Isogener Nieren-Glomerulus-Chip aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Entwicklung eines personalisierten Organ-on-a-Chip-Systems vorgestellt, das die Struktur und Funktion der nierenglomerulären Filtrationsbarriere rekapituliert, indem genetisch angepasste Epithel- und vaskuläre Endothelzellen integriert werden, die sich von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen unterscheiden. Dieses biotechnologisch hergestellte System kann die Nierenpräzisionsmedizin und verwandte Anwendungen voranbringen.

Zusammenfassung

Chronische Nierenerkrankungen (CKD) betreffen 15% der erwachsenen US-Bevölkerung, aber die Etablierung gezielter Therapien wurde durch den Mangel an Funktionsmodellen eingeschränkt, die menschliche biologische Reaktionen und Nephrotoxizität genau vorhersagen können. Fortschritte in der Nierenpräzisionsmedizin könnten helfen, diese Einschränkungen zu überwinden. Zuvor etablierte In-vitro-Modelle des menschlichen Nierenglomerulus - der primäre Ort für die Blutfiltration und ein Hauptziel vieler Krankheiten und Arzneimitteltoxizitäten - verwenden jedoch typischerweise heterogene Zellpopulationen mit begrenzten funktionellen Eigenschaften und unübertroffenen genetischen Hintergründen. Diese Eigenschaften schränken ihre Anwendung für die patientenspezifische Krankheitsmodellierung und therapeutische Entdeckung erheblich ein.

Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, das humanes induziertes pluripotentes Stamm (iPS) Zell-abgeleitetes glomeruläres Epithel (Podozyten) und vaskuläres Endothel von einem einzigen Patienten integriert, um einen isogenen und vaskularisierten mikrofluidischen Nierenglomerulus-Chip zu entwickeln. Der resultierende Glomerulus-Chip besteht aus Stammzell-abgeleiteten Endothel- und Epithelzellschichten, die linienspezifische Marker exprimieren, Basalmembranproteine produzieren und eine Gewebe-Gewebe-Schnittstelle bilden, die der glomerulären Filtrationsbarriere der Niere ähnelt. Der konstruierte Glomerulus-Chip filtert selektiv Moleküle und rekapituliert medikamenteninduzierte Nierenschäden. Die Fähigkeit, die Struktur und Funktion des Nierenglomerulus mithilfe isogener Zelltypen zu rekonstruieren, schafft die Möglichkeit, Nierenerkrankungen mit Patientenspezifität zu modellieren und den Nutzen von Organs-on-Chips für die Nierenpräzisionsmedizin und verwandte Anwendungen voranzutreiben.

Einleitung

Organ-on-a-Chip-Geräte sind dynamische 3D-In-vitro-Modelle, die molekulare und mechanische Stimulation sowie Vaskularisation verwenden, um Gewebe-Gewebe-Schnittstellen zu bilden, die die Struktur und Funktion bestimmter Organe modellieren. Zuvor etablierte Organ-on-a-Chip-Geräte, die darauf abzielten, den Glomerulus der Niere (Glomerulus-Chips) zu rekapitulieren, bestanden aus tierischen Zelllinien¹ oder menschlichen primären und immortalisierten Zelllinien heterogener Quellen ^2,3. Die Verwendung genetisch heterogener Zellquellen weist Variationen auf, die die Studien zu patientenspezifischen Reaktionen und Genetik oder Mechanismen der Krankheit signifikant einschränken ^4,5. Die Bewältigung dieser Herausforderung hängt von der Verfügbarkeit isogener Zelllinien ab, die von spezifischen Individuen mit erhaltenen molekularen und genetischen Profilen stammen, um eine genauere Mikroumgebung für die Entwicklung von In-vitro-Modellen bereitzustellen ^2,3,6. Isogene Zelllinien menschlichen Ursprungs können nun aufgrund der Fortschritte in der humanen iPS-Zellkultur leicht erzeugt werden. Da humane iPS-Zellen typischerweise nicht-invasiv gewonnen werden, sich unbegrenzt selbst erneuern und sich in fast jeden Zelltyp differenzieren können, dienen sie als attraktive Zellquelle für die Etablierung von In-vitro-Modellen wie dem Glomerulus-Chip ^7,8. Die glomeruläre Filtrationsbarriere ist die primäre Stelle für die Blutfiltration. Blut wird zuerst durch vaskuläres Endothel, die glomeruläre Basalmembran, und schließlich durch spezialisiertes Epithel gefiltert, das Podozyten genannt wird. Alle drei Komponenten der Filtrationsbarriere tragen zur selektiven Filtration von Molekülen bei. Hier wird ein Protokoll zur Etablierung eines Organ-on-a-Chip-Geräts vorgestellt, das mit vaskulärem Endothel und glomerulärem Epithel aus einer einzigen menschlichen iPS-Zellquelle verbunden ist. Während dieses Protokoll besonders nützlich ist, um einen isogenen und vaskularisierten Chip zu entwickeln, um die glomeruläre Filtrationsbarriere zu rekapitulieren, bietet es auch eine Blaupause für die Entwicklung anderer Arten von personalisierten Organ-on-Chips und Multi-Organ-Plattformen wie ein isogenes "Body-on-a-Chip" -System.

Das hierin beschriebene Protokoll beginnt mit der divergenten Differenzierung menschlicher iPS-Zellen in zwei getrennte Linien - laterale Mesoderm- und Mesodermzellen, die anschließend in vaskuläres Endothel bzw. glomeruläres Epithel differenziert werden. Um laterale Mesodermzellen zu erzeugen, wurden menschliche iPS-Zellen auf Basalmembranmatrix 1-beschichteten Platten ausgesät und für 3 Tage (ohne Medienaustausch) in N2B27-Medium kultiviert, ergänzt mit dem Wnt-Aktivator CHIR 99021 und dem potenten Mesoderm-Induktor, bone-morphogenetic 4 (BMP4). Die resultierenden lateralen Mesodermzellen waren zuvor durch die Expression von Brachyury (T), Mix-Paired-like Homöobox (MIXL) und Eomesodermin (EOMES)⁹ charakterisiert. Anschließend wurden die lateralen Mesodermzellen für 4 Tage in einem mit VEGF165 und Forskolin ergänzten Medium kultiviert, um vaskuläre Endothelzellen zu induzieren, die basierend auf VE-Cadherin- und/oder PECAM-1-Expression mittels magnetisch-aktivierter Zellsortierung (MACS) aussortiert wurden. Die resultierenden vaskulären Endothelzellen (viEC) wurden expandiert, indem sie auf Basalmembranmatrix 3-beschichteten Kolben kultiviert wurden, bis sie bereit waren, in der mikrofluidischen Vorrichtung zu säen.

Um Mesodermzellen zu erzeugen, wurden humane iPS-Zellen auf Basalmembranmatrix 2-beschichteten Platten ausgesät und 2 Tage lang in einem Medium kultiviert, das Activin A und CHIR99021 enthielt. Die resultierenden Mesodermzellen wurden durch die Expression von HAND1, Goosecoid und Brachurie (T) charakterisiert, wie zuvor^beschrieben 2,10,11. Um eine intermediäre Mesodermzelldifferenzierung (IM) zu induzieren, wurden die Mesodermzellen 14 Tage lang in einem mit BMP-7 und CHIR99021 ergänzten Medium kultiviert. Die resultierenden IM-Zellen exprimieren Wilm-Tumor 1 (WT1), gepaartes Box-Gen 2 (PAX2) und odd-skipped verwandtes Protein 1 (OSR-1)2,10,11.

