在膜上重构隔膜组件以研究生物物理性质和功能

摘要

无细胞重建一直是了解细胞骨架组装的关键工具，并且在过去十年中的工作已经建立了研究最小系统中隔膜蛋白动力学的方法。这里介绍的是三种在不同膜环境中观察隔膜组装的互补方法:平面双层，球形支撑和棒状支撑。

摘要

大多数细胞可以感知并改变它们的形状，以执行基本的细胞过程。在许多真核生物中，隔膜细胞骨架是协调形状变化（如细胞分裂，极化生长和迁移）的组成部分。Septins是形成细丝的蛋白质，它们组装形成各种高阶结构，并且在许多情况下，存在于质膜的不同区域，最显着的是微米级正曲率区域。监测 体内 隔膜组装过程受到细胞中光学显微镜的局限性以及与膜和细胞骨架元件相互作用的复杂性的阻碍，使得难以量化生命系统中的隔膜蛋白动力学。幸运的是，在过去十年中，在无细胞系统中重建隔膜蛋白细胞骨架以剖析以高空间和时间分辨率控制隔膜蛋白组装的机制方面取得了实质性进展。隔膜蛋白组装的核心步骤包括隔膜杂高分子缔合和解离，聚合成细丝，以及通过细丝之间的相互作用形成高阶结构。在这里，我们提出了三种在不同情况下观察隔膜组装的方法:平面双层，球形支撑和杆支撑。这些方法可用于确定隔膜在不同组装阶段的生物物理参数:作为结合膜的单个八聚体，作为细丝，以及作为细丝的组装。我们将这些参数与曲率采样和优先吸附的测量值相结合，以了解曲率传感如何在各种长度和时间尺度上工作。

引言

细胞的形状及其许多内部隔室取决于它们周围的脂质膜。膜是粘弹性结构，可以通过与蛋白质的相互作用，脂质分选以及作用的内部和外部力来产生各种形状^{而变形1，2，3，4}。这些形状通常用膜曲率来描述。细胞使用一套多样化的蛋白质，能够优先组装或"感知"特定的膜曲率，以确保对包括细胞运输，细胞分裂和迁移在内的过程进行定义的时空控制^5，6。由于难以平衡时间和空间分辨率与细胞健康，因此很难观察到膜上细胞机制的动力学。虽然超分辨率技术可以提供这些结构的详细视图，但它们需要长时间的采集，而这些采集不适合大多数机械的装配/拆卸时间尺度。此外，这些组件在其天然环境中的分子复杂性以及单个组分可以发挥的众多作用使得最小重构系统成为研究分子功能能力的宝贵工具。

已经开发了最小膜模拟物来研究细胞外的膜特性和蛋白质 - 膜相互作用。膜模拟物从独立的脂质双分子层（例如脂质体或巨型单层囊泡）到支撑脂质双分子层（SLBs）^{7，8，9，10}不等。SLB是锚定在下层支撑物上的仿生膜，通常由玻璃，云母或二氧化硅^11，12组成。可以使用各种几何形状，包括平面，球体，棒，甚至起伏或微图案底物，以同时探测凹曲率和凸曲率上的蛋白质 - 膜相互作用1 ^3，14，^{15，16，17，18}.双层形成始于囊泡吸附到亲水表面上，然后熔合和破裂以形成连续的双层（图1）¹⁹。支撑的双层特别适合光学和电子显微镜检查，提供比细胞中通常可以实现的更好的时间和空间分辨率。弯曲的SLB特别提供了一种有吸引力的方法，可以在没有显着的膜变形的情况下探测蛋白质曲率灵敏度，使人们能够区分曲率传感和曲率感应，这在独立系统中通常是不可能分离的。

Septins是一类形成细丝的细胞骨架蛋白，以其在正弯曲膜上组装的能力而闻名^6，18，20。在酵母细胞周期的过程中，隔膜蛋白组装成一个环，并且必须重新排列以形成与芽出现和细胞分裂相关的沙漏和双环结构，分别为²¹。虽然已经使用铂复制电子显微镜在不同的细胞周期阶段²²观察隔膜蛋白结构，但使用酵母中的光学显微镜观察隔膜蛋白随时间的组装已经遇到了有限的空间分辨率。以前使用透射电子显微镜（TEM）可视化的脂质单层的隔膜蛋白的工作能够重建几个有趣的隔膜结构，如环，束和纱布²³。然而，与荧光显微镜不同，EM技术在时间分辨率方面同样受到限制。为了更好地解决隔膜组装的多尺度过程的动力学参数，我们转向了支持的膜模拟物，在那里人们可以仔细控制膜的几何形状，样品条件和成像模态。

