JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

كانت إعادة التشكيل الخالية من الخلايا أداة رئيسية لفهم تجميع الهيكل الخلوي ، وقد أنشأ العمل في العقد الماضي مناهج لدراسة ديناميكيات السيبتين في الحد الأدنى من الأنظمة. تظهر هنا ثلاث طرق تكميلية لمراقبة تجميع السيتين في سياقات غشائية مختلفة: الطبقات الثنائية المستوية ، والدعامات الكروية ، ودعامات القضيب.

Abstract

يمكن لمعظم الخلايا استشعار وتغيير شكلها لتنفيذ عمليات الخلايا الأساسية. في العديد من حقيقيات النوى ، يعد الهيكل الخلوي للسبتين جزءا لا يتجزأ من تنسيق تغيرات الشكل مثل الحركة الخلوية والنمو المستقطب والهجرة. Septins هي بروتينات مكونة للخيوط تتجمع لتشكيل هياكل متنوعة ذات ترتيب أعلى ، وفي كثير من الحالات ، توجد في مناطق مختلفة من غشاء البلازما ، وعلى الأخص في مناطق الانحناء الإيجابي على نطاق ميكرون. ويعوق رصد عملية تجميع السيبتين في الجسم الحي قيود الفحص المجهري الضوئي في الخلايا، فضلا عن تعقيد التفاعلات مع كل من الأغشية والعناصر الهيكلية الخلوية، مما يجعل من الصعب تحديد ديناميات السيتين في النظم الحية. لحسن الحظ ، كان هناك تقدم كبير في العقد الماضي في إعادة تشكيل الهيكل الخلوي للسبتين في نظام خال من الخلايا لتشريح الآليات التي تتحكم في تجميع السيبتين بدقة مكانية وزمنية عالية. تشمل الخطوات الأساسية لتجميع السيبتين ارتباط السيبتين غير المتجانس وانفصاله عن الغشاء ، والبلمرة إلى خيوط ، وتشكيل هياكل أعلى مرتبة من خلال التفاعلات بين الخيوط. هنا ، نقدم ثلاث طرق لمراقبة تجميع السيتين في سياقات مختلفة: الطبقات الثنائية المستوية ، والدعامات الكروية ، ودعامات القضيب. يمكن استخدام هذه الطرق لتحديد المعلمات الفيزيائية الحيوية للسبتين في مراحل مختلفة من التجميع: كأوكتامات مفردة تربط الغشاء ، كخيوط ، وكتجمعات للخيوط. نحن نستخدم هذه المعلمات مقترنة بقياسات أخذ عينات الانحناء والامتزاز التفضيلي لفهم كيفية عمل استشعار الانحناء على مجموعة متنوعة من مقاييس الطول والوقت.

Introduction

تعتمد أشكال الخلايا والعديد من مقصوراتها الداخلية على الأغشية الدهنية المحيطة بها. الأغشية هي هياكل مرنة لزجة يمكن تشويهها من خلال التفاعلات مع البروتينات وفرز الدهون والقوى الداخلية والخارجية المؤثرة لتوليد مجموعة متنوعة من الأشكال1،2،3،4. غالبا ما يتم وصف هذه الأشكال من حيث انحناء الغشاء. تستخدم الخلايا مجموعة متنوعة من البروتينات القادرة على تجميع الانحناءات الغشائية الخاصة بشكل تفضيلي أو "الاستشعار" لضمان التحكم المكاني الزماني المحدد في العمليات بما في ذلك الاتجار بالخلايا والحركة الخلوية والهجرة 5,6. من الصعب بشكل ملحوظ مراقبة ديناميكيات آلات الخلايا في الغشاء بسبب صعوبة تحقيق التوازن بين الوقت والدقة المكانية مع صحة الخلية. في حين أن تقنيات الدقة الفائقة يمكن أن تقدم عرضا مفصلا لهذه الهياكل ، إلا أنها تتطلب عمليات استحواذ طويلة غير قابلة للجداول الزمنية للتجميع / التفكيك لمعظم الآلات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التعقيد الجزيئي لهذه التجمعات في بيئتها الأصلية والعديد من الأدوار التي يمكن أن يلعبها مكون واحد يجعل أنظمة إعادة التشكيل الدنيا أداة قيمة لدراسة القدرة الوظيفية للجزيئات.