Ein zweikanaliger Mikrofluidik-Chip auf Basis von Polydimethylsiloxan (PDMS) wurde entwickelt, um die Struktur der glomerulären Filtrationsbarriere in vitro zu rekapitulieren. Der Harnkanal beträgt 1.000 μm x 1.000 μm (b x h) und die Kapillarkanalabmessung 1.000 μm x 200 μm (b x h). Zyklische Dehnungs- und Entspannungszyklen wurden durch die Hohlkammern auf jeder Seite der Fluidkanäle erleichtert. Die Zellen wurden auf eine flexible, 50 μm dicke PDMS-Membran gesetzt, die den Harn- und Kapillarkanal trennt. Die Membran ist mit hexagonalen Poren (7 μm Durchmesser, 40 μm Abstand) ausgestattet, um die interzelluläre Signalübertragung zu fördern (Abbildung 1A)^2,12. Zwei Tage vor Abschluss der IM-Induktion wurden die mikrofluidischen Chips mit der Basalmembranmatrix 2 beschichtet. viECs wurden 1 Tag vor Abschluss der IM-Induktion mit Endothelial Maintenance Medium in den Kapillarkanal des mikrofluidischen Chips ausgesät, und der Chip wurde auf den Kopf gestellt, um die Zelladhäsion auf der basalen Seite der ECM-beschichteten PDMS-Membran zu ermöglichen. An dem Tag, an dem die IM-Induktion abgeschlossen war, wurden die Zellen in den Harnkanal des mikrofluidischen Chips ausgesät, wobei ein Medium verwendet wurde, das mit BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165 und allen trans-Retinsäure ergänzt wurde, um eine Podozytendifferenzierung innerhalb des Chips zu induzieren. Am folgenden Tag wurden die Medienreservoirs mit Podozyten-Induktionsmedium und Endothel-Erhaltungsmedium gefüllt, und 10% mechanische Dehnung bei 0,4 Hz und Flüssigkeitsfluss (60 μL/h) wurden auf die Chips angewendet.

Die zellularisierten mikrofluidischen Chips wurden für weitere 5 Tage mit Podozyten-Induktionsmedium (im Harnkanal) und Endothelial-Erhaltungsmedium (im Gefäßkanal) kultiviert. Die resultierenden Nierenglomerulus-Chips wurden für bis zu 7 weitere Tage in Erhaltungsmedien sowohl für die Podozyten- als auch für die Endothelzellen kultiviert. Die differenzierten Podozyten exprimierten positiv lineagespezifische Proteine, einschließlich Podocin und Nephrin 13,14, während viECs die Linienidentifikationsproteine PECAM-1 und VE-Cadherin positiv exprimierten, die alle essentielle Moleküle für die Aufrechterhaltung der Integrität der glomerulären Filtrationsbarriere sind ^15,16 . Es wurde festgestellt, dass die Podozyten und viECs beide das am häufigsten vorkommende glomeruläre Basalmembranprotein, Kollagen IV, absondern, das auch für die Gewebereifung und -funktion wichtig ist.

Das Dreikomponentensystem der Filtrationsbarriere - Endothel, Basalmembran und Epithel - in den Glomerulus-Chips filterte selektiv Moleküle und reagierte auf eine chemotherapeutische, nephrotoxische medikamentöse Behandlung. Die Ergebnisse der medikamentösen Behandlung zeigten, dass der Glomerulus-Chip für Nephrotoxizitätsstudien und zur Krankheitsmodellierung verwendet werden kann. Dieses Protokoll liefert die allgemeine Richtlinie für die Entwicklung eines funktionellen mikrofluidischen Nierenglomerulus-Chips aus isogenen iPS-Zellderivaten. Nachgeschaltete Analysen des konstruierten Chips können nach Wunsch des Forschers durchgeführt werden. Weitere Informationen zur Verwendung des Glomerulus-Chips zur Modellierung medikamenteninduzierter glomerulärer Schädigungen finden Sie in früheren Publikationen ^2,12.

Protokoll

1. Herstellung von Basalmembranmatrixlösungen und beschichteten Substraten

1. Basalmembranmatrix 1 über Nacht auf Eis bei 4 °C auftauen. Aliquot nach dem Vorschlag des Herstellers für das Verdünnungsverhältnis. Mischen Sie mit einem 50-ml-Konikröhrchen und einer Pipette gründlich eine geeignete Menge der Basalmembranmatrix 1 in 25 ml kaltes DMEM/F12, bis sie vollständig aufgetaut und aufgelöst ist.
   1. Um ein gefrorenes Aliquot aufzulösen, nehmen Sie ~ 200 μL aus den 25 mL kaltem DMEM / F12 und geben Sie es in das gefrorene aliquote Röhrchen. Pipettieren Sie auf und ab, bis die Matrix gründlich aufgetaut und aufgelöst ist. Übertragen Sie den vollen Röhreninhalt der Basalmembranmatrix 1 in den Rest des kalten DMEM/F12.
2. 1 ml Basalmembranmatrix 1 Lösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte pipettieren. Um die beschichteten Platten noch am selben Tag zu verwenden, inkubieren Sie bei 37 °C für 2 h.
   1. Alternativ können die beschichteten Platten mit Parafilm umwickelt und bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden. Wenn die gelagerte Platte einsatzbereit ist, bei 37 °C 30 min inkubieren.
3. Verdünnen Sie die Basalmembranmatrix 2 in 9 ml sterilem destilliertem Wasser, um eine Endkonzentration von 5 μg / ml zu erreichen. Pipettieren Sie 700 μL Basalmembranmatrix 2-Lösung in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. Die Basalmembranmatrix 2-beschichteten Platten mit Parafilm umwickeln und bis zu 2 Wochen bei 4 °C lagern.
4. Rekonstituieren Sie lyophilisierte Basalmembranmatrix 3, um eine Endkonzentration von 1 mg / ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Ca + 2- und Mg ^{+ 2-frei}) zu erreichen, wie vom Hersteller vorgeschlagen. Ein 250 μL Aliquot wird auf eine Endkonzentration von 25 μg/ml in 9,75 ml PBS (Ca+2 und Mg⁺² frei) verdünnt. Verwenden Sie 6 ml dieser Lösung, um einen T75-Kolben zu beschichten (eine Endkonzentration von 2 μg/cm²). Lagern Sie die matrixbeschichteten Kolben bis zu 1 Woche bei 4 °C.

2. Humane iPS-Zellkultur

HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendete DU11-Linie wurde getestet und als frei von Mykoplasmen- und Karyotypanomalien befunden.

