veya Endotel Şartlandırılmış orta boy şişe tamamen kullanılana kadar her gün değiştirin.
   2. Harcanan ortamı aspire edin ve sürekli genişleme için her gün 10 mL Endotel Bakım ortamı (Ek Tablo S1) ile değiştirin.
   3. ViEC'leri geçmek için, iki adet bazal membran matrisi 3 kaplamalı T75 şişe hazırlayın. Şişeleri oda sıcaklığında 1 saat bekletin. Taze hazırlanmış şişeleri 5 mL PBS ile 3x iyice yıkayın.
   4. PBS'yi aspire edin. Taze hazırlanmış her şişeye 10 mL sıcak Endotel Bakım ortamı ekleyin. Hücreler aşağıda açıklandığı gibi tohumlama için hazırlanırken plakaları 37 ° C'de inkübe edin.
   5. %90 birleşik T75 şişesi viECs'ye 5 mL hücre ayırma tamponu ekleyin. 5-7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 5 mL sıcak DMEM/F12 ekleyin. 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj.
   6. Süper natantı aspire edin. 1 mL sıcak Endotel Bakım ortamında yeniden askıya alın. Yeni hazırlanmış T75 şişelerinin her birine 500 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
   7. Ertesi gün, harcanan ortamı aspire edin. 10 mL Endotel Bakım ortamı ile değiştirin. Harcanan ortamı aspire edin ve şişe% 90 birleşene kadar her gün 10 mL Endotel Bakım ortamı ile değiştirin.

5. Gün 14: Hücre kültürü için mikroakışkan organ çip cihazlarının hazırlanması

1. Plazma işleme ve bazal membran matris 2 kaplama
   1. Bodrum membran matrisi 2 çözeltisini hazırlayın (adım 1.3). Bir kenara koyun.
   2. Steril bir doku kültürü davlumbazında, steril 100 mm x 15 mm yuvarlak Petri kabını ambalajından çıkarın. Petri kabının üst kısmını, aşağı bakacak şekilde, Petri kabının alt kısmının altına yerleştirin (Ek Şekil S1B).
   3. Cımbız kullanarak, mikroakışkan çipleri paketten çıkarın ve Petri kabının içine yerleştirin. Petri kabını, kapağı tabağın altından kullanarak kapatın.
   4. Plazma asherinde, Petri çanağı kapağını kabın altına, üstten aşağıya bakacak şekilde yerleştirin ve bunları tek bir birim olarak bir arada tutun. Petri çanak ünitesini plazma asher odasına yerleştirin. Plazma asherini 100 W, 15 SCCM, 30 s'de oksijenle başlatın.
   5. Zamana duyarlı: Tedavi tamamlandıktan sonra, Petri kabı ünitesini plazma asherinden çıkarın. Petri kabı kapağını, laboratuvar mendili üzerine püskürtülen% 70 etanol ile hızlı ve hafif bir şekilde silin. Petri kabını kapağıyla örtün.
   6. Petri kabını steril doku kültürü başlığına getirin. Çipin idrar (üst) kanalına nazikçe 25 μL bazal membran matris 2 çözeltisi ekleyin. Çipin kılcal (alt) kanalına 20 μL bazal membran matrisi 2 çözeltisi ekleyin.
   7. İki steril 15 mL konik tüp kapağı alın ve steril damıtılmış suyla (~ 500 μL) doldurun. Talaş kanallarının ve membranın kurumasını önlemek için kapağı Petri kabına yerleştirin. Kapağı tabağın üzerine yerleştirin. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.

