Ricostituzione dell'assemblaggio di septina alle membrane per lo studio delle proprietà e delle funzioni biofisiche

Riepilogo

La ricostituzione senza cellule è stata uno strumento chiave per comprendere l'assemblaggio del citoscheletro e il lavoro nell'ultimo decennio ha stabilito approcci per studiare la dinamica della settina in sistemi minimi. Qui sono presentati tre metodi complementari per osservare l'assemblaggio della settina in diversi contesti di membrana: doppi strati planari, supporti sferici e supporti per aste.

Abstract

La maggior parte delle cellule può percepire e cambiare la propria forma per eseguire processi cellulari fondamentali. In molti eucarioti, il citoscheletro della settina è una componente integrante nel coordinare i cambiamenti di forma come la citochinesi, la crescita polarizzata e la migrazione. Le settine sono proteine che formano filamenti che si assemblano per formare diverse strutture di ordine superiore e, in molti casi, si trovano in diverse aree della membrana plasmatica, in particolare nelle regioni di curvatura positiva su scala micron. Il monitoraggio del processo di assemblaggio della settina in vivo è ostacolato dalle limitazioni della microscopia ottica nelle cellule, nonché dalla complessità delle interazioni sia con le membrane che con gli elementi citoscheletrici, rendendo difficile quantificare la dinamica della settina nei sistemi viventi. Fortunatamente, ci sono stati progressi sostanziali nell'ultimo decennio nella ricostituzione del citoscheletro della settina in un sistema privo di cellule per sezionare i meccanismi che controllano l'assemblaggio della settina ad alte risoluzioni spaziali e temporali. Le fasi principali dell'assemblaggio della settina includono l'associazione e la dissociazione dell'eterooligomero della settina con la membrana, la polimerizzazione in filamenti e la formazione di strutture di ordine superiore attraverso le interazioni tra i filamenti. Qui, presentiamo tre metodi per osservare l'assemblaggio della settina in diversi contesti: doppi strati planari, supporti sferici e supporti per aste. Questi metodi possono essere utilizzati per determinare i parametri biofisici delle settine in diverse fasi di assemblaggio: come singoli ottameri che legano la membrana, come filamenti e come gruppi di filamenti. Utilizziamo questi parametri abbinati a misurazioni del campionamento della curvatura e dell'adsorbimento preferenziale per capire come funziona il rilevamento della curvatura in una varietà di scale di lunghezza e tempo.

Introduzione

Le forme delle cellule e molti dei loro compartimenti interni dipendono dalle membrane lipidiche che le circondano. Le membrane sono strutture viscoelastiche che possono essere deformate attraverso interazioni con proteine, selezione lipidica e forze interne ed esterne che agiscono per generare una varietà di forme 1,2,3,4. Queste forme sono spesso descritte in termini di curvatura della membrana. Le cellule utilizzano una suite diversificata di proteine in grado di assemblarsi preferenzialmente su particolari curvature di membrana per garantire un controllo spazio-temporale definito su processi tra cui il traffico cellulare, la citochinesi e la migrazione ^5,6. La dinamica dei macchinari cellulari sulla membrana è notevolmente difficile da osservare a causa della difficoltà di bilanciare il tempo e la risoluzione spaziale con la salute delle cellule. Mentre le tecniche di super-risoluzione possono offrire una visione dettagliata di tali strutture, richiedono lunghe acquisizioni che non sono suscettibili ai tempi di assemblaggio / smontaggio per la maggior parte dei macchinari. Inoltre, la complessità molecolare di questi assemblaggi nel loro ambiente nativo e la moltitudine di ruoli che un singolo componente può svolgere rendono i sistemi di ricostituzione minimi uno strumento prezioso per studiare la capacità funzionale delle molecole.