تم تطوير الحد الأدنى من محاكاة الغشاء لدراسة خصائص الغشاء والتفاعلات بين البروتين والغشاء خارج الخلية. تختلف محاكيات الأغشية من الطبقات الثنائية للدهون القائمة بذاتها ، مثل الجسيمات الشحمية أو الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة ، إلى الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs) 7،8،9،10. SLBs هي أغشية محاكاة حيوية ترتكز على الدعم الأساسي ، وتتكون عادة من الزجاج أو الميكا أو السيليكا11،12. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الهندسات، بما في ذلك الأسطح المستوية، والكرات، والقضبان، وحتى الركائز المتموجة أو المجهرية لفحص تفاعلات غشاء البروتين على كل من الانحناءات المقعرة والمحدبة في وقت واحد13،14،15،16،17،18 . يبدأ تكوين الطبقة الثنائية بامتصاص الحويصلة على سطح محب للماء ، يليه الانصهار والتمزق لتشكيل طبقة ثنائية مستمرة (الشكل 1)19. الطبقات الثنائية المدعومة قابلة بشكل خاص للضوء والمجهر الإلكتروني ، مما يوفر وقتا أفضل ودقة مكانية أفضل مما يمكن تحقيقه في كثير من الأحيان في الخلايا. توفر SLBs المنحنية بشكل خاص وسيلة جذابة لفحص حساسية انحناء البروتين في غياب تشوه غشائي كبير ، مما يسمح للمرء بالتمييز بين استشعار الانحناء وتحريض الانحناء ، والتي غالبا ما يكون من المستحيل فصلها في الأنظمة القائمة بذاتها.

Septins هي فئة من البروتينات الخلوية الهيكلية المكونة للخيوط المعروفة جيدا بقدرتها على التجمع على أغشية منحنية بشكل إيجابي 6,18,20. على مدار دورة الخلية في الخميرة ، تتجمع السيبتين في حلقة ويجب إعادة ترتيبها لتشكيل الساعة الرملية وهياكل الحلقة المزدوجة المرتبطة بظهور البراعم والحركة الخلوية ، على التوالي21. في حين تم القيام بعمل جميل باستخدام المجهر الإلكتروني المقلد البلاتيني لمراقبة بنية السيتين في مراحل دورة الخلية المختلفة22 ، فإن مشاهدة تجميع السبتين بمرور الوقت باستخدام المجهر الضوئي في الخميرة قد لاقت دقة مكانية محدودة. كان العمل السابق على السيبتين باستخدام الطبقات الأحادية الدهنية التي تم تصورها بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) قادرا على إعادة تشكيل العديد من هياكل السيبتين المثيرة للاهتمام مثل الحلقات والحزم والشاش23. ومع ذلك ، فإن تقنيات EM محدودة أيضا في دقتها الزمنية ، على عكس الفحص المجهري الفلوري. من أجل حل أفضل للمعلمات الحركية للعملية متعددة المقاييس لتجميع السيبتين ، تحولنا إلى محاكاة الغشاء المدعومة ، حيث يمكن للمرء التحكم بعناية في هندسة الغشاء ، وظروف العينة ، وطريقة التصوير.

تستخدم البروتوكولات الموضحة هنا SLBs المستوية أو المنحنية ، والبروتين النقي ، ومزيج من تقنيات الفحص المجهري. تم استخدام المجهر البؤري الفلوري الكمي والمجهر الفلوري الداخلي الكلي (TIRFM) لقياس كل من ارتباط البروتين السائب بانحناءات الغشاء المختلفة ، وكذلك لقياس حركية الربط للجزيئات المفردة. علاوة على ذلك ، تم تكييف هذا البروتوكول لاستخدامه مع المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لفحص البنية الفائقة للبروتين على انحناءات الغشاء المختلفة. في حين أن تركيز هذه البروتوكولات ينصب على الهيكل الخلوي للسيبتين ، يمكن تعديل البروتوكولات بسهولة للتحقيق في حساسية الانحناء لأي بروتين يجده القارئ مثيرا للاهتمام. بالإضافة إلى ذلك ، قد يجد أولئك الذين يعملون في مجالات مثل كثرة الخلايا الداخلية أو الاتجار بالحويصلات هذه التقنيات مفيدة للتحقيق في التجمعات المعتمدة على الانحناء للمجمعات متعددة البروتينات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: يتطلب تشكيل الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة إعداد حويصلات أحادية الصفائح الصغيرة أحادية التشتت (SUVs). يرجى الرجوع إلى البروتوكول24 المنشور سابقا بشأن تشكيل سيارات الدفع الرباعي. باختصار ، يتم تشكيل جميع سيارات الدفع الرباعي بواسطة صوتنة المسبار لمدة 12 دقيقة في المجموع بسعة 70٪ عبر فترات صوتنة مدتها 4 دقائق تليها فترات راحة مدتها 2 دقيقة في الماء المثلج. يجب توضيح حلول سيارات الدفع الرباعي بشكل جيد وتشتت أحادي الحجم. يمكن قياس توزيعات حجم سيارات الدفع الرباعي ، على سبيل المثال ، عن طريق تشتت الضوء الديناميكي25.