6. ViEC'lerin ve ara mezoderm hücrelerinin mikroakışkan cihazlara tohumlanması

1. 15. Gün: viECs
   1. Ortamı, %90 akıcılı viEC'ler içeren T75 şişelerinden aspire edin. 5 mL hücre ayrılma tamponu ekleyin ve 5-7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   2. Hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 5 mL DMEM/F12 ekleyin. 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj.
      NOT: Yaklaşık %90 birleşik viEC'ye sahip her T75 şişesi ~3 milyon hücre üretecektir.
   3. Süper natantı aspire edin. Yaklaşık 2 milyon hücre / 300 μL elde etmek için 300 μL Endotel Bakım ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu bir kenara koyun.
   4. Mikroakışkan çipleri içeren Petri kabını doku kültürü başlığına aktarın. Bir aspiratörün ucuna bir P200 bariyer ucu takın.
   5. Mikroakışkan çipin hem üst hem de alt kanallarını 200 μL DMEM/F12 ile yıkayın ve aynı anda çıkışın çevresini aspire edin.
   6. Aspiratöre bağlı P200 bariyer ucu ile çipi alt kanalın çıkışından uzakta sıkıca tutun. Yaklaşık 134.000 hücreli viEC süspansiyonunun 20 μL'sini çipin kılcal (alt) kanalına sıkıca enjekte edin. Ortamı çıkışın çevresinden dikkatlice aspire edin.
   7. Mikroskop altında kabarcıklar veya düzensiz bir viEC tohumlama yoğunluğu olup olmadığını kontrol edin.
   8. ViEC'lerin esnek PDMS membranının bazal tarafına yapışabilmesi için çipi ters çevirmek üzere yavaşça ters çevirin. Çipi tutucu kartuşa yerleştirin. Membranın kurumasını önlemek için talaş tutucu kartuşa 3 mL PBS ekleyin. Çipi 3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   9. Mikroskop altındaki alt kanalda, esnek PDMS membranına bağlı birleşik bir viECs katmanı olup olmadığını kontrol edin. Alt kanalın girişine 200 μL Endotel Bakım ortamı bırakın ve kılcal (alt) kanal çıkışının çevresinden dikkatlice aspire olurken bağlanmamış endotel hücrelerinin kanalını yıkamak için kanaldan akmasına izin verin.
   10. Çipi tekrar tutucu kartuşa takın. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
2. 16. Gün: ara mezoderm (IM) hücreleri
   1. Kılcal (alt) kanalı 200 μL Endotel Bakım ortamı ile nazikçe yıkayın ve çıkış portunun çevresini dikkatlice aspire edin.
   2. İdrar (üst) kanalını 200 μL DMEM/F12 ile yıkayın ve çıkışın çevresini dikkatlice aspire edin. Giriş ve çıkış portlarına ~50 μL DMEM/F12 bırakın.
   3. Orta Mezoderm İndüksiyon ortamını 12 delikli plakanın her bir kuyucuğundan aspire edin.
      NOT: Farklılaşmanın sonundaki her kuyucuk yaklaşık 1,5 milyon IM hücresi verir.
   4. 12 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL Tripsin-EDTA ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   5. Bir hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri nazikçe kazıyın ve bir P1000 kullanarak hücreleri ayırmak için yukarı ve aşağı pipet yapın. Her bir kuyucuğa 2 mL Tripsin Nötralizasyon çözeltisi (Ek Tablo S1) ekleyin. Hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. DMEM/F12 ile hücre süspansiyon hacmini 50 mL'ye getirin ve 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın.