这里描述的方案使用平面或弯曲的SLB，纯化的蛋白质和显微镜技术的组合。定量荧光共聚焦显微镜和全内反射荧光显微镜（TIRFM）用于测量本体蛋白质与各种膜曲率的结合，以及测量单分子的结合动力学。此外，该方案已被调整为与扫描电子显微镜（SEM）一起使用，以检查不同膜曲率上的蛋白质超微结构。虽然这些方案的重点是隔膜细胞骨架，但可以很容易地修改实验方案，以研究读者感兴趣的任何蛋白质的曲率敏感性。此外，那些在内吞作用或水泡运输等领域工作的人可能会发现这些技术可用于探测多蛋白复合物的曲率依赖性组装体。

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研究方案

注意:形成支撑的脂质双分子层需要制备单分散的小单层囊泡（SUV）。请参阅之前发布的关于SUV形成的协议²⁴ 。简而言之，所有SUV都是通过探针超声处理形成的，总共70%的幅度为12分钟，通过4分钟的超声处理周期，然后在冰水中休息2分钟。SUV解决方案必须明确，尺寸必须单分散。SUV的尺寸分布可以例如通过动态光散射²⁵来测量。

1. 平面脂质双层

1. 等离子清洗载玻片
   注意:等离子清洗可去除有机污染物并增加玻璃的亲水性，确保有效的脂质吸附。以下步骤可能会根据所使用的等离子清洁剂和玻璃盖玻片进行更改或需要优化。
   1. 用氧气吹扫等离子体清洁剂5分钟，以从管路和腔室中除去空气。这是为了确保在等离子体清洗机运行时，管路和腔室中主要有氧气，从而提供更一致的双层制剂。
   2. 吹扫时，将惰性气体（如 N₂ 或 Ar）流过微盖玻片，以除去灰尘和颗粒。
      可选:盖玻片可以通过喷洒100%异丙醇然后用水冲洗每面来清洗。重复异丙醇水洗涤3x，然后用N₂ 流干燥。
   3. 将干燥的盖玻片放入陶瓷底座中。将底座放在等离子体室的背面，使盖玻片与腔室的长边缘平行（这在等离子清洗过程中将它们保持在适当的位置）。用最大功率的氧气运行等离子清洗机15分钟。
2. 腔室制备
   注意:这里描述的方法使用来自塑料PCR管的自制腔室来支持反应体积，但其他低粘附性材料，如硅酮孔，也可能是合适的。
   1. 使用剃须刀片或剪刀，切下0.2 mL PCR管磨砂部分的正下方的盖子（图2）。
   2. 用紫外活化粘合剂涂上PCR管的边缘，避免管内部。轻轻地将PCR管胶合在血浆清洁的盖玻片的中心。
      注意:为避免腔室内出现胶水，请使用最少量的胶水进行密封，并立即用紫外线处理，而不会碰撞或干扰腔室。
   3. 将腔室置于长波长UV光下5-7分钟以固化粘合剂。
3. 双层形成
   注意:此步骤中应使用单分散SUV，以实现高效的双层形成。 表1 提供了双层地层中使用的所有缓冲液的配方，包括储备和最终缓冲液浓度。
   1. 加入40μL负载的脂质双层缓冲液（SLBB:300 mM氯化物，20 mMHEPES，pH 7.4，1 mMMgCl₂; 表1），将10微升5 mM SUV和1 μL 100 mM CaCl₂ 加入孔中。轻轻地从一侧到另一侧摇动腔室以破坏SUV，然后在37°C下孵育20分钟。
      注意:为了限制蒸发，用湿巾在有盖的培养皿中孵育。
4. 洗去多余的脂质
   注:此步骤将删除多余的 SUV 并充当缓冲区交换步骤。在洗涤时不要用移液器吸头刮擦双层非常重要;如果玻璃暴露，隔膜和许多其他蛋白质将不可逆地结合，降低有效蛋白质浓度。
   1. 孵育后，用150μLSL SLBB冲洗双层6x，每次上下移液以混合，同时避免气泡。
      注意:将150 μL直接加入到50 μL缓冲液和SUV中，在反应孔中总共加入200 μL。
   2. 当准备开始用隔膜蛋白或另一种选择的蛋白质孵育时，用150μL反应缓冲液（RXN:33.3mM氯化碳，50mM HEPES，pH 7.4，1.4mg / mL BSA，0.14%甲基纤维素，1mM BME）洗涤双层6x。
      注意:为获得最佳效果，使反应缓冲液新鲜，并在反应中充分混合时要非常小心，以避免气泡。
   3. 在最后一个洗涤步骤中，除去125μL反应缓冲液，在孔中留下75μL。加入25μL稀释在隔膜储存缓冲液（SSB:300mM KCl，50mM HEPES，pH 7.4，1mM BME）中稀释的隔膜，并通过TIRF显微镜²⁶成像。
      注意:首次设置该测定或加入新的脂质组合物时，最好使用光漂白（FRAP）后的荧光恢复来确保脂质在表面上自由扩散。虽然不同脂质组合物的恢复率会有所不同，并且本质上低于独立式系统，但脂质不应是静止的。