1. Basalmembranmatrix 1-beschichtete Platten bei 37°C für 1-2 h inkubieren.
2. Waschen Sie jede Vertiefung der 6-Well-Platte 3x mit 1 ml warmem (37 °C) DMEM/F12. Fügen Sie 2 ml humanes iPS-Zellkulturmedium (CCM) (Zusatztabelle S1) zu jeder Vertiefung der 6-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C, während die Zellen wie unten beschrieben für die Aussaat vorbereitet werden.
3. Waschen Sie jede Vertiefung der 6-Well-Platte mit humanen iPS-Zellen mit 1 ml warmem DMEM/F12.
4. Saugen Sie das DMEM/F12 ab. Fügen Sie 1 ml warmen Zellablösungspuffer zu jeder Vertiefung der 6-Well-Platte hinzu. Bei 37 °C 1 min inkubieren.
5. Untersuchen Sie jede Vertiefung visuell unter einem Mikroskop auf Dissoziation um die Ränder der Zellkolonie. Saugen Sie den Zellablösungspuffer vorsichtig von den Zellen ab. Waschen Sie jede Vertiefung vorsichtig mit 1 ml warmem DMEM/F12.
6. Untersuchen Sie die Platten unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich die Zellen nicht vollständig von der Platte gelöst haben oder versehentlich abgesaugt wurden.
7. Fügen Sie 3 mL warmes humanes iPS CCM in jede Vertiefung der 6-Well-Platte mit Zellen hinzu. Mit einem Zellheber die Kolonien vorsichtig abkratzen. Mischen Sie die Zellsuspension mit einer serologischen 5-ml-Pipette vorsichtig einmal in jeder Vertiefung nach oben und unten.
8. Nehmen Sie die neue Basalmembranmatrix 1-beschichtete Platte aus dem Inkubator. 0,5 mL der Zellsuspension in jede Vertiefung der neuen Basalmembranmatrix 1-beschichteten Platte überführen. Bewegen Sie die Platte in einer Achterbewegung, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren bei 37 °C in einem 5% CO₂ -Inkubator.
9. Das verbrauchte Medium wird abgesaugt und jeden Kulturtag durch 3 ml humanes iPS CCM ersetzt, bis die Zellen zu 70% konfluent sind (ca. 4 Tage nach der Passage).

3. Tage 0-16: Differenzierung humaner iPS-Zellen in intermediäre Mesodermzellen

1. Tage 0-2: Mesoderm-Induktion
   1. Kellermembranmatrix 2-beschichtete Platten von 4 °C auf Raumtemperatur für 2 h bewegen, um nach der Lagerung auszugleichen.
   2. Saugen Sie das verbrauchte Medium aus jeder Vertiefung der 6-Well-Platte ab, die etwa 70% konfluierende menschliche iPS-Zellen enthält. Waschen Sie die Zellen vorsichtig 3x mit 1 ml warmem DMEM/F12.
   3. Saugen Sie das DMEM/F12 ab. Fügen Sie 1 ml Zellablösungspuffer zu jeder Vertiefung der 6-Well-Platte menschlicher iPS-Zellen hinzu. Bei 37 °C 5-7 min inkubieren.
   4. Untersuchen Sie jede Vertiefung visuell unter einem Mikroskop auf Dissoziation um die Ränder der Zellkolonie. Mit einem Zellheber die Kolonien vorsichtig abkratzen.
   5. Übertragen Sie die Zellsuspensionen aus allen Vertiefungen der 6-Well-Platte in ein 15-ml-konisches Röhrchen und verwenden Sie einen P1000, um mehrmals auf und ab zu pipettieren, um eine einzellige Suspension der iPS-Zellen zu erhalten.
   6. Die Zellsuspension im konischen Röhrchen auf 14 mL mit DMEM/F12 füllen. 5 min bei 200 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
   7. Asspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 14 ml warmem DMEM/F12. Wiederholen Sie die Zentrifugation für 5 min bei 200 × g bei Raumtemperatur.
   8. Asspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Mesoderm-Induktionsmedium (Zusatztabelle S1). Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. In Mesoderm-Induktionsmedium verdünnen, um eine Endkonzentration von 1 × 10⁵ Zellen/ml zu erreichen.
   9. Saugen Sie die Beschichtung von der Basalmembranmatrix 2-beschichteten Platte ab. Spülen Sie jede Vertiefung der Basalmembranmatrix 2-beschichtete Platte 2x mit 1 mL warmem DMEM/F12 ab.
   10. Pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig 2x nach oben und unten. 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung der Basalmembranmatrix 2-beschichtete Platte überführen. Bewegen Sie die Platte vorsichtig in einer Achterbewegung, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
   11. Die Platte über Nacht bei 37 °C inkubieren. Am nächsten Tag (Tag 1) saugen Sie das verbrauchte Medium aus jeder Vertiefung der 12-Well-Platte ab. Durch 1 ml warmes Mesoderm-Induktionsmedium ersetzen. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
2. Tage 2-16: intermediäre Mesoderminduktion
   1. Saugen Sie das verbrauchte Mesoderm-Induktionsmedium ab. Ersetzen Sie durch 1 m L warmes intermediäres Mesoderm-Induktionsmedium (Zusatztabelle S1). Das verbrauchte Medium absaugen und 14 Tage lang täglich durch 1 ml warmes Intermediate Mesoderm Induktionsmedium ersetzen.