   6. Süper natantı aspire edin. Yaklaşık 3 milyon hücre / 500 μL elde etmek için 500 μL Ara Mezoderm İndüksiyon ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın.
   7. Çipi, aspiratöre bağlı P200 bariyer ucu ile idrar (üst) kanalının çıkışından uzakta sıkıca tutun. Yaklaşık 112.500 IM hücreli 25 μL hücre süspansiyonunu çipin idrar (üst) kanalına sıkıca enjekte edin ve ortamı çıkışın çevresinden dikkatlice aspire edin.
   8. Mikroskop altında kabarcıklar veya düzensiz bir IM hücre tohumlama yoğunluğu olup olmadığını kontrol edin. Çip tutucu kartuşuna 3 mL PBS ekleyin. 3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   9. Her iki kanalı da kendi hücre kültürü ortamlarından 200 μL ile yıkayın, harcanan ortamın ve hücre kalıntılarının geriye doğru akışını önlemeye yardımcı olmak için talaş çıkışlarının çevresini dikkatlice aspire edin.
   10. Boş P200 bariyer uçlarını idrar ve kılcal kanalların her iki çıkışına da takın. 200 μL Endotel Bakım Ortamı pipeti ve yarısını kılcal kanal girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın, böylece kanalın hem girişi hem de çıkışı artık ortamla doldurulmuş pipet uçlarına tutturulacaktır.
   11. Pipet 200 μL IM bakım ortamı ve yarısını idrar kanalı girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın, böylece kanalın hem girişi hem de çıkışı artık ortamla doldurulmuş pipet uçlarına tutturulacaktır. Talaşları gece boyunca 37 ° C'ye gömülü uçlarla inkübe edin.
3. Sıvı akışı ve mekanik gerinim uygulamak için çipleri Organ Çipi Biyoreaktörüne bağlayın.
   1. P200 uçlarını idrar ve kılcal kanallardan çıkarın. Kurumayı önlemek için idrar ve kılcal kanalların giriş ve çıkışına ilgili ortamın damlacıklarını ekleyin.
   2. İdrar giriş haznesine 3 mL sıcak Podosit İndüksiyon ortamı (Ek Tablo S1) ekleyin. Kılcal giriş rezervuarına 3 mL sıcak Endotel Bakım ortamı ekleyin.
   3. Doğrudan çıkış portu üzerindeki idrar kanalı çıkış rezervuarına 300 μL sıcak Podosit İndüksiyon ortamı ekleyin. Doğrudan çıkış portu üzerindeki kılcal kanal çıkış rezervuarına 300 μL sıcak Endotel Bakım ortamı ekleyin.
   4. Baklaları tepsiye ve Organ Çipi Biyoreaktörüne kaydırın.
   5. Prime Cycle'ı (2 dk) seçmek ve başlatmak için Organ Çipi Biyoreaktörü üzerindeki Döner Kadranı kullanın. Bölmenin alt tarafında, dört akışkan bağlantı noktasının tümünde küçük damlacıklar olup olmadığını görsel olarak kontrol edin.
   6. Pod'un alt tarafı ile mikroakışkan çip bağlantı noktaları arasında sıvı-sıvı teması sağlamak için, çip taşıyıcısını yavaşça Pod'un içine kaydırın. Çip taşıyıcı tırnağını yavaşça içeri ve yukarı doğru bastırın. Talaş yüzeyinden fazla ortamı aspire edin.
   7. Organ Çipi Biyoreaktörü akış hızını 60 μL/s olarak ayarlayın. Döngüsel gerinimi 0,4 Hz'de %10'a ayarlayın. Organ Çipi Biyoreaktörü üzerindeki Döner Kadranı kullanarak Düzenleme Döngüsünü seçin ve 2 saat boyunca çalıştırın.
   8. Çıkış rezervuarlarını ortam seviyesinde bir artış olup olmadığını görsel olarak inceleyin.
   9. Düzenleme döngüsünü seçmek için Organ Çipi Biyoreaktörü üzerindeki döner kadranı kullanın.