1. طبقات ثنائية الدهون المستوية

  1. تنظيف البلازما للشرائح
    ملاحظة: يزيل تنظيف البلازما الملوثات العضوية ويزيد من محبة الماء للزجاج ، مما يضمن امتزاز الدهون بكفاءة. قد تتغير الخطوات التالية أو تحتاج إلى تحسين اعتمادا على منظف البلازما والأغطية الزجاجية المستخدمة.
    1. قم بتطهير منظف البلازما لمدة 5 دقائق بالأكسجين لإزالة الهواء من الخطوط والحجرة. هذا هو التأكد من أنه عند تشغيل منظف البلازما ، هناك في المقام الأول الأكسجين في الخطوط والغرفة ، مما يوفر مستحضرات أكثر اتساقا ثنائية الطبقة.
    2. أثناء التطهير، قم ببث غاز خامل، مثل N2 أو Ar، فوق شرائح زجاجية صغيرة الغطاء لإزالة الغبار والجسيمات.
      اختياري: يمكن غسل شرائح زجاج الغطاء عن طريق رش كل جانب بالأيزوبروبانول بنسبة 100٪ متبوعا بالماء. كرر غسل ماء الأيزوبروبانول 3x ثم جففه بتيار N2 .
    3. رتب انزلاقات زجاجية جافة في مهد من السيراميك. ضع المهد في الجزء الخلفي من غرفة البلازما بحيث تكون أغطية الأغطية موازية للحافة الطويلة للغرفة (وهذا يبقيها في مكانها أثناء تنظيف البلازما). قم بتشغيل منظف البلازما لمدة 15 دقيقة بالأكسجين بأقصى طاقة.
  2. إعداد الغرفة
    ملاحظة: تستخدم الطريقة الموضحة هنا غرف محلية الصنع من أنابيب PCR البلاستيكية لدعم أحجام التفاعل ، ولكن قد تكون المواد الأخرى منخفضة الالتصاق ، مثل آبار السيليكون ، مناسبة أيضا.
    1. باستخدام شفرة حلاقة أو مقص ، اقطع الغطاء أسفل الجزء المتجمد مباشرة من أنبوب PCR سعة 0.2 مل (الشكل 2).
    2. قم بطلاء حافة أنبوب PCR بمادة لاصقة منشطة بالأشعة فوق البنفسجية ، مع تجنب الجزء الداخلي من الأنبوب. ضع أنبوب PCR برفق في وسط غطاء نظيف بالبلازما.
      ملاحظة: لتجنب الغراء داخل الغرفة ، استخدم الحد الأدنى من الغراء للحصول على ختم ، وعالجه على الفور بالأشعة فوق البنفسجية دون ارتطام الغرفة أو إزعاجها.
    3. ضع الغرفة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية طويل الطول الموجي لمدة 5-7 دقائق لعلاج المادة اللاصقة.
  3. تشكيل طبقة ثنائية
    ملاحظة: يجب استخدام سيارات الدفع الرباعي أحادية التشتت في هذه الخطوة لتشكيل طبقة ثنائية فعالة ويقدم الجدول 1 وصفات لجميع المخازن المؤقتة المستخدمة في تكوين الطبقة الثنائية، بما في ذلك تركيزات المخزون والمخزن المؤقت النهائي.
    1. أضف 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت ثنائي الطبقة الدهني المدعوم (SLBB: 300 mM KCl ، 20 mM HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 1 mM MgCl2 ؛ الجدول 1) ، 10 ميكرولتر من سيارات الدفع الرباعي 5 mM ، و 1 μL من 100 mM CaCl2 إلى البئر. هز الغرف بلطف من جانب إلى آخر لتعطيل سيارات الدفع الرباعي ، ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: للحد من التبخر، احتضان في طبق بتري مغطى مع مسح مبلل.
  4. غسل الدهون الزائدة
    ملاحظة: تزيل هذه الخطوة سيارات الدفع الرباعي الزائدة وتعمل كخطوة تبادل مؤقت. من المهم جدا عدم كشط الطبقة الثنائية بطرف الماصة أثناء الغسيل ؛ إذا تعرض الزجاج ، فإن السيبتين والعديد من البروتينات الأخرى سوف ترتبط بشكل لا رجعة فيه ، مما يقلل من تركيز البروتين الفعال.
    1. بعد الحضانة ، اشطف الطبقة الثنائية 6x ب 150 ميكرولتر من SLBB ، وقم بالسحب لأعلى ولأسفل للخلط في كل مرة مع تجنب الفقاعات.
      ملاحظة: أضف 150 ميكرولتر مباشرة إلى 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت وسيارات الدفع الرباعي الموجودة بالفعل بإجمالي 200 ميكرولتر في بئر التفاعل.
    2. عندما تكون جاهزا لبدء الحضانة باستخدام السيبتين أو بروتين مختلف من اختيارك ، اغسل الطبقة المزدوجة 6x ب 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل (RXN: 33.3 mM KCl ، 50 mM HEPES ، pH 7.4 ، 1.4 mg / mL BSA ، 0.14٪ methylcellulose ، 1 mM BME).
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، اجعل المخزن المؤقت للتفاعل طازجا وكن حذرا للغاية أثناء الخلط في التفاعل جيدا لتجنب الفقاعات.
    3. في خطوة الغسيل الأخيرة ، قم بإزالة 125 ميكرولتر من مخزن التفاعل المؤقت ، تاركا 75 ميكرولتر في البئر. أضف 25 ميكرولتر من السيبتين المخفف في مخزن تخزين الحاجز (SSB: 300 mM KCl ، 50 mM HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 1 mM BME) عند التركيز المطلوب والصورة بواسطة المجهر TIRF26.
      ملاحظة: عند إعداد هذا الفحص لأول مرة أو دمج تركيبة دهون جديدة ، من الممارسات الجيدة ضمان انتشار الدهون بحرية على السطح باستخدام استرداد التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP). في حين أن معدل الاسترداد سيكون مختلفا بالنسبة لتركيبات الدهون المختلفة وأقل بطبيعته من الأنظمة القائمة بذاتها ، إلا أن الدهون لا ينبغي أن تكون غير متحركة.