Sono stati sviluppati mimetici di membrana minimi per studiare le proprietà della membrana e le interazioni proteina-membrana al di fuori della cellula. I mimetici di membrana variano da doppi strati lipidici indipendenti, come liposomi o vescicole unilamellari giganti, a doppi strati lipidici supportati (SLB)7,8,9,10. Le SLB sono membrane biomimetiche ancorate al supporto sottostante, tipicamente composte da vetro, mica o silice^11,12. È possibile utilizzare una varietà di geometrie, tra cui superfici planari, sfere, barre e persino substrati ondulati o micropatterati per sondare simultaneamente le interazioni proteina-membrana su curvature concave e convesse¹ 3,14,15,16,17,18 . La formazione di due strati inizia con l'adsorbimento delle vescicole su una superficie idrofila, seguita dalla fusione e dalla rottura per formare un doppio strato continuo (Figura 1)¹⁹. I doppi strati supportati sono particolarmente suscettibili alla microscopia ottica ed elettronica, fornendo sia una migliore risoluzione temporale che spaziale rispetto a quella spesso ottenibile nelle cellule. Le SLB curve forniscono in particolare un mezzo interessante per sondare la sensibilità alla curvatura delle proteine in assenza di una significativa deformazione della membrana, consentendo di distinguere tra rilevamento della curvatura e induzione della curvatura, che sono spesso impossibili da separare nei sistemi indipendenti.

Le settine sono una classe di proteine citoscheletriche che formano filamenti ben note per la loro capacità di assemblarsi su membrane curve positive ^6,18,20. Nel corso del ciclo cellulare nel lievito, le settine si assemblano in un anello e devono riorganizzarsi per formare le strutture a clessidra e a doppio anello associate all'emergenza delle gemme e alla citochinesi, rispettivamente²¹. Mentre un bel lavoro è stato fatto usando la microscopia elettronica replica al platino per osservare l'architettura della settina in vari stadi del ciclo cellulare²², guardare l'assemblaggio della settina nel tempo usando la microscopia ottica nel lievito ha incontrato una risoluzione spaziale limitata. Precedenti lavori sulle settine utilizzando monostrati lipidici visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono stati in grado di ricostituire diverse strutture di settina interessanti come anelli, fasci e garze²³. Tuttavia, le tecniche EM sono anche limitate nella loro risoluzione temporale, a differenza della microscopia a fluorescenza. Al fine di risolvere meglio i parametri cinetici del processo multiscala di assemblaggio della settina, ci siamo rivolti alla mimetica di membrana supportata, dove è possibile controllare attentamente la geometria della membrana, le condizioni del campione e la modalità di imaging.

I protocolli qui descritti utilizzano SLB planari o curvi, proteine purificate e una combinazione di tecniche di microscopia. La microscopia confocale a fluorescenza quantitativa e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM) sono state utilizzate sia per misurare il legame proteico di massa su varie curvature di membrana, sia per misurare la cinetica di legame di singole molecole. Inoltre, questo protocollo è stato adattato per essere utilizzato con la microscopia elettronica a scansione (SEM) per esaminare l'ultrastruttura proteica su diverse curvature della membrana. Mentre il focus di questi protocolli è sul citoscheletro della settina, i protocolli possono essere facilmente modificati per indagare la sensibilità alla curvatura di qualsiasi proteina che il lettore trova interessante. Inoltre, coloro che lavorano in campi come l'endocitosi o il traffico vescicolare possono trovare queste tecniche utili per sondare gli assemblaggi dipendenti dalla curvatura di complessi multi-proteici.

Protocollo

NOTA: la formazione di doppi strati lipidici supportati richiede la preparazione di piccole vescicole unilamellari monodisperse (SUV). Si prega di fare riferimento a un protocollo²⁴ precedentemente pubblicato sulla formazione di SUV. In breve, tutti i SUV sono formati dalla sonicazione della sonda per 12 minuti in totale al 70% di ampiezza attraverso periodi di sonicazione di 4 minuti seguiti da periodi di riposo di 2 minuti in acqua ghiacciata. Le soluzioni SUV devono essere ben chiarite e monodisperse nelle dimensioni. Le distribuzioni dimensionali dei SUV possono essere misurate, ad esempio, mediante la diffusione dinamica della luce²⁵.

1. Doppi strati lipidici planari

1. Pulizia al plasma dei vetrini
   NOTA: La pulizia al plasma rimuove i contaminanti organici e aumenta l'idrofilia del vetro, garantendo un efficiente adsorbimento lipidico. I seguenti passaggi possono cambiare o devono essere ottimizzati a seconda del detergente al plasma e dei coperchi di vetro utilizzati.
   1. Spurgare il detergente al plasma per 5 minuti con ossigeno per rimuovere l'aria dalle linee e dalla camera. Questo per garantire che, quando il pulitore al plasma viene eseguito, ci sia principalmente ossigeno nelle linee e nella camera, fornendo preparazioni a doppio strato più coerenti.
   2. Durante lo spurgo, far scorrere un gas inerte, come N₂ o Ar, sui vetrini di copertura micro per rimuovere polvere e particolato.
      OPZIONALE: I vetrini di copertura possono essere lavati spruzzando ciascun lato con isopropanolo al 100% seguito da acqua. Ripetere il lavaggio isopropanolo-acqua 3 volte e quindi asciugare con un flusso N₂ .
   3. Disporre i vetrini di copertura asciutti in una culla in ceramica. Posizionare la culla sul retro della camera al plasma in modo che i coverslip siano paralleli al bordo lungo della camera (questo li mantiene in posizione durante la pulizia al plasma). Far funzionare il pulitore al plasma per 15 minuti con ossigeno alla massima potenza.
2. Preparazione della camera
   NOTA: Il metodo qui descritto utilizza camere fatte in casa da tubi PCR in plastica per supportare i volumi di reazione, ma anche altri materiali a bassa adesione, come i pozzetti in silicone, possono essere adatti.
   1. Usando una lama di rasoio o forbici, tagliare il cappuccio appena sotto la parte smerigliata di un tubo PCR da 0,2 ml (Figura 2).
   2. Verniciare il bordo del tubo PCR con adesivo attivato dai raggi UV, evitando l'interno del tubo. Posizionare delicatamente la colla del tubo PCR al centro di una cartella pulita al plasma.
      NOTA: Per evitare la colla all'interno della camera, utilizzare la quantità minima di colla per ottenere una tenuta e trattare prontamente con UV senza urtare o disturbare la camera.
   3. Posizionare la camera sotto la luce UV a lunga lunghezza d'onda per 5-7 minuti per polimerizzare l'adesivo.
3. Formazione di due strati
   NOTA: i SUV monodispersi devono essere utilizzati in questa fase per una formazione efficiente a doppio strato. La tabella 1 fornisce le ricette per tutti i tamponi utilizzati nella formazione del doppio strato, comprese le concentrazioni di scorte e tamponi finali.
   1. Aggiungere 40 μL di tampone lipidico a doppio strato supportato (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl₂; Tabella 1), 10 μL di SUV da 5 mM e 1 μL di 100 mM CaCl₂ al pozzo. Agitare delicatamente le camere da un lato all'altro per interrompere i SUV, quindi incubare a 37 °C per 20 minuti.
      NOTA: Per limitare l'evaporazione, incubare in una capsula di Petri coperta con una salvietta umidificata.
4. Lavare via i lipidi in eccesso
   NOTA: questo passaggio rimuove i SUV in eccesso e funge da passaggio di scambio del buffer. È molto importante non raschiare il doppio strato con la punta della pipetta durante il lavaggio; se il vetro è esposto, le settine e molte altre proteine si legano irreversibilmente, riducendo la concentrazione proteica effettiva.
   1. Dopo l'incubazione, sciacquare il doppio strato 6x con 150 μL di SLBB, pipettando su e giù per mescolare ogni volta evitando bolle.
      NOTA: Aggiungere 150 μL direttamente ai 50 μL di tampone e SUV già presenti per un totale di 200 μL nel pozzo di reazione.
   2. Quando si è pronti per iniziare l'incubazione con le settine o una proteina diversa di scelta, lavare il doppio strato 6x con 150 μL di tampone di reazione (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg / mL BSA, 0,14% metilcellulosa, 1 mM BME).
      NOTA: Per ottenere i migliori risultati, rendere fresco il tampone di reazione e fare molta attenzione mentre si mescola bene la reazione per evitare bolle.
   3. Nell'ultima fase di lavaggio, rimuovere 125 μL di tampone di reazione, lasciando 75 μL nel pozzo. Aggiungere 25 μL di settine diluite nel tampone di stoccaggio della settina (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME) alla concentrazione desiderata e immagine mediante microscopia TIRF²⁶.
      NOTA: Quando si imposta questo test per la prima volta o si incorpora una nuova composizione lipidica, è buona norma assicurarsi che i lipidi si diffondano liberamente sulla superficie utilizzando il recupero di fluorescenza dopo il fotosbiancamento (FRAP). Mentre il tasso di recupero sarà diverso per le diverse composizioni lipidiche e intrinsecamente inferiore rispetto ai sistemi indipendenti, i lipidi non dovrebbero essere immobili.