7. 17-21 ve sonraki günler: podosit indüksiyonu ve talaş bakımı

1. Ortamı idrar kanalı çıkış rezervuarlarından çapraz olarak limandan uzağa aspire edin, ancak kültürün her günü rezervuarda bir miktar ortam bulundurun. İdrar kanalı giriş rezervuarını 5 gün boyunca her 2 günde bir 3 mL'ye kadar Podosit İndüksiyon ortamı ile doldurun.
   1. 5 gün sonra, ortamı idrar kanalından aspire edin, ancak rezervuarda bir miktar ortam tutun. İdrar kanalı giriş haznesini günlük 3 mL Podosit Bakım ortamı ile doldurun.
2. Ortamı kılcal kanal çıkış rezervuarlarından çapraz olarak limandan uzağa aspire edin, ancak kültürün her günü rezervuarda bir miktar ortam tutun. Kılcal kanal giriş haznesini günlük olarak 3 mL'ye kadar Endotel Bakım ortamı ile doldurun.

8. Fonksiyonel tahlil ve immünofloresan görüntüleme

NOT: Akış sitometrisi analizi, talaş atık suyu için ELISA ve mRNA izolasyonu hakkında ayrıntılar için Ek Dosya 1'e bakın.

1. İnülin ve albümin kullanarak fonksiyonel tahlil (moleküler filtrasyon)
   1. Ortamı kılcal kanal çıkış rezervuarından çapraz olarak limandan uzağa aspire edin, ancak rezervuarda bir miktar ortam tutun. 6 saat boyunca inülin ve albümin (Ek Tablo S1) ile desteklenmiş 3 mL Endotel Bakım ortamı ile değiştirin.
   2. 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, idrar kanalından ortamın hacmini (mL cinsinden) ölçün ve 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Işıktan korumak ve florofor konjuge inülin ve albüminin fotobeyazlatmasını en aza indirmek için tüpü alüminyum folyoya sarın. Rezervuarı 3 mL Podosit Bakım ortamı ile doldurun.
   3. Podosit Bakım ortamında bir stok inülin çözeltisi hazırlayın. 25 μg / mL İnülinden başlayarak, Podosit Bakım ortamında 2x seri seyreltme yoluyla sekiz inülin standardı hazırlayın.
   4. Benzer şekilde, Podosit Bakım ortamında bir albümin stok çözeltisi hazırlayın. 150 μg/mL albüminden başlayarak, Podosit Bakım ortamında 2x seri seyreltme yoluyla sekiz standart albümin hazırlayın.
   5. Her standart inülin konsantrasyonunun 100 μL'sini siyah, 96 delikli bir plakanın (veya toplam 16 inülin kuyucuğunun) her bir kuyucuğuna kopyalayan pipet. Her standart albümin konsantrasyonunun 100 μL'sini aynı 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna (toplam 16 albümin kuyucuğu) kopyalayan pipet. Boş olarak kullanılmak üzere 100 μL Podosit Bakım ortamındaki pipet (veya Podosit Bakım ortamının toplam iki kuyucuğu).
   6. Pipet, idrar kanalından aynı 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 100 μL atık su ortamını çoğaltın. Kılcal kanaldan 100 μL atık su ortamını çoğaltın.
   7. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve albümin için floresanı 550 nm uyarma ve emisyon 615 nm'de ölçün. İnülin için aynı plakayı 513 nm uyarımda ve emisyon 577 nm'de ölçün.
   8. Oluşturulan verilerden, yinelenen ölçümlerin ortalaması (çip başına). Bu plaka okumasına karşılık gelen boş değeri, sayfadaki verilerin geri kalanından çıkarın.
   9. X ekseninde konsantrasyon [μg / mL] ve y ekseninde floresan ile standart bir eğri oluşturmak için albümin standartlarına karşılık gelen değerleri çizin. X ekseninde konsantrasyon [μg / mL] ve y ekseninde floresan ile standart bir eğri oluşturmak için inülin standartlarına karşılık gelen değerleri çizin.
   10. Çiplerden atık su ortamında sırasıyla idrar inülin ve albümin konsantrasyonunu belirlemek için istatistiksel bir analiz yazılım paketi ve doğrusal enterpolasyon kullanın.
   11. (1)² denklemini kullanarak çiplerden inülin/albüminin idrar klerensini belirleyin:
       İdrar Klirensi = ([U] × UV) / [P] (1)
       [U] 'nun 8.1.10 adımındaki idrar konsantrasyonu olduğu durumlarda, UV 8.1.2 adımından toplanan idrar kanalı atık suyunun hacmidir ve [P] inülin veya albüminin kılcal konsantrasyonudur (10 μg / mL inülin veya 100 μg / mL albümin).
2. İmmünofloresan görüntüleme
   1. İdrar ve kılcal kanalların çıkış portlarına boş bir P200 ucu enjekte edin. Hücreleri sabitlemek için, 200 μL% 4 formaldehit pipeti yapın ve yarısını alt kanal girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın.