المخزن المؤقت ثنائي الطبقة الدهني المدعوم (SLBB)
رصيدحجمالتركيز النهائي
2 م كيلو لتر1.5 مل300 مللي متر
1 متر هيبس200 ميكرولتر20 مللي متر
500 ملليمتر مج كل2 20 ميكرولتر1 مللي متر
الماء8 مل
المخزن المؤقت قبل التفاعل (PRB)
رصيدحجمالتركيز النهائي
2 م كيلو لتر166 ميكرولتر33.3 ملليمتر
1 متر هيبس500 ميكرولتر50 مللي متر
الماء9.33 مل
المخزن المؤقت للتفاعل
رصيدحجمالتركيز النهائي
2 م كيلو لتر166 ميكرولتر33.3 ملليمتر
1 متر هيبس300 ميكرولتر50 مللي متر
10 ملغم/مل BSA1.39 مل1.39 ملغم/مل
1٪ ميثيل سليلوز1.39 مل0.0014
الماءحتى 10 مل
BME0.7 ميكرولتر1 مللي متر
المخزن المؤقت لتخزين Septin (SSB)
رصيدحجمالتركيز النهائي
2 م كيلو لتر1.5 مل300 مللي متر
1 متر هيبس500 ميكرولتر50 مللي متر
الماءحتى 10 مل
BME0.7 ميكرولتر1 مللي متر

الجدول 1: المكونات العازلة لإعداد الطبقة الثنائية الدهنية المدعومة والتفاعلات. يتم عرض أحجام حلول المخزون التي يتم دمجها في المخازن المؤقتة والتركيزات النهائية لكل مكون. يمكن تخزين SLB و PRB في درجة حرارة الغرفة وإعادة استخدامها بين التجارب. يتم إنشاء مخزن مؤقت للتفاعل و SSB طازجين لكل تجربة.