支持的脂质双层缓冲液 （SLBB）
股票	卷	最终浓度
2 M 氯化钾	1.5 毫升	300 米
1 米赫普斯	200 微升	20 米
500 mM 氯化镁2	20 微升	1 百万
水	8 毫升
反应前缓冲液
股票	卷	最终浓度
2 M 氯化钾	166 μL	33.3 百万
1 米赫普斯	500 微升	50 米
水	9.33 毫升
反应缓冲液
股票	卷	最终浓度
2 M 氯化钾	166 μL	33.3 百万
1 米赫普斯	300 微升	50 米
10 毫克/毫升双链氨基酸	1.39 毫升	1.39毫克/毫升
1%甲基纤维素	1.39 毫升	0.0014
水	高达 10 毫升
断续器	0.7 微升	1 百万
隔膜储存缓冲液
股票	卷	最终浓度
2 M 氯化钾	1.5 毫升	300 米
1 米赫普斯	500 微升	50 米
水	高达 10 毫升
断续器	0.7 微升	1 百万

表1:用于制备负载脂质双层和反应的缓冲液组分。 图中显示了掺入缓冲液中的储备溶液的体积和每种组分的最终浓度。SLB和PRB可以在室温下储存，并在实验之间重复使用。反应缓冲液和SSB在每个实验中都是新鲜的。

2. 球形支撑脂质双层

注意:该方案使用悬浮在超纯水中的二氧化硅微球，密度为10%。对于蛋白质组装动力学参数的任何工作，严格控制实验和曲率之间的总膜表面积非常重要。 表2 显示了校正后的微球和缓冲液的体积，以保持5毫米² 的总膜表面积。该协议扩展了先前发布的方法^8，18。

1. 双层形成
   注意:对于平面双层，重要的是要有高质量的SUV，以实现坚固的双层形成。 表 2 列出了来自 10% 密度溶液的磁珠体积及其各自的 SLBB 体积，这些体积用于在一系列磁珠直径下获得 5 mm² 的最终表面积。
   1. 二氧化硅微球（也称为珠子）倾向于沉降并聚集在一起;将珠子混合并分解任何簇，涡旋瓶子15秒，然后浴超声处理1分钟，然后再次涡旋15秒。
   2. 在0.5 mL低粘附微量离心管中将适当体积的磁珠（表2）与相应体积的SLBB和10μL的5 mM SUV混合。
   3. 在室温下将珠状脂质混合物端部上下摇1小时。确保在旋转器上进行此孵育，以防止沉淀。
2. 在PEGyl化盖玻片上准备腔室
   注意:对于平面双层，使用塑料PCR管自制的腔室来支持反应体积，但其他低粘附性材料（如硅酮孔）也可能同样有效。
   1. 当珠子摇晃时，在室温下解冻PEGyl化盖玻片。按照步骤1.2中所述，切割0.2 mL PCR管并将其粘附在盖玻片上。对于 24 mm x 50 mm 的载玻片，一张载玻片上最多可以安装 10 个腔室。
      注意:本实验方案使用预先制备的 24 mm x 50 mm 聚四氟乙烯化玻璃盖玻片。简而言之，玻璃盖玻片通过丙酮，甲醇和3 M KOH的超声处理彻底清洁。然后用n-2-氨基乙基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷官能化盖玻片，并与戊酸琥珀酰亚胺共价连接。成品PEGyl化盖玻片在-80°C真空密封下储存。 有关类似的钝化方案，请参阅Gidi等人的工作²⁷。虽然这里建议使用PEGyl化玻璃盖玻片，但其他钝化方法，例如BSA或聚-L-赖氨酸方法，可能是有效的。
3. 洗去多余的脂质
   注:此步骤的功能是去除多余的SUV并执行缓冲液更换。用预反应缓冲液（PRB:33.3 mM氯化钾，50mM HEPES，pH 7.4）总共洗涤4次珠子。 表 3 列出了一系列磁珠直径的旋转速度（以 RCF 为单位）。
   1. 在指定的RCF处旋转磁珠30秒（表3）。如果使用多种尺寸的珠子，请保持珠子摇晃，直到需要清洗。
      注意:为了节省时间，不值得以与较小珠子沉降速度较小的磁珠相同的旋转方式沉淀较大的磁珠。这可能导致磁珠相互粘附并损害双层的完整性。
   2. 第一次旋转后，除去50μL上清液并加入200μLPRB。第二次和第三次旋转后，除去200μL并加入200μLPRB。第四次旋转后，除去200μL并加入220μLPRB。每次洗涤时用力移液。
      注意:最终的重悬量与洗涤量不同。不要在与脂质孵育后涡旋磁珠，因为这会在双层中留下间隙。为了避免在处理其他磁珠尺寸或设置测定的其他部分时沉淀，请将磁珠混合物放回端对端旋转器上。
4. 准备反应
   注意:该反应旨在将反应的总膜表面积保持在5 mm² ，并产生100 mM KCl，50 mM HEPES，1 mg / mL BSA，0.1%甲基纤维素和1 mM BME的最终反应条件。
   1. 如果使用多种磁珠尺寸进行竞争性测定，则通过将每个磁珠尺寸的相等体积混合在一起来制成1:1的混合物。然后，将29μL所需的微球混合物（或单个珠子）与721μLRXN缓冲液混合。
      注意:重要的是在每一步用移液器彻底混合磁珠，以避免密集的磁珠簇;这将导致更均匀的磁珠分布和准确的总表面积。
   2. 将75μL稀释的微球和25μL在SSB中稀释的蛋白质混合到孔中。
      注意:作者通常在1-50 nM下对酵母隔膜复合物进行成像。
   3. 如果在稳态下测量隔膜，则在室温下孵育1小时，然后通过近TIRF或共聚焦显微镜成像。