4. Tage 0-15: Differenzierung und Expansion humaner iPS-Zellen in vaskuläre Endothelzellen

1. Tag 0: Humane iPS-Zellaussaat
   1. Bereiten Sie 15 ml humanes iPS CCM mit ROCK-Inhibitor vor (Zusatztabelle S1). Bei 37 °C warm halten.
   2. Eine Basalmembranmatrix 1-beschichtete Platte für 1-2 h bei 37 °C inkubieren. Absaugen der Basalmembranmatrix 1. 3x mit 1 ml warmem DMEM/F12 waschen.
   3. Saugen Sie das DMEM/F12 ab. Fügen Sie 2 ml humanes iPS CCM mit ROCK Inhibitor in jede Vertiefung der 6-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C, während die Zellen wie unten beschrieben für die Aussaat vorbereitet werden.
   4. Saugen Sie das verbrauchte Medium aus jeder Vertiefung der 6-Well-Platte ab, die etwa 70% konfluierende menschliche iPS-Zellen enthält. Waschen Sie die Zellen vorsichtig 3x mit 1 ml warmem DMEM/F12.
   5. Saugen Sie das DMEM/F12 ab. Fügen Sie 1 ml Zellablösungspuffer zu jeder Vertiefung der 6-Well-Platte menschlicher iPS-Zellen hinzu. Bei 37 °C für 5-7 min inkubieren, um die Zellen in einzelne Zellen zu dissoziieren.
      HINWEIS: Aufgrund inhärenter Unterschiede zwischen iPS-Zelllinien muss der Benutzer die Zellen nach 5 Minuten visuell untersuchen, um die optimale Inkubationszeit zu bestimmen.
   6. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml konisches Röhrchen. Bringen Sie die Zellsuspension mit warmem DMEM / F12 auf 14 ml, um den Ablösungspuffer zu neutralisieren. 5 min bei 200× g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
   7. Den Überstand vorsichtig absaugen. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Human iPS CCM mit ROCK-Inhibitor. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
   8. Samen Sie die Zellen zwischen 37.000 und 47.000 Zellen / cm² (355.200 bis 451.200 Zellen / Vertiefung einer 6-Well-Platte). Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Aufgrund der inhärenten Unterschiede zwischen iPS-Zelllinien muss der Benutzer die optimale Seeding-Dichte bestimmen.
2. Tage 1-3: laterale Mesoderminduktion
   1. Am nächsten Tag (Tag 1) saugen Sie das verbrauchte Medium aus jeder Vertiefung der 6-Well-Platte menschlicher iPS-Zellen ab. Ersetzen Sie jede Vertiefung der 6-Well-Platte durch 5 ml laterales Mesoderm-Induktionsmedium (Zusatztabelle S1). Wenn Sie das Kulturgefäß (z. B. Kolben) vergrößern, ersetzen Sie im Allgemeinen das 3-fache Arbeitsvolumen im Kulturgefäß.
   2. Wechseln Sie dieses Medium 3 Tage lang nicht.
      HINWEIS: Das laterale Mesoderm-Induktionsmedium in den Vertiefungen ändert normalerweise die Farbe von rot nach gelb, wenn die Zellen die Nährstoffe verbrauchen. Trübes Medium oder Medium mit Bakterienwachstum ist jedoch nicht normal und sollte dekontaminiert und als solches verworfen werden.
3. Tage 4-6: Endothelzellinduktion
   1. Saugen Sie das verbrauchte Medium aus jeder Vertiefung der 6-Well-Platte ab. Ersetzen Sie jede Vertiefung der 6-Well-Platte durch 3 ml warmes endotheliales Induktionsmedium (Zusatztabelle S1). Die Platte über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   2. Sammeln Sie in den folgenden 2 Tagen (Tag 5 und 6) das verbrauchte Medium aus allen Bohrlöchern in ein 50-ml-konisches Röhrchen. Lagern Sie das konische Rohr bei 4 °C. Füllen Sie die Zellen mit 3 ml warmem endothelialem Induktionsmedium auf. Die Platte bei 37 °C inkubieren.
4. Tag 7: Sortierung von Endothelzellen (viEC)
   1. Nehmen Sie die Kellermembranmatrix 3 Kolben heraus und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für 1 h stehen.
   2. Bereiten Sie 50 ml MACS-Puffer vor (Zusatztabelle S1).
   3. Legen Sie Zellablösungspuffer, MACS-Puffer, Endothel-CCM und PBS (Ca 2+ und Mg²⁺ frei) auf Eis in die Gewebekulturhaube.
   4. Platzieren Sie den Magneten auf dem MACS-Ständer. Legen Sie zwei 50-ml-konische Röhrchen und ein 15-ml-konisches Rohr in einen konischen Tubenhalter.
   5. Legen Sie den MACS-Ständer (mit angebrachtem Magneten) und eine LS-Säule in die Gewebekulturhaube. Stellen Sie den konischen Rohrhalter (mit konischen Rohren im Inneren) auf dem MACS-Ständer unter dem Magneten auf (Zusatzfigur S1A).
   6. Sammeln Sie das verbrauchte Medium aus jeder Vertiefung der 6-Well-Platte in das 50-ml-konische Rohr aus Schritt 4.3.2. Waschen Sie jede Vertiefung der 6-Well-Platte mit PBS (Ca 2+ und Mg²⁺ frei).
   7. Saugen Sie die PBS ab. Fügen Sie 1 ml Zellablösungspuffer hinzu. Bei 37 °C für 5-7 min inkubieren, um die Zellen vollständig zu dissoziieren.
   8. Die Zellen werden in ein 50 ml konisches Röhrchen überführt. Bringen Sie die Zellsuspension mit kaltem Endothelial-CCM auf 15 ml. Bei 200 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
   9. Asspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml kaltem MACS-Puffer. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
   10. Fügen Sie der Zellsuspension 10 ml MACS-Puffer hinzu. 5 min bei 200 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
   11. Asspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 80 μL MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen. Fügen Sie 20 μL pro 10 Millionen Zellen FcR-Blockierungsreagenz, CD31-Mikroperlen und CD144-Mikrokügelchen hinzu. 15 min auf Eis inkubieren.
   12. Während die Zellsuspension inkubiert, zentrifugieren Sie das aus der endothelialen Induktion gewonnene Medium (Schritt 4.3.2) bei 200 × g für 10 min.
   13. Sammeln Sie den Überstand in einem 500 mL 0,22 μm Vakuumfilter. Bereiten Sie das endothelial konditionierte Medium vor (Zusatztabelle S1). Filtern Sie das Medium unter sterilen Bedingungen und halten Sie das Medium bei 37 °C warm.
       HINWEIS: Die Proliferationsrate der Endothelzellen beginnt nach Passage 3 abzunehmen. Um ein exponentielles Wachstum nach Passage 3 zu erreichen, kann endothelial konditioniertes und Erhaltungsmedium ab Passage 1 mit einem 10 μM TGF-Beta-Inhibitor (SB431542) ergänzt werden.
   14. Nach der 15-minütigen Inkubation in Schritt 4.4.11 werden 10 mL MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen (maximal 30 mL MACS-Puffer) zur Zellsuspension gegeben. Bei 200 × g 5 min zentrifugieren.
   15. Asspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie in 1 ml MACS-Puffer.
   16. Nehmen Sie die LS-Säule und ziehen Sie den Kolben aus der Spritze. Setzen Sie den Kolben wieder in die Kunststoffhülse ein. Legen Sie die Säule auf den Magneten.
   17. Positionieren Sie das erste 50-ml-konische Röhrchen unter der Säule. Fügen Sie der Spalte 1 ml MACS-Puffer hinzu. In der 50 ml konischen Röhre darunter sammeln.
   18. Lassen Sie die Flüssigkeit durchfließen, wenn auch nicht vollständig, um das Austrocknen der Säule zu verhindern. Wenn die Flüssigkeitstropfen langsam zu rieseln beginnen, fügen Sie die Zellsuspension in die Säule ein. Sammeln Sie den Durchfluss im selben 50-ml-konischen Röhrchen.
   19. Wenn die Flüssigkeitstropfen langsam zu rieseln beginnen, positionieren Sie das nächste 50-ml-konische Röhrchen unter der Säule. Fügen Sie der Spalte den anfänglichen Durchfluss (Schritt 4.4.18) hinzu. In der 50 ml konischen Röhre darunter sammeln.
   20. Wenn die Flüssigkeitstropfen langsam zu rieseln beginnen, fügen Sie 3x 500 μL MACS-Puffer hinzu, um die Säule zu waschen.
   21. Entfernen Sie die Säule vom Magneten. Legen Sie die Säule auf das 15-ml-konische Röhrchen. Fügen Sie der Säule 1 ml kaltes PBS hinzu.
   22. Um die Zellen zu sammeln, nehmen Sie den Kolben aus der Kunststoffhülse und drücken Sie ihn fest in die Säule.
   23. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Bringen Sie die Zellsuspension mit PBS auf 5 ml. 5 min bei 200 × g zentrifugieren.
   24. Während die Zellen zentrifugiert werden, waschen Sie den 3-beschichteten Kolben der Basalmembranmatrix 3x mit 5 ml PBS, um die Zellaussaat vorzubereiten. Das PBS wird abgesaugt und 20 ml endothelial konditioniertes Medium in den mit Basalmembranmatrix beschichteten Kolben gegeben.
   25. Entfernen Sie die Zellen aus der Zentrifuge und saugen Sie den Überstand ab. Resuspendieren Sie die Zellen in endothelial konditioniertem Medium, um bei 26.000 Zellen/cm² (1,95 × 10⁶ Zellen/T75-Kolben) ausgesät zu werden. Säen Sie die Zellen.
   26. Um die Sortiereffizienz und den Zellertrag zu berechnen, dividieren Sie die Zellzahl aus Schritt 4.4.23 durch die Zellzahl aus Schritt 4.4.9.
5. Tage 8-15: Erweiterung der viECs
   1. Am nächsten Tag (Tag 8) saugen Sie das verbrauchte Medium aus dem Kolben ab. Ersetzen Sie durch 10 ml endothelial konditioniertes Medium. Ersetzen Sie das endothelial konditionierte Medium alle zwei Tage, bis der Kolben zu 90% konfluent ist oder bis die Flasche des endothelial konditionierten Mediums vollständig verbraucht ist.
   2. Das verbrauchte Medium wird abgesaugt und jeden zweiten Tag durch 10 ml endotheliales Erhaltungsmedium (Zusatztabelle S1) ersetzt, um die Expansion fortzusetzen.
   3. Um die viECs zu passieren, bereiten Sie zwei Basalmembranmatrix 3-beschichtete T75-Kolben vor. Lassen Sie die Kolben 1 h bei Raumtemperatur. Die frisch zubereiteten Kolben 3x mit 5 mL PBS gründlich waschen.
   4. Saugen Sie die PBS ab. Fügen Sie 10 ml warmes Endothel-Erhaltungsmedium zu jedem frisch zubereiteten Kolben hinzu. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C, während die Zellen wie unten beschrieben für die Aussaat vorbereitet werden.
   5. Geben Sie 5 ml Zellablösungspuffer in einen 90% konfluierenden T75-Kolben mit viECs. Bei 37 °C 5-7 min inkubieren. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml konisches Röhrchen. Fügen Sie 5 ml warmes DMEM/F12 hinzu. Bei 200 × g für 5 min zentrifugieren.
   6. Asspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie in 1 ml warmem endothelialem Erhaltungsmedium. In jeden der frisch zubereiteten T75-Kolben werden 500 μL der Zellsuspension gegeben.
   7. Am nächsten Tag saugen Sie das verbrauchte Medium ab. Ersetzen Sie es durch 10 ml endotheliales Erhaltungsmedium. Das verbrauchte Medium wird abgesaugt und jeden zweiten Tag durch 10 ml endotheliales Erhaltungsmedium ersetzt, bis der Kolben zu 90 % konfluiert ist.