2. طبقات ثنائية الدهون المدعومة كروية

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول ميكروسفير السيليكا المعلق في الماء فائق النقاء بكثافة 10٪. لأي عمل على المعلمات الحركية لتجميع البروتين ، من المهم التحكم الصارم في إجمالي مساحة سطح الغشاء بين التجارب والانحناءات. ويبين الجدول 2 الأحجام المصححة من الخرز والعازل للحفاظ على 5 مم2 من إجمالي مساحة سطح الغشاء. يتوسع هذا البروتوكول على طريقة منشورة سابقا 8,18.

  1. تشكيل طبقة ثنائية
    ملاحظة: بالنسبة للطبقات الثنائية المستوية ، من المهم أن يكون لديك سيارات دفع رباعي عالية الجودة لتشكيل طبقة ثنائية قوية. يسرد الجدول 2 حجم الخرز من محلول كثافة 10٪ وأحجام SLBB الخاصة بها والتي تستخدم للحصول على مساحة سطح نهائية تبلغ 5 مم2 لمجموعة من أقطار الخرز.
    1. تميل الميكروسفير السيليكا (يشار إليها أيضا باسم الخرز) إلى الاستقرار والتكتل معا. لخلط الخرز وتفتيت أي مجموعات ، دوامة الزجاجة لمدة 15 ثانية ، ثم سونيكات الحمام لمدة 1 دقيقة ، والدوامة مرة أخرى لمدة 15 ثانية.
    2. امزج الحجم المناسب من الخرز (الجدول 2) مع الحجم المقابل من SLBB و 10 ميكرولتر من سيارات الدفع الرباعي 5 mM في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق منخفض الالتصاق بسعة 0.5 مل.
    3. يوضع خليط الخرز والدهون من طرف إلى طرف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن هذه الحضانة تتم على دوار لمنع الترسيب.
  2. تحضير الغرف على أغطية PEGylated
    ملاحظة: بالنسبة للطبقات الثنائية المستوية ، يتم استخدام غرف محلية الصنع من أنابيب PCR البلاستيكية لدعم أحجام التفاعل ، ولكن المواد الأخرى منخفضة الالتصاق ، مثل آبار السيليكون ، قد تعمل أيضا.
    1. بينما تهتز الخرز ، قم بإذابة غطاء PEGylated في درجة حرارة الغرفة. قم بقطع أنبوب PCR سعة 0.2 مل ولصقه على الغطاء كما هو موضح في الخطوة 1.2. بالنسبة للشرائح مقاس 24 مم × 50 مم ، يمكن احتواء ما يصل إلى 10 غرف بشكل عملي على شريحة واحدة.
      ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول أغطية زجاجية بجودة 24 مم × 50 مم PEGylated يتم إعدادها مسبقا. باختصار ، يتم تنظيف الأغطية الزجاجية جيدا من خلال الصوتنة في الأسيتون والميثانول و 3 M KOH. ثم يتم تشغيل الأغطية مع n-2-aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilane وترتبط تساهميا ب mPEG succinimidyl valerate. يتم تخزين أغطية PEGylated النهائية مختومة بالتفريغ عند -80 درجة مئوية. وللاطلاع على بروتوكول تخميل مماثل، يرجى الاطلاع على عمل جيدي وآخرين 27. في حين يتم اقتراح أغطية زجاجية PEGylated هنا ، قد تكون وسائل التخميل الأخرى ، مثل طرق BSA أو poly-L-lysine ، فعالة.
  3. غسل الدهون الزائدة
    ملاحظة: تعمل هذه الخطوة لإزالة سيارات الدفع الرباعي الزائدة وإجراء تبادل مؤقت. يتم غسل الخرز 4 أضعاف في المجموع باستخدام مخزن مؤقت قبل التفاعل (PRB: 33.3 mM KCl ، 50 mM HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.4). يسرد الجدول 3 سرعات الدوران في RCF لمجموعة من أقطار الخرز.
    1. قم بتدوير الخرز في إطار التعاون الإقليمي المعين لمدة 30 ثانية (الجدول 3). إذا كنت تستخدم أحجام حبات متعددة ، فاستمر في اهتزاز الخرز حتى يحين وقت غسلها.
      ملاحظة: لا يستحق ترسيب الخرز الأكبر في نفس الدوران مثل الخرز الأصغر مع سرعة ترسيب الخرز الأصغر لتوفير الوقت. هذا يمكن أن يسبب الخرز للالتصاق ببعضها البعض وتعريض سلامة الطبقة الثنائية للخطر.
    2. بعد الدوران الأول ، قم بإزالة 50 ميكرولتر من supernatant وإضافة 200 ميكرولتر من PRB. بعد الدوران الثاني والثالث ، قم بإزالة 200 ميكرولتر وأضف 200 ميكرولتر من PRB. بعد الدوران الرابع ، قم بإزالة 200 ميكرولتر وإضافة 220 ميكرولتر من PRB. ماصة بقوة لكل غسلة.
      ملاحظة: يختلف حجم إعادة التعليق النهائي عن الغسيل. لا تقم بدوامة الخرز بعد الحضانة مع الدهون لأن هذا يمكن أن يترك فجوات في الطبقات الثنائية. لتجنب الترسيب أثناء العمل مع أحجام الخرز الأخرى أو إعداد أجزاء أخرى من الفحص ، ضع مخاليط الخرز مرة أخرى على الدوار من النهاية إلى النهاية.
  4. إعداد رد الفعل
    ملاحظة: تم تصميم هذا التفاعل للحفاظ على إجمالي مساحة سطح الغشاء للتفاعل عند 5 مم2 ولإنتاج حالة تفاعل نهائية تبلغ 100 mM KCl و 50 mM HEPES و 1 mg / mL BSA و 0.1٪ methylcellulose و 1 mM BME.
    1. إذا قمت بإجراء فحص منافسة بأحجام حبة متعددة ، فقم بعمل خليط 1: 1 عن طريق خلط أحجام متساوية من كل حجم خرزة معا. ثم ، امزج 29 ميكرولتر من خليط الخرز المطلوب (أو من حبة واحدة) مع 721 ميكرولتر من المخزن المؤقت RXN.
      ملاحظة: من المهم خلط الخرز جيدا في كل خطوة مع ماصة لتجنب مجموعات كثيفة من الخرز. سيؤدي ذلك إلى توزيع أكثر توازنا للخرزة ومساحة سطح إجمالية دقيقة.
    2. امزج 75 ميكرولتر من الخرز المخفف و 25 ميكرولتر من البروتين المخفف في SSB إلى الآبار.
      ملاحظة: عادة ما يصور المؤلفون مجمعات سبتين الخميرة عند 1-50 نانومتر.
    3. إذا كان قياس السيبتين في حالة ثابتة ، فقم باحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، ثم قم بتصويره إما بواسطة TIRF أو المجهر البؤري.
قطر الخرزة (ميكرومتر)حجم الخرز المخلوط جيدا (ميكرولتر)حجم المخزن المؤقت SLB (ميكرولتر)حجم سيارات الدفع الرباعي (ميكرولتر)
6.468.9461.110
5.0676310
3.174.3965.610
0.961.3368.710
0.540.7569.310
0.310.4369.610