   2. Pipet 200 μL% 4 formaldehit ve yarısını idrar kanalı girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın, böylece kanalın hem girişi hem de çıkışı artık fiksatif ile doldurulmuş pipet uçlarına tutturulacaktır.
   3. Cipsleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
   4. 20 dakika sonra tüm pipet uçlarını atın. İdrar ve kılcal kanalların çıkış portlarına temiz, boş P200 uçları enjekte edin. Hücreleri geçirgenleştirmek için, %0,125 Triton X-100/PBS'nin 200 μL'lik pipetini alın ve yarısını kılcal kanal girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın.
   5. %0,125 Triton X-100/PBS'lik 200 μL pipet ve yarısını idrar kanalı girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın. Çipi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
   6. Tüm pipet uçlarını atın. İdrar ve kılcal kanalların çıkış portlarına temiz, boş P200 uçları enjekte edin. Hücreleri bloke etmek için, %0.125 Triton X-100/PBS'de 200 μL %1 sığır serum albümini (BSA) pipetleyin ve yarısını kılcal kanal girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın.
   7. %0.125 Triton X-100/PBS'de 200 μL %1 BSA pipet ve yarısını idrar kanalı girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
   8. Tüm pipet uçlarını atın. Her kanala %0,125 Triton X-100/PBS'lik 200 μL pipetleme yaparak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe ederek her iki kanalı da 3 kat yıkayın.
   9. % 0.125 Triton X-100 / PBS'de üretici tarafından önerilen seyreltme ile kanal başına 100 μL birincil antikor hazırlayın. İdrar ve kılcal kanalların çıkış portlarına temiz, boş P200 uçları enjekte edin. Pipet 100 μL primer antikor ve yarısını ilgili kanallara enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın.
   10. Oda sıcaklığında 1 saat veya daha iyi sonuçlar için 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.
       NOT: Aynı anda birden fazla primer antikor uygulanabilir; Bununla birlikte, birincil antikor çözeltisi üreticinin talimatlarına göre seyreltilmelidir.
   11. Kanalları adım 8.2.8'de açıklandığı gibi 3 x 10 dakika yıkayın.
   12. % 0.125 Triton X-100 / PBS'de üretici tarafından önerilen seyreltme faktörü ile kanal başına 100 μL ikincil antikor hazırlayın. İdrar ve kılcal kanalların çıkış portlarına temiz, boş P200 uçları enjekte edin. Pipet 100 μL sekonder antikor ve yarısını ilgili kanallara enjekte edin. Pipet uçlarını girişin içinde serbest bırakın. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
       NOT: Her sekonder antikor ayrı ayrı uygulanmalıdır. Adım 8.2.8'e göre her uygulama arasında en az 3 x 10 dakika yıkayın.
   13. Kanalları adım 8.2.8'de açıklandığı gibi 3 x 10 dakika yıkayın.
   14. Her iki kanalı da 200 μL damıtılmış su ile bir kez yıkayın ve artık sıvıyı talaş çıkış portlarının çevresinden emin.
   15. Temiz, boş P200'ü idrar ve kılcal kanalların çıkış portlarına enjekte edin. Hücreleri boyamak için, 200 μL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, damıtılmış suda 1:1.000 seyreltme) pipeti yapın ve yarısını kılcal kanal girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içine bırakın ve 200 μL DAPI pipeti ve yarısını idrar kanalı girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içine bırakın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
   16. Tüm pipet uçlarını atın. İdrar ve kılcal kanalların çıkış portlarına temiz, boş P200 uçları enjekte edin. Hücreleri boyamak için, 200 μL falloidin pipeti (Ca 2+^{ve Mg 2+} olmadan PBS'de 1:1.000 seyreltme) ve yarısını kılcal kanal girişine enjekte edin ve pipet ucunu girişin içine bırakın. Pipet 200 μL falloidin (Ca 2+^{ve Mg 2+} olmadan PBS'de 1:1.000 seyreltme) ve yarısını idrar kanalı girişine enjekte edin ve pipet ucunu girişin içine bırakın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
   17. Kanalları Ca 2+^{ve Mg 2+} olmadan 200 μL PBS ile 3 kat yıkayın ve çıkış portlarının çevresinden fazla sıvıyı aspire edin.
   18. Çipleri görselleştirin.