5. Tag 14: Vorbereitung von mikrofluidischen Organchips für die Zellkultur

1. Plasmabehandlung und Basalmembranmatrix 2 Beschichtung
   1. Basalmembranmatrix 2-Lösung vorbereiten (Schritt 1.3). Legen Sie es beiseite.
   2. Packen Sie in einer sterilen Gewebekulturhaube die sterile 100 mm x 15 mm große runde Petrischale aus. Legen Sie die Petrischale oben, nach unten, unter die Petrischale unten (ergänzende Abbildung S1B).
   3. Nehmen Sie die mikrofluidischen Chips mit einer Pinzette aus der Verpackung und legen Sie sie in die Petrischale. Verschließen Sie die Petrischale mit dem Deckel unter der Schale.
   4. Legen Sie an der Plasma-Asche den Petrischalendeckel nach oben nach unten unter die Schale, und halten Sie sie als eine Einheit zusammen. Stellen Sie die Petrischale in die Plasma-Aschekammer. Starten Sie den Plasma-Asher mit Sauerstoff bei 100 W, 15 SCCM, 30 s.
   5. Zeitkritisch: Sobald die Behandlung abgeschlossen ist, nehmen Sie die Petrischale aus dem Plasma-Asche. Wischen Sie den Petrischalendeckel schnell und leicht mit 70% Ethanol ab, das auf ein Labortuch gesprüht wird. Die Petrischale mit dem Deckel abdecken.
   6. Bringen Sie die Petrischale in die sterile Gewebekulturhaube. Geben Sie vorsichtig 25 μL Basalmembranmatrix 2-Lösung in den Harnkanal (oberen) Kanal des Chips. Geben Sie 20 μL Basalmembranmatrix 2-Lösung in den Kapillarkanal (unten) des Chips.
   7. Nehmen Sie zwei sterile 15 ml konische Schlauchkappen und füllen Sie sie mit sterilem destilliertem Wasser (~ 500 μL). Setzen Sie die Kappe in die Petrischale, um ein Austrocknen der Chipkanäle und der Membran zu verhindern. Setzen Sie den Deckel auf die Schale. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.