磁珠直径（微米）	混合良好的微球体积 （μL）	负载均衡缓冲液体积（μL）	单反车辆容积（μL）
6.46	8.94	61.1	10
5.06	7	63	10
3.17	4.39	65.6	10
0.96	1.33	68.7	10
0.54	0.75	69.3	10
0.31	0.43	69.6	10

表2:微球的标准化体积。 为了保持每个磁珠尺寸的相等表面积，并保持实验之间的总膜表面积一致，计算每个磁珠尺寸的体积和归一化总表面积的缓冲液。

磁珠直径（微米）	沉降速度
0.31	4.5
0.54	4.5
0.96	2.3
3.17	0.8
5.06	0.3

表3:不同直径微球的沉降速度。 对于每个珠径，使用所示的最小沉降速度来沉淀磁珠以洗去未结合的脂质体。

3. 棒状支撑脂质双分子层

注意:与此处介绍的其他测定方法相比，棒状测定不允许仔细控制总膜表面积。实验之间的数量和体积可以保持一致，但由于这导致不同长度和直径的棒，因此很难推断出反应中的总膜表面积。因此，虽然这是在单个表面上探索具有多个曲率的曲率传感的出色测定方法，并且对于探索隔膜蛋白超微结构很有用，但不建议用于动力学测量。这种方法以前曾被报道^过18 次，现在正在这里进行扩展。