الجدول 2: الأحجام العادية من الميكروسفيرات. من أجل الحفاظ على مساحة سطح متساوية لكل حجم خرزة والحفاظ على إجمالي مساحة سطح الغشاء متسقة بين التجارب ، تم حساب أحجام لكل حجم خرزة ومخزن مؤقت يقوم بتطبيع إجمالي مساحة السطح.

قطر الخرزة (ميكرومتر)سرعة الترسيب (RCF)
0.314.5
0.544.5
0.962.3
3.170.8
5.060.3

الجدول 3: سرعات الترسيب للميكروسفير بأقطار مختلفة. لكل قطر حبة ، تم استخدام الحد الأدنى من سرعات الترسيب الموضحة لتكوير الخرز لغسل الجسيمات الشحمية غير المقيدة.

3. قضيب يدعم الدهون ثنائي الطبقات

ملاحظة: على النقيض من الفحوصات الأخرى المعروضة هنا ، لا يسمح فحص القضيب بالتحكم الدقيق في مساحة سطح الغشاء الإجمالية. يمكن للمرء أن يكون متسقا في الكميات والأحجام بين التجارب ، ولكن لأن هذا يؤدي إلى قضبان ذات أطوال وأقطار مختلفة ، فمن الصعب استقراء إجمالي مساحة سطح الغشاء في التفاعل. وبالتالي ، في حين أن هذا اختبار ممتاز لاستكشاف استشعار الانحناء مع انحناءات متعددة على سطح واحد وكان مفيدا لاستكشاف البنية الفائقة للسبتين ، إلا أنه لا ينصح به للقياسات الحركية. تم الإبلاغ عن هذه الطريقة سابقا18 ويتم التوسع فيها هنا.