Sonuçlar

Burada, glomerulusun fonksiyonel bir 3D in vitro modelinin, izojenik bir insan iPS hücresi kaynağından vaskülarize edilebileceğini ve epitelize edilebileceğini gösteriyoruz. Spesifik olarak, bu protokol, insan iPS hücre teknolojisinin, özellikle de özel hücre tiplerine farklılaşma yeteneklerinin, insan böbreğinin yapısını ve işlevini hastaya özgü düzeyde modellemek için mikroakışkan cihazlarla entegre edilebilen böbrek glomerüler epiteli (podositler) ve vasküler endotel (viECs) üretm...

Tartışmalar

Bu yazıda, izojenik bir insan iPS hücre hattından vasküler endotel ve glomerüler epitel (podositler) elde etmek için bir protokol ve bu hücrelerin böbrek glomerulusunun yapısını, doku-doku arayüzünü ve moleküler filtrasyon fonksiyonunu taklit eden bir çip üzerinde 3D organ sistemi oluşturmak için kullanımını özetlemekteyiz. Bu glomerulus çipi, birlikte seçici filtre moleküllerine bir bariyer sağlayan endotel ve glomerüler epitel ile donatılmıştır.

Bu protokolü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo/Life Technologies	A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Collagen IV	Thermo/Life Technologies	14-9871-82
Nephrin	Progen	GP-N2
PECAM-1	R&D Systems	AF806
Podocin	Abcam	ab50339
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, Human	Corning	356008	Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment	Iwai North America	N8922012	Basement membrane matrix (2)
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial	BD Biosciences	354277	Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation
Cells
DU11 human iPS cells			The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
2-Mercaptoethanol	Thermo/Life Technologies	21985023
Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate	Thermo/Life Technologies	A23017
All-trans retinoic acid (500 mg)	Stem Cell Technologies	72262
B27 serum-free supplement	Thermo/Life Technologies	17504044
B-27 supplement (50x) without Vitamin A	Thermo/Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418
CHIR99021	Stemgent	04-0004	May show lot-to-lot variation
Complete medium kit with CultureBoost-R	Cell Systems	4Z0-500-R	Podocyte maintenance media
DMEM/F12	Thermo/Life Technologies	12634028
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement	Thermo/Life Technologies	10565042	DMEM/F12 with glutamine
Forskolin (Adenylyl cyclase activator)	Abcam	ab120058
GlutaMAX supplement	Thermo/Life Technologies	35050061	glutamine supplement
Heat-inactivated FBS	Thermo/Life Technologies	10082147
Heparin solution	Stem Cell Technologies	7980
Human Activin A	Thermo/Life Technologies	PHC9544
Human BMP4	Preprotech	120-05ET
Human BMP7	Thermo/Life Technologies	PHC9544
Human VEGF	Thermo/Life Technologies	PHC9394
Inulin-FITC	Sigma-Aldrich	F3272
mTeSR1 medium	Stem Cell Technologies	05850	Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C.
N-2 Supplement (100x)	Thermo/Life Technologies	17502048
Neurobasal media	Thermo/Life Technologies	21103049	Lateral mesoderm basal media
PBS (Phosphate-buffered saline)	Thermo/Life Technologies	14190-250
Penicillin-streptomycin, liquid (100x)	Thermo/Life Technologies	15140-163
ROCK inhibitor (Y27632)	Tocris	1254
StemPro-34 SFM	Thermo/Life Technologies	10639011	Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months.
TGF-Beta inhibitor (SB431542)	Stem Cell Technologies	72234
Enzymes and other reagents
Accutase	Thermo/Life Technologies	A1110501	Cell detachment buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2438
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade	VWR	97065-058
Paraformaldehyde (PFA)	Thermo/Life Technologies	28906
Sterile distilled water	Thermo/Life Technologies	15230162
Triton X-100	VWR	97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05%	Thermo/Life Technologies	25300-120
(Orb) Hub module	Emulate	ORB-HM1
100mm x 15 mm round petri dish	Fisherbrand	FB087579B
120 x 120 mm square cell culture dish	VWR	688161
Accuri C6	BD Biosciences
Aspirating pipettes, individually wrapped	Corning	29442-462
Aspirating Unit	SP Bel-Art	F19917-0150
Avanti J-15R Centrifuge	Beckman Coulter	B99516
Conical centrifuge tube, 15 mL	Corning	352097
Conical centrifuge tube, 50 mL	Corning	352098
EVOS M7000	Thermo/Life Technologies	AMF7000	Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.
Hemocytometer	VWR	100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo/Life Technologies	51030403
Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera	Carl Zeiss Micrscopy	491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)
Kimberly-Clark nitrile gloves	VWR	40101-346
Kimwipes, large	VWR	21905-049
Leoca SP8 Upright Confocal Microscope
Media reservoir (POD Portable Module)	Emulate	POD-1
Microplate shaker	VWR	12620-926
Organ-chip	Emulate	S-1 Chip
Organ-chip holder	Emulate	AK-CCR
P10 precision barrier pipette tips	Denville Scientific	P1096-FR
P100 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1125
P1000 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1121
P20 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1122
P200 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1122
Plasma Asher	Quorum tech	K1050X RF	This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).
Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap	Corning	352235
Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped	Corning	356551
Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped	Corning	356525
Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped	Corning	356543
Steriflip, 0.22 µm, PES	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile Microcentrifuge tubes	Thomas Scientific	1138W14
T75cm2 cell culture flask with vent cap	Corning	430641U
Tissue culture-treated 12 well plates	Corning	353043
Tissue culture-treated 6 well plates	Corning	353046
Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module)	Emulate	ZOE-CM1	Organ Chip Bioreactor
VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated	Miltenyi Biotec	130-126-010
Wide-beveled cell lifter	Corning	3008
MACS
CD144 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-097-857
CD31 MicroBead Kit, human	Miltenyi Biotec	130-091-935
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401