6. Aussaat von viECs und intermediären Mesodermzellen in die mikrofluidischen Vorrichtungen

1. Tag 15: viECs
   1. Das Medium wird aus T75-Kolben mit 90% konfluenten viECs abgesaugt. 5 ml Zellablösungspuffer zugeben und bei 37 °C für 5-7 min inkubieren.
   2. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml konisches Röhrchen. Fügen Sie 5 ml DMEM/F12 hinzu. Bei 200 × g 5 min zentrifugieren.
      HINWEIS: Jeder T75-Kolben mit ca. 90% konfluierenden viECs ergibt ~3 Millionen Zellen.
   3. Asspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 300 μL Endothelial Maintenance Medium, um etwa 2 Millionen Zellen / 300 μL zu erhalten. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Legen Sie die Zellsuspension beiseite.
   4. Übertragen Sie die Petrischale mit den mikrofluidischen Chips auf die Gewebekulturhaube. Befestigen Sie eine P200-Barrierespitze an der Spitze eines Absauggeräts.
   5. Spülen Sie sowohl den oberen als auch den unteren Kanal des mikrofluidischen Chips mit 200 μL DMEM/F12 und saugen Sie gleichzeitig die Peripherie des Auslasses an.
   6. Halten Sie den Chip fest mit der P200-Barrierespitze, die am Aspirator befestigt ist, weg vom Ausgang des unteren Kanals. Injizieren Sie 20 μL der viEC-Suspension mit ca. 134.000 Zellen fest in den Kapillarkanal (unten) des Chips. Saugen Sie das Medium vorsichtig aus der Peripherie der Steckdose ab.
   7. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop auf Blasen oder eine ungleichmäßige viEC-Aussaatdichte.
   8. Drehen Sie den Chip vorsichtig um, um ihn umzudrehen, damit die viECs an der basalen Seite der flexiblen PDMS-Membran haften können. Setzen Sie den Chip in die Halterpatrone ein. Geben Sie 3 ml PBS in die Chiphalterpatrone, um ein Austrocknen der Membran zu verhindern. Inkubieren Sie den Chip bei 37 °C für 3 h.
   9. Überprüfen Sie den unteren Kanal unter dem Mikroskop auf eine konfluente Schicht von viECs, die an der flexiblen PDMS-Membran befestigt sind. Tropfen Sie 200 μL Endothelial Maintenance Medium auf den Eingang des unteren Kanals und lassen Sie es durch den Kanal fließen, um den Kanal der nicht angeschlossenen Endothelzellen zu waschen, während Sie vorsichtig aus der Peripherie des Kapillarkanalauslasses (unten) aspirieren.
   10. Setzen Sie den Chip wieder in die Halterpatrone ein. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
2. Tag 16: Intermediäre Mesodermzellen (IM)
   1. Spülen Sie den Kapillarkanal (unten) vorsichtig mit 200 μl Endothelial-Erhaltungsmedium, während Sie die Peripherie des Auslasskanals vorsichtig ansaugen.
   2. Spülen Sie den Harnkanal (oben) mit 200 μL DMEM/F12, während Sie die Peripherie des Auslasses vorsichtig absaugen. Lassen Sie ~50 μL DMEM/F12 auf die Ein- und Auslassanschlüsse fallen.
   3. Saugen Sie das Zwischenmesoderm-Induktionsmedium aus jeder Vertiefung der 12-Well-Platte ab.
      HINWEIS: Jede Vertiefung am Ende der Differenzierung ergibt ungefähr 1,5 Millionen IM-Zellen.
   4. 1 ml Trypsin-EDTA in jede Vertiefung der 12-Well-Platte geben und bei 37 °C für 5 min inkubieren.
   5. Schaben Sie die Zellen vorsichtig mit einem Zellheber ab und pipetten Sie auf und ab, um die Zellen mit einem P1000 zu dissoziieren. Fügen Sie 2 ml Trypsin-Neutralisationslösung (Zusatztabelle S1) zu jeder Vertiefung hinzu. Die Zellen werden in ein 50 ml konisches Röhrchen überführt. Das Volumen der Zellsuspension mit DMEM/F12 auf 50 mL bringen und bei 200 × g für 5 min zentrifugieren.
   6. Asspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL intermediärem Mesoderm-Induktionsmedium, um etwa 3 Millionen Zellen / 500 μL zu erhalten. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
   7. Halten Sie den Chip fest mit der P200-Barrierespitze, die am Aspirator befestigt ist, weg vom Ausgang des Harnkanals (oben). Injizieren Sie 25 μL Zellsuspension mit etwa 112.500 IM-Zellen fest in den Harnkanal (obere Zellen) des Chips und saugen Sie das Medium vorsichtig von der Peripherie des Ausgangs ab.
   8. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop auf Blasen oder eine ungleichmäßige IM-Zell-Seeding-Dichte. Geben Sie 3 ml PBS in die Chiphalterpatrone. Bei 37 °C 3 h inkubieren.
   9. Spülen Sie beide Kanäle mit 200 μL ihres jeweiligen Zellkulturmediums, während Sie die Peripherie der Chipausgänge vorsichtig ansaugen, um einen Rückfluss des verbrauchten Mediums und der Zelltrümmer zu verhindern.
   10. Befestigen Sie leere P200-Barrierespitzen in beiden Ausgängen des Harn- und Kapillarkanals. Pipettieren Sie 200 μL Endothelial Maintenance Medium und injizieren Sie die Hälfte davon in den Kapillarkanaleinlass. Lassen Sie die Pipettenspitze im Einlass so los, dass sowohl der Einlass als auch der Auslass des Kanals nun an mit Medium gefüllten Pipettenspitzen befestigt sind.
   11. Pipettieren Sie 200 μL IM-Erhaltungsmedium und injizieren Sie die Hälfte in den Harnkanaleinlass. Lassen Sie die Pipettenspitze im Einlass so los, dass sowohl der Einlass als auch der Auslass des Kanals nun an mit Medium gefüllten Pipettenspitzen befestigt sind. Inkubieren Sie die Chips mit eingebetteten Spitzen bei 37 °C über Nacht.
3. Verbinden Sie Chips mit Organ Chip Bioreactor, um Flüssigkeitsfluss und mechanische Belastung auszuüben.
   1. Entfernen Sie P200-Spitzen aus den Harn- und Kapillarkanälen. Fügen Sie Tröpfchen entsprechender Medien in den Ein- und Auslass der Harn- und Kapillarkanäle ein, um ein Austrocknen zu verhindern.
   2. Geben Sie 3 ml warmes Podozyten-Induktionsmedium (Zusatztabelle S1) in das Urineinlassreservoir. Geben Sie 3 ml warmes Endothel-Erhaltungsmedium in das kapillare Einlassreservoir.
   3. Geben Sie 300 μL warmes Podozyten-Induktionsmedium direkt über dem Auslasskanal in das Auslassreservoir des Harnkanals. Geben Sie 300 μL warmes Endothel-Erhaltungsmedium direkt über den Auslassanschluss in das Kapillarkanalauslassreservoir.
   4. Schieben Sie die Pods auf das Tablett und in den Organchip-Bioreaktor.
   5. Verwenden Sie das Drehrad am Organchip-Bioreaktor, um den Prime Cycle auszuwählen und zu starten (2 min). Untersuchen Sie die Unterseite des Pods visuell auf kleine Tröpfchen an allen vier fluidischen Anschlüssen.
   6. Um einen Flüssigkeits-Flüssigkeits-Kontakt zwischen der Pod-Unterseite und den mikrofluidischen Chip-Anschlüssen zu erreichen, schieben Sie den Chipträger vorsichtig in den Pod. Drücken Sie die Chipträgerlasche vorsichtig hinein und nach oben. Überschüssiges Medium von der Chipoberfläche absaugen.
   7. Stellen Sie die Durchflussrate des Organchip-Bioreaktors auf 60 μL/h ein. Stellen Sie die zyklische Dehnung auf 10 % bei 0,4 Hz ein. Verwenden Sie das Drehrad am Organchip-Bioreaktor, um den Regulierungszyklus auszuwählen und 2 h zu laufen.
   8. Prüfen Sie die Auslassbehälter visuell auf eine Erhöhung des Mediumsspiegels.
   9. Verwenden Sie den Drehregler am Organchip-Bioreaktor, um den Zyklus Regulieren auszuwählen.

7. Tage 17-21 und darüber hinaus: Podozyteninduktion und Chippflege

1. Saugen Sie das Medium aus den Harnkanalauslassreservoirs diagonal vom Hafen weg ab, aber halten Sie jeden Tag der Kultur etwas Medium im Reservoir. Füllen Sie das Harnkanaleinlassreservoir alle 2 Tage für 5 Tage mit bis zu 3 ml Podocyten-Induktionsmedium auf.
   1. Nach 5 Tagen saugen Sie das Medium aus dem Harnkanal ab, aber halten Sie etwas Medium im Reservoir. Füllen Sie das Harnkanaleinlassreservoir täglich mit 3 ml Podocyte Maintenance Medium auf.
2. Saugen Sie das Medium aus den Kapillarkanalauslassbehältern diagonal vom Hafen weg ab, aber halten Sie jeden Kulturtag etwas Medium im Reservoir. Füllen Sie das Kapillarkanaleinlassreservoir täglich mit bis zu 3 ml Endothel-Erhaltungsmedium auf.

8. Funktioneller Assay und Immunfluoreszenzbildgebung

HINWEIS: Siehe Zusatzdatei 1 für Details zur Durchflusszytometrie-Analyse, zum ELISA für Chipabwässer und zur mRNA-Isolierung.