1. 从玻璃超细纤维过滤器中获取硼硅酸盐棒
   1. 将单个42.5 mm级GF / C玻璃超细纤维过滤器撕成小块，并将它们放入装有60 mL 100%乙醇的100 mL烧杯中。浴超声处理，直到溶液变得不透明;这可能需要20-30分钟，使用精细的过滤器。
      注意:彻底超声处理以分解大块;越解离/不透明越好。
   2. 用薄膜覆盖溶液，并将溶液在室温下储存过夜。
2. 在棒材上形成双层
   注意:此步骤是用过量的脂质执行的，以实现完全的棒覆盖，因为在这种方法中不可能量化总表面积。
   1. 第二天乙醇溶液将被沉淀（步骤3.1.2），因此请在使用前充分混合。将10 μL棒状溶液和70 μL SLBB混合。
   2. 在小型离心机中以最高速度旋转30秒，并除去50μL上清液。在另一个50μLS SLBB中重悬，并重复旋转共洗涤四次以稀释乙醇。
      注意:杆支撑不会在管的底部形成固体颗粒。相反，它们沿着管子的侧面涂抹;这使得它们在洗涤时难以完全保存。由于该测定中的总表面积不受控制，因此如果它们受到干扰也没关系。
   3. 将10μL充分混合的棒状溶液与50μL5 mM SUV和20μLSL SLBB混合。在室温下孵育1小时，在微球上形成双层时端到端旋转。
3. 洗去多余的脂质
   1. 与步骤3.2.2.类似，在小型离心机中以最高速度旋转脂质棒溶液30秒，以将膜包被的棒从溶液中沉淀出来。
   2. 第一次旋转后，除去50μL上清液并加入200μLPRB。第二次和第三次旋转后，除去200μL并加入200μLPRB。第四次旋转后，取出200μL，加入220μLPRB，并用力移液混合。
4. 准备反应
   1. 在1.5 mL微量离心管中，将721μL反应缓冲液与29μL棒状溶液混合。搅拌均匀。
   2. 在0.2 mL PCR管中，将75μL棒在反应缓冲液中和25μL隔膜蛋白以所需浓度混合，在SSB中稀释。让它在室温下孵育至少1小时。
5. 扫描电子显微镜的准备
   1. 孵育后，将100μL隔膜棒混合物加入圆形PEG包被的12mm盖玻片上，并在室温下在封闭的培养皿中孵育1小时。
   2. 通过在培养皿的底部（10mL应足够）中用2.5%戊二醛在0.05M二甲酸钠（NaCo），pH 7.4中固定样品，持续30分钟。用玻璃移液管吸出液体。通过用10 mL 0.05 M NaCo孵育样品5分钟来洗涤样品，并重复总共洗涤两次。
   3. 在0.5%OsO₄ 二甲苯二甲酸盐缓冲液中后固定30分钟，然后在0.05M NaCo中洗涤3x（每洗涤5分钟）。
   4. 将样品与1%单宁酸孵育15分钟，然后在NaCo 3x中洗涤。在0.5%OsO₄ 中孵育15分钟，并用NaCo洗涤3x。
   5. 使用增加乙醇浓度对样品进行脱水:30%EtOH 5分钟，2x;50%环氧乙烷酮5分钟;75%环氧乙烷持续5分钟;和 100% 环氧乙烷 5 分钟，2 倍。然后再进行10分钟的孵育。
   6. 在过渡液（六甲基二硅氮烷）中孵育3x（5分钟，10分钟，然后5分钟）。
   7. 风干，然后将样品放入干燥器中，直到溅射涂层。用金/钯合金溅射涂覆4nm层，然后在扫描电子显微镜上成像。

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结果

在制备每个SLB之后，可以将分隔蛋白或目标蛋白质与所需的支持物一起孵育，并通过TIRFM，共聚焦显微镜或SEM成像。这里显示的结果使用从 大肠杆菌¹⁷重组表达和纯化的隔膜蛋白。在平面SLB上使用TIRFM，可以确定灯丝的长度及其柔韧性，测量扩散系数并观察^28，29随时间变化的装配。为了收集最高质量的测量结果，首先需要确定双...

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讨论

细胞膜具有许多不同的形状、曲率和物理化学性质。为了研究细胞构建微米级组件的纳米级机械，有必要设计膜模拟物的最小重构系统。该协议提供了精确控制膜曲率和成分的技术，同时允许用户使用广泛使用的显微镜技术轻松进行定量荧光测量。

该协议的最关键组成部分是在适当的表面上组装孔并处理脂质。这里描述的孔是使用PCR管和UV活化粘合剂手工制作的;重要的是，?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural	Watson	137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubes	USA Scientific	1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslips	Thermo Scientific	152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375
Egg Liss Rhodamine PE	Avanti Polar Lipids	810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade	VWR	16220
EMS Sodium Cacodylate Buffer	VWR	11652
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-223EA
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191
Magnesium chloride	VWR	7791-18-6
Methyl cellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
Microglass coverslips for planar bilayers	Matsunami	Discontinued	22x22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica Microspheres	Bangs Laboratories, Inc.	Depends on size: SS0200*-SS0500*	Silica in aqueous suspension
Optical Adhesive	Norland Thorlabs	NOA 68	Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxide	Millipore Sigma	20816-12-0
Parafilm	VWR	52858-000
Plasma Cleaner	Plasma Etch	PE-25	Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chloride	VWR	0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm	VWR	64-0712
Sonicator bath	Branson	1510R-MT	Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PI	Avanti Polar Lipids	840044
Tabletop centrifuge	Eppendorf	22331
UV Lamp	Spectroline	ENF-260C	115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter Paper	VWR	28455-030	42.5 mm diameter, Grade GF/C