  1. الحصول على قضبان البورسليكات من مرشحات الألياف الدقيقة الزجاجية
    1. قم بتمزيق مرشح واحد من الألياف الدقيقة الزجاجية GF / C من الدرجة 42.5 مم إلى قطع صغيرة وضعها في كوب 100 مل مع 60 مل من الإيثانول 100٪. حمام سونيكات حتى يصبح المحلول غير شفاف ؛ يمكن أن يستغرق ذلك أقل من 20-30 دقيقة باستخدام مرشح ممزق بدقة.
      ملاحظة: سونيكات تماما لتفتيت قطع كبيرة. كلما كان الانفصال / غير شفاف ، كان ذلك أفضل.
    2. قم بتغطية المحلول بفيلم وقم بتخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
  2. تشكيل طبقتين على قضبان
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة مع الدهون الزائدة لتحقيق تغطية كاملة للقضيب لأنه من المستحيل تحديد مساحة السطح الإجمالية في هذه الطريقة.
    1. في اليوم التالي ، سيتم تسوية محلول الإيثانول (الخطوة 3.1.2) ، لذا اخلطه جيدا قبل الاستخدام. الجمع بين 10 ميكرولتر من محلول قضيب و 70 ميكرولتر من SLBB.
    2. تدور بسرعة قصوى في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 30 ثانية وإزالة 50 ميكرولتر من supernatant. أعد التعليق في 50 ميكرولتر أخرى من SLBB وكرر الدوران لما مجموعه أربع غسلات لتخفيف الإيثانول.
      ملاحظة: لن تشكل دعامات القضيب حبيبة صلبة في أسفل الأنبوب. يتم تلطيخها بدلا من ذلك على طول جانب الأنبوب. هذا يجعل من الصعب الحفاظ عليها تماما عند الغسيل. نظرا لعدم التحكم في إجمالي مساحة السطح في هذا الفحص ، فلا بأس إذا تم إزعاجها.
    3. اجمع بين 10 ميكرولتر من محلول القضيب المختلط جيدا مع 50 ميكرولتر من سيارات الدفع الرباعي 5 mM و 20 ميكرولتر من SLBB. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، وتدوير نهاية على نهاية كما هو الحال عند تشكيل طبقات ثنائية على microspheres.
  3. غسل الدهون الزائدة
    1. على غرار الخطوة 3.2.2.، قم بتدوير محلول قضيب الدهون بسرعة قصوى في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 30 ثانية لإخراج القضبان المغلفة بالغشاء من المحلول.
    2. بعد الدوران الأول ، قم بإزالة 50 ميكرولتر من supernatant وإضافة 200 ميكرولتر من PRB. بعد الدوران الثاني والثالث ، قم بإزالة 200 ميكرولتر وأضف 200 ميكرولتر من PRB. بعد الدوران الرابع ، قم بإزالة 200 ميكرولتر ، وأضف 220 ميكرولتر من PRB ، وماصة بقوة للخلط.
  4. إعداد رد الفعل
    1. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل ، امزج 721 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل مع 29 ميكرولتر من محلول القضيب. تخلط جيدا.
    2. في أنبوب PCR سعة 0.2 مل ، اجمع بين 75 ميكرولتر من القضبان في مخزن التفاعل المؤقت و 25 ميكرولتر من السيبتين عند التركيز المطلوب ، المخفف في SSB. اسمح لها بالحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
  5. التحضير للمجهر الإلكتروني الماسح
    1. بعد الحضانة، أضيفي خليط قضيب السبعتين سعة 100 ميكرولتر على غطاء دائري مطلي بالبولي إيثيلين عالي الجودة مقاس 12 مم واحضنيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في طبق بتري مغلق.
    2. قم بإصلاح العينة عن طريق ملء الجزء السفلي من طبق بتري (يجب أن يكون 10 مل كافيا) بنسبة 2.5٪ غلوتارالدهيد في 0.05 م كاكوديلات الصوديوم (NaCo) ، درجة الحموضة 7.4 ، لمدة 30 دقيقة. شفط السائل باستخدام ماصة زجاجية. اغسل العينة عن طريق احتضانها ب 10 مل من 0.05 م NaCo لمدة 5 دقائق وكرر ذلك لما مجموعه غسلتين.
    3. قم بالنشر في المخزن المؤقت OsO4 cacodylate بنسبة 0.5٪ لمدة 30 دقيقة ، ثم اغسل 3x في 0.05 M NaCo (5 دقائق / غسل).
    4. احتضن العينة بنسبة 1٪ من حمض التانيك لمدة 15 دقيقة ، ثم اغسلها في NaCo 3x. احتضان لمدة 15 دقيقة في 0.5٪ OsO4 وغسل 3x مع NaCo.
    5. تجفيف العينات باستخدام زيادة تركيزات الإيثانول: 30٪ EtOH لمدة 5 دقائق ، 2x ؛ 50٪ EtOH لمدة 5 دقائق ؛ 75٪ EtOH لمدة 5 دقائق ؛ و 100٪ EtOH لمدة 5 دقائق ، 2x. اتبع ذلك بحضانة أخرى لمدة 10 دقائق.
    6. احتضان في السائل الانتقالي (سداسي ميثيل ديسيلازان) 3x (5 دقائق، 10 دقائق، ثم 5 دقائق).
    7. اتركيه حتى يجف في الهواء ، ثم ضعي العينات في مجفف حتى يتم طلاء الرذاذ . قم بتغطية طبقة 4 نانومتر بسبيكة ذهبية / البلاديوم ثم قم بتصويرها على مجهر إلكتروني ماسح.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