1. Funktioneller Assay (Molekularfiltration) mit Inulin und Albumin
   1. Saugen Sie das Medium aus dem Kapillarkanalauslassbehälter diagonal vom Anschluss weg ab, aber lassen Sie etwas Medium im Behälter. Ersetzen Sie durch 3 ml endotheliales Erhaltungsmedium, ergänzt mit Inulin und Albumin (Zusatztabelle S1) für 6 h.
   2. Messen Sie mit einer 5-ml-serologischen Pipette das Volumen (in ml) des Mediums aus dem Harnkanal und übertragen Sie es in ein 15-ml-konisches Röhrchen. Wickeln Sie die Tube in Aluminiumfolie, um sie vor Licht zu schützen und die Photobleiche des fluorophorkonjugierten Inulins und Albumins zu minimieren. Füllen Sie das Reservoir mit 3 mL Podocyte Maintenance Medium auf.
   3. Bereiten Sie eine Stammlösung von Inulin in Podozytenpflegemedium vor. Ausgehend von 25 μg/ml Inulin werden acht Inulinstandards über eine 2-fache serielle Verdünnung in Podocyten-Erhaltungsmedium hergestellt.
   4. In ähnlicher Weise bereiten Sie eine Stammlösung von Albumin in Podozytenpflegemedium vor. Ausgehend von 150 μg/ml Albumin werden acht Albuminstandards über eine 2-fache serielle Verdünnung in Podocyte-Erhaltungsmedium hergestellt.
   5. 100 μL jeder Standard-Inulinkonzentration werden doppelt in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte (oder insgesamt 16 Inulin-Vertiefungen) pipettiert. 100 μL jeder Standardalbuminkonzentration werden doppelt in jede Vertiefung derselben 96-Well-Platte pipettiert (insgesamt 16 Albumintöpfe). Pipette in doppeltem 100 μL Podozyten-Erhaltungsmedium als Rohling (oder zwei Gesamtmulden des Podozyten-Erhaltungsmediums).
   6. Pipettieren Sie 100 μL Abwassermedium aus dem Harnkanal in jede Vertiefung derselben 96-Well-Platte. Pipette in doppelter Ausführung 100 μL Abwassermedium aus dem Kapillarkanal.
   7. Führen Sie die Platte in den Plattenleser ein und messen Sie die Fluoreszenz für Albumin bei Anregung 550 nm und Emission 615 nm. Messen Sie die gleiche Platte für Inulin bei Anregung 513 nm und Emission 577 nm.
   8. Mittelwert der doppelten Messungen (pro Chip) aus den generierten Daten. Subtrahieren Sie den Blindwert, der diesem Messwert entspricht, von den übrigen Daten auf dem Blatt.
   9. Zeichnen Sie die Werte, die den Albuminstandards entsprechen, um eine Standardkurve mit Konzentration [μg/ml] auf der x-Achse und Fluoreszenz auf der y-Achse zu erstellen. Zeichnen Sie die Werte, die den Inulinstandards entsprechen, um eine Standardkurve mit Konzentration [μg/ml] auf der x-Achse und Fluoreszenz auf der y-Achse zu erstellen.
   10. Verwenden Sie ein statistisches Analysesoftwarepaket und eine lineare Interpolation, um die Urinkonzentration von Inulin bzw. Albumin im Abwassermedium aus den Chips zu bestimmen.
   11. Bestimmen Sie die Urinclearance von Inulin/Albumin aus den Chips mit Gleichung (1)²:
       Harnwegsclearance = ([U] × UV) / [P] (1)
       Dabei ist [U] die Harnkonzentration aus Schritt 8.1.10, UV das Volumen des gesammelten Harnkanalabflusses aus Schritt 8.1.2 und [P] die Kapillarkonzentration von Inulin oder Albumin (10 μg/ml Inulin oder 100 μg/ml Albumin).
2. Immunfluoreszenz-Bildgebung
   1. Injizieren Sie eine leere P200-Spitze in die Auslassöffnungen der Harn- und Kapillarkanäle. Um die Zellen zu fixieren, pipetten Sie 200 μL 4% Formaldehyd und injizieren Sie die Hälfte davon in den unteren Kanaleinlass. Lassen Sie die Pipettenspitze im Einlass los.
   2. Pipettieren Sie 200 μL 4% Formaldehyd und injizieren Sie die Hälfte davon in den Harnkanaleinlass. Lassen Sie die Pipettenspitze im Einlass so los, dass sowohl der Einlass als auch der Auslass des Kanals nun an mit Fixiermittel gefüllten Pipettenspitzen befestigt sind.
   3. Inkubieren Sie die Chips bei Raumtemperatur für 20 min.
   4. Nach 20 Minuten alle Pipettenspitzen entsorgen. Injizieren Sie saubere, leere P200-Spitzen in die Auslassöffnungen der Harn- und Kapillarkanäle. Um die Zellen zu permeabilisieren, pipetten Sie 200 μL 0,125% Triton X-100/PBS und injizieren Sie die Hälfte davon in den Kapillarkanaleinlass. Lassen Sie die Pipettenspitze im Einlass los.
   5. Pipettieren Sie 200 μL 0,125% Triton X-100/PBS und injizieren Sie die Hälfte davon in den Harnkanaleinlass. Lassen Sie die Pipettenspitze im Einlass los. Inkubieren Sie den Chip bei Raumtemperatur für 5 min.
   6. Entsorgen Sie alle Pipettenspitzen. Injizieren Sie saubere, leere P200-Spitzen in die Auslassöffnungen der Harn- und Kapillarkanäle. Um die Zellen zu blockieren, pipetten Sie 200 μL 1% Rinderserumalbumin (BSA) in 0,125% Triton X-100/PBS und injizieren die Hälfte davon in den Kapillarkanaleinlass. Lassen Sie die Pipettenspitze im Einlass los.
   7. Pipettieren Sie 200 μL 1% BSA in 0,125% Triton X-100/PBS und injizieren Sie die Hälfte davon in den Harnkanaleinlass. Lassen Sie die Pipettenspitze im Einlass los. Bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
   8. Entsorgen Sie alle Pipettenspitzen. Waschen Sie beide Kanäle 3x, indem Sie 200 μL 0,125% Triton X-100/PBS in jeden Kanal pipettieren und bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren.
   9. Bereiten Sie 100 μL primären Antikörper pro Kanal mit der vom Hersteller empfohlenen Verdünnung in 0,125% Triton X-100/PBS vor. Injizieren Sie saubere, leere P200-Spitzen in die Auslassöffnungen der Harn- und Kapillarkanäle. Pipettieren Sie 100 μL primären Antikörper und injizieren Sie die Hälfte in die jeweiligen Kanäle. Lassen Sie die Pipettenspitze im Einlass los.
   10. 1 h bei Raumtemperatur oder, für bessere Ergebnisse, über Nacht bei 4 °C inkubieren.
       HINWEIS: Mehrere primäre Antikörper können gleichzeitig angewendet werden; Die primäre Antikörperlösung muss jedoch gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnt werden.
   11. Waschen Sie die Kanäle 3 x 10 min wie in Schritt 8.2.8 beschrieben.
   12. Bereiten Sie 100 μL sekundären Antikörper pro Kanal mit dem vom Hersteller empfohlenen Verdünnungsfaktor in 0,125% Triton X-100/PBS vor. Injizieren Sie saubere, leere P200-Spitzen in die Auslassöffnungen der Harn- und Kapillarkanäle. Pipettieren Sie 100 μL sekundären Antikörper und injizieren Sie die Hälfte in die jeweiligen Kanäle. Lassen Sie die Pipettenspitzen im Einlass los. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
       HINWEIS: Jeder sekundäre Antikörper muss separat angewendet werden. Zwischen den einzelnen Anwendungen gemäß Schritt 8.2.8 mindestens 3 x 10 min waschen.
   13. Waschen Sie die Kanäle 3 x 10 min wie in Schritt 8.2.8 beschrieben.
   14. Spülen Sie beide Kanäle einmal mit 200 μL destilliertem Wasser, während Sie die Restflüssigkeit aus der Peripherie der Chipauslassöffnungen absaugen.
   15. Injizieren Sie sauberes, leeres P200 in die Auslassöffnungen der Harn- und Kapillarkanäle. Um den Zellen entgegenzuwirken, pipetten Sie 200 μL 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:1.000 Verdünnung in destilliertem Wasser) und injizieren die Hälfte davon in den Kapillarkanaleinlass. Lassen Sie die Pipettenspitze im Einlass los, pipettieren Sie 200 μL DAPI und injizieren Sie die Hälfte davon in den Harnkanaleinlass. Lassen Sie die Pipettenspitze im Einlass los und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min.
   16. Entsorgen Sie alle Pipettenspitzen. Injizieren Sie saubere, leere P200-Spitzen in die Auslassöffnungen der Harn- und Kapillarkanäle. Um die Zellen gegenzufärben, pipetten Sie 200 μL Phalloidin (1:1.000 Verdünnung in PBS ohne Ca 2+ und Mg²⁺) und injizieren die Hälfte davon in den Kapillarkanaleinlass und geben die Pipettenspitze im Einlass frei. Pipettieren Sie 200 μL Phalloidin (1:1.000 Verdünnung in PBS ohne Ca 2+ und Mg²⁺) und injizieren Sie die Hälfte davon in den Harnkanaleinlass und geben Sie die Pipettenspitze im Einlass frei. Bei Raumtemperatur 15 min inkubieren.
   17. Spülen Sie die Kanäle 3x mit 200 μL PBS ohne Ca 2+ und Mg²⁺ und saugen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem Umfang der Auslassöffnungen ab.
   18. Visualisieren Sie die Chips.

Ergebnisse

Hier zeigen wir, dass ein funktionelles 3D-In-vitro-Modell des Glomerulus aus einer isogenen Quelle menschlicher iPS-Zellen vaskularisiert und epithelialisiert werden kann. Insbesondere enthält dieses Protokoll Anweisungen zur Anwendung der humanen iPS-Zelltechnologie, insbesondere ihrer Fähigkeit, sich in spezialisierte Zelltypen zu differenzieren, um ein glomeruläres Nierenepithel (Podozyte) und vaskuläres Endothel (viECs) zu erzeugen, das in mikrofluidische Geräte integriert werden kann, um die Struktur ...

Diskussion

In diesem Bericht skizzieren wir ein Protokoll zur Ableitung von vaskulärem Endothel und glomerulärem Epithel (Podozyten) aus einer isogenen menschlichen iPS-Zelllinie und der Verwendung dieser Zellen zur Entwicklung eines 3D-Organ-on-a-Chip-Systems, das die Struktur, die Gewebe-Gewebe-Schnittstelle und die molekulare Filtrationsfunktion des Nierenglomerulus nachahmt. Dieser Glomerulus-Chip ist mit Endothel und glomerulärem Epithel ausgestattet, die zusammen eine Barriere für selektive Filtermoleküle darstellen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo/Life Technologies	A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Collagen IV	Thermo/Life Technologies	14-9871-82
Nephrin	Progen	GP-N2
PECAM-1	R&D Systems	AF806
Podocin	Abcam	ab50339
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, Human	Corning	356008	Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment	Iwai North America	N8922012	Basement membrane matrix (2)
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial	BD Biosciences	354277	Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation
Cells
DU11 human iPS cells			The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
2-Mercaptoethanol	Thermo/Life Technologies	21985023
Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate	Thermo/Life Technologies	A23017
All-trans retinoic acid (500 mg)	Stem Cell Technologies	72262
B27 serum-free supplement	Thermo/Life Technologies	17504044
B-27 supplement (50x) without Vitamin A	Thermo/Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418
CHIR99021	Stemgent	04-0004	May show lot-to-lot variation
Complete medium kit with CultureBoost-R	Cell Systems	4Z0-500-R	Podocyte maintenance media
DMEM/F12	Thermo/Life Technologies	12634028
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement	Thermo/Life Technologies	10565042	DMEM/F12 with glutamine
Forskolin (Adenylyl cyclase activator)	Abcam	ab120058
GlutaMAX supplement	Thermo/Life Technologies	35050061	glutamine supplement
Heat-inactivated FBS	Thermo/Life Technologies	10082147
Heparin solution	Stem Cell Technologies	7980
Human Activin A	Thermo/Life Technologies	PHC9544
Human BMP4	Preprotech	120-05ET
Human BMP7	Thermo/Life Technologies	PHC9544
Human VEGF	Thermo/Life Technologies	PHC9394
Inulin-FITC	Sigma-Aldrich	F3272
mTeSR1 medium	Stem Cell Technologies	05850	Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C.
N-2 Supplement (100x)	Thermo/Life Technologies	17502048
Neurobasal media	Thermo/Life Technologies	21103049	Lateral mesoderm basal media
PBS (Phosphate-buffered saline)	Thermo/Life Technologies	14190-250
Penicillin-streptomycin, liquid (100x)	Thermo/Life Technologies	15140-163
ROCK inhibitor (Y27632)	Tocris	1254
StemPro-34 SFM	Thermo/Life Technologies	10639011	Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months.
TGF-Beta inhibitor (SB431542)	Stem Cell Technologies	72234
Enzymes and other reagents
Accutase	Thermo/Life Technologies	A1110501	Cell detachment buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2438
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade	VWR	97065-058
Paraformaldehyde (PFA)	Thermo/Life Technologies	28906
Sterile distilled water	Thermo/Life Technologies	15230162
Triton X-100	VWR	97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05%	Thermo/Life Technologies	25300-120
(Orb) Hub module	Emulate	ORB-HM1
100mm x 15 mm round petri dish	Fisherbrand	FB087579B
120 x 120 mm square cell culture dish	VWR	688161
Accuri C6	BD Biosciences
Aspirating pipettes, individually wrapped	Corning	29442-462
Aspirating Unit	SP Bel-Art	F19917-0150
Avanti J-15R Centrifuge	Beckman Coulter	B99516
Conical centrifuge tube, 15 mL	Corning	352097
Conical centrifuge tube, 50 mL	Corning	352098
EVOS M7000	Thermo/Life Technologies	AMF7000	Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.
Hemocytometer	VWR	100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo/Life Technologies	51030403
Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera	Carl Zeiss Micrscopy	491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)
Kimberly-Clark nitrile gloves	VWR	40101-346
Kimwipes, large	VWR	21905-049
Leoca SP8 Upright Confocal Microscope
Media reservoir (POD Portable Module)	Emulate	POD-1
Microplate shaker	VWR	12620-926
Organ-chip	Emulate	S-1 Chip
Organ-chip holder	Emulate	AK-CCR
P10 precision barrier pipette tips	Denville Scientific	P1096-FR
P100 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1125
P1000 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1121
P20 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1122
P200 barrier pipette tips	Denville Scientific	P1122
Plasma Asher	Quorum tech	K1050X RF	This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).
Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap	Corning	352235
Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped	Corning	356551
Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped	Corning	356525
Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped	Corning	356543
Steriflip, 0.22 µm, PES	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile Microcentrifuge tubes	Thomas Scientific	1138W14
T75cm2 cell culture flask with vent cap	Corning	430641U
Tissue culture-treated 12 well plates	Corning	353043
Tissue culture-treated 6 well plates	Corning	353046
Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module)	Emulate	ZOE-CM1	Organ Chip Bioreactor
VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated	Miltenyi Biotec	130-126-010
Wide-beveled cell lifter	Corning	3008
MACS
CD144 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-097-857
CD31 MicroBead Kit, human	Miltenyi Biotec	130-091-935
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401