Tampone lipidico a doppio strato supportato (SLBB)
Ceppo	Volume	Concentrazione finale
2 M KCl	1,5 ml	300 metri quadrati
1 M HEPES	200 μL	20 mM
500 mM MgCl2	20 μL	1 mM
Acqua	8 ml
Tampone di pre-reazione (PRB)
Ceppo	Volume	Concentrazione finale
2 M KCl	166 μL	33,3 mM
1 M HEPES	500 μL	50 metri quadrati
Acqua	9,33 ml
Tampone di reazione
Ceppo	Volume	Concentrazione finale
2 M KCl	166 μL	33,3 mM
1 M HEPES	300 μL	50 metri quadrati
10 mg/mL BSA	1,39 ml	1,39 mg/ml
1% Metilcellulosa	1,39 ml	0.0014
Acqua	Fino a 10 ml
Bme	0,7 μL	1 mM
Buffer di archiviazione septin (SSB)
Ceppo	Volume	Concentrazione finale
2 M KCl	1,5 ml	300 metri quadrati
1 M HEPES	500 μL	50 metri quadrati
Acqua	Fino a 10 ml
Bme	0,7 μL	1 mM

Tabella 1: Componenti tampone per la preparazione di doppio strato lipidico supportato e reazioni. Vengono mostrati i volumi di soluzioni stock incorporate nei buffer e le concentrazioni finali di ciascun componente. SLB e PRB possono essere conservati a temperatura ambiente e riutilizzati tra gli esperimenti. Il buffer di reazione e l'SSB sono resi freschi per ogni esperimento.

2. Doppi strati lipidici supportati sferici

NOTA: Questo protocollo utilizza microsfere di silice sospese in acqua ultrapura al 10% di densità. Per qualsiasi lavoro sui parametri cinetici dell'assemblaggio delle proteine, è importante controllare rigorosamente l'area totale della superficie della membrana tra esperimenti e curvature. La tabella 2 mostra i volumi corretti di perline e tampone per mantenere 5 mm² della superficie totale della membrana. Questo protocollo si espande su un metodo precedentemente pubblicato ^8,18.

1. Formazione di due strati
   NOTA: Per quanto riguarda i doppi strati planari, è importante disporre di SUV di alta qualità per una robusta formazione di due strati. La tabella 2 elenca il volume di perline da una soluzione a densità del 10% e i rispettivi volumi SLBB utilizzati per ottenere una superficie finale di 5 mm² per un intervallo di diametri di perline.
   1. Le microsfere di silice (note anche come perline) tendono a depositarsi e raggrupparsi insieme; per mescolare le perline e rompere eventuali grappoli, vortice la bottiglia per 15 s, quindi bagno-sonicate per 1 minuto e vortice di nuovo per 15 s.
   2. Mescolare il volume appropriato di perline (Tabella 2) con il volume corrispondente di SLBB e 10 μL di SUV da 5 mM in un tubo microcentrifuga a bassa adesione da 0,5 mL.
   3. Cullare la miscela di perline-lipidi end-over-end per 1 ora a temperatura ambiente. Assicurarsi che questa incubazione avvenga su un rotatore per prevenire la sedimentazione.
2. Preparare le camere su coverslip PEGylated
   NOTA: Per quanto riguarda i doppi strati planari, le camere fatte in casa da tubi PCR in plastica vengono utilizzate per supportare i volumi di reazione, ma altri materiali a bassa adesione, come i pozzetti in silicone, possono funzionare altrettanto bene.
   1. Mentre le perline oscillano, scongela una copertura PEGilata a temperatura ambiente. Tagliare un tubo PCR da 0,2 ml e incollarlo al coperchio come descritto al punto 1.2. Per guide da 24 mm x 50 mm, fino a 10 camere possono essere adattate in modo fattibile a una diapositiva.
      NOTA: questo protocollo utilizza coperture in vetro PEGilato da 24 mm x 50 mm preparate in anticipo. In breve, le coperture in vetro vengono accuratamente pulite attraverso la sonicazione in acetone, metanolo e 3 M KOH. I coverslip vengono quindi funzionalizzati con n-2-amminoetil-3-amminopropiltrimetossisilano e legati covalentemente al succinimidyl valerato di mPEG. I coperchi in PEGilati finiti vengono conservati sottovuoto a -80 °C. Per un protocollo di passivazione simile, si veda il lavoro di Gidi et ^al.27. Mentre i coverslip in vetro PEGilato sono suggeriti qui, altri mezzi di passivazione, come i metodi BSA o poli-L-lisina, possono essere efficaci.
3. Lavare via i lipidi in eccesso
   NOTA: questo passaggio funziona per rimuovere i SUV in eccesso ed eseguire uno scambio di buffer. Le perline vengono lavate 4 volte in totale con tampone di pre-reazione (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). La tabella 3 elenca le velocità di rotazione in RCF per un intervallo di diametri di perline.
   1. Spin perline presso l'RCF designato per 30 s (Tabella 3). Se si utilizzano più dimensioni di perline, mantenere le perline a dondolo fino a quando non è il momento di essere lavate.
      NOTA: non vale la pena sedimentare perline più grandi nello stesso spin di perline più piccole con la velocità di sedimentazione delle perline più piccola per risparmiare tempo. Ciò può far sì che le perline si attacchino l'una all'altra e compromettano l'integrità del doppio strato.
   2. Dopo il primo giro, rimuovere 50 μL di surnatante e aggiungere 200 μL di PRB. Dopo il secondo e il terzo giro, rimuovere 200 μL e aggiungere 200 μL di PRB. Dopo il quarto giro, rimuovere 200 μL e aggiungere 220 μL di PRB. Pipetta vigorosamente per ogni lavaggio.
      NOTA: il volume finale di risospensione è diverso dai lavaggi. Non vorticare le perline dopo l'incubazione con i lipidi in quanto ciò può lasciare lacune nei doppi strati. Per evitare la sedimentazione mentre si lavora con le altre dimensioni di perline o si impostano altre parti del test, riposizionare le miscele di perline sul rotatore end-over-end.
4. Preparare la reazione
   NOTA: Questa reazione è progettata per preservare l'area totale della superficie della membrana della reazione a 5 mm² e per produrre una condizione di reazione finale di 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/mL BSA, 0,1% metilcellulosa e 1 mM BME.
   1. Se si esegue un test di competizione con più dimensioni di perline, creare una miscela 1: 1 mescolando volumi uguali di ciascuna dimensione di perline insieme. Quindi, mescolare 29 μL della miscela di perline desiderata (o di una singola perla) con 721 μL di tampone RXN.
      NOTA: È importante mescolare accuratamente le perline ad ogni passo con una pipetta per evitare densi gruppi di perline; ciò si tradurrà in una distribuzione delle perline più uniforme e in una superficie totale accurata.
   2. Mescolare 75 μL di perline diluite e 25 μL di proteine diluite in SSB ai pozzetti.
      NOTA: Gli autori in genere immaginano complessi di settina di lievito a 1-50 nM.
   3. Se si misurano le settine allo stato stazionario, incubare a temperatura ambiente per 1 ora e quindi l'immagine mediante quasi TIRF o microscopia confocale.

Diametro del tallone (μm)	Volume di perline ben miscelate (μL)	Volume del tampone SLB (μL)	Volume dei SUV (μL)
6.46	8.94	61.1	10
5.06	7	63	10
3.17	4.39	65.6	10
0.96	1.33	68.7	10
0.54	0.75	69.3	10
0.31	0.43	69.6	10

Tabella 2: Volumi normalizzati di microsfere. Al fine di mantenere una superficie uguale di ciascuna dimensione del tallone e di mantenere la superficie totale della membrana coerente tra gli esperimenti, sono stati calcolati i volumi per ogni dimensione del tallone e il buffer che normalizzava la superficie totale.

Diametro del tallone (μm)	Velocità di sedimentazione