بعد تحضير كل SLB ، يمكن احتضان السيبتين أو البروتين محل الاهتمام بالدعم المطلوب وتصويره عبر TIRFM أو المجهر البؤري أو SEM. تستخدم النتائج الموضحة هنا السيبتين المعبر عنها بشكل مؤتلف وتنقيتها من E. coli17. باستخدام TIRFM على SLBs المستوية ، من الممكن تحديد طول الخيوط ومرونتها ، وقياس مع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تأخذ أغشية الخلايا العديد من الأشكال المختلفة والانحناءات والخصائص الفيزيائية الكيميائية. من أجل دراسة الآلات على نطاق النانومتر التي من خلالها تبني الخلايا تجمعات على نطاق ميكرومتر ، من الضروري تصميم الحد الأدنى من أنظمة إعادة التشكيل لمحاكاة الأغشية. يقدم هذا البروتوكول تقنيات تتحكم ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) Grant No. R01 GM-130934 والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) منحة MCB- 2016022. تم دعم B.N.C ، E.J.D.V. ، و K.S.C. جزئيا من خلال منحة من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة بموجب الجائزة T32 GM119999.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR Tubes with flat cap, NaturalWatson137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubesUSA Scientific1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME)Sigma-AldrichM6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslipsThermo Scientific152450Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPCAvanti Polar Lipids850375
Egg Liss Rhodamine PEAvanti Polar Lipids810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM GradeVWR16220
EMS Sodium Cacodylate BufferVWR11652
Ethanol, 200 proofFisher Scientific04-355-223EA
HEPESSigma AldrichH3375-1KG
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich440191
Magnesium chlorideVWR7791-18-6
Methyl cellulose 4000cpSigma-AldrichM052-100G
Microglass coverslips for planar bilayersMatsunamiDiscontinued22x22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica MicrospheresBangs Laboratories, Inc.Depends on size: SS0200*-SS0500*Silica in aqueous suspension
Optical AdhesiveNorland ThorlabsNOA 68Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxideMillipore Sigma20816-12-0
ParafilmVWR52858-000
Plasma CleanerPlasma EtchPE-25Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chlorideVWR0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm  VWR64-0712
Sonicator bathBranson1510R-MTBransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PIAvanti Polar Lipids840044
Tabletop centrifugeEppendorf22331
UV LampSpectrolineENF-260C115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter PaperVWR28455-03042.5 mm diameter, Grade GF/C

References

  1. Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
  2. Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
  3. Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).
  4. Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
  5. Bigay, J., Casella, J. -F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  6. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
  7. Picard, F., Paquet, M. -J., Dufourc, ÉJ., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
  8. Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
  9. Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916(2014).
  10. Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
  11. Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
  12. Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
  13. Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118(2021).
  14. Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
  15. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420(2019).
  16. Lou, H. -Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  17. Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
  18. Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
  19. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  20. Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511(2021).
  21. Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
  22. Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
  23. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  24. Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
  25. Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
  26. Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29(2012).
  27. Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
  28. Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
  29. Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
  30. Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457(2016).
  31. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
  32. Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
  33. Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
  34. Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
  35. Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
  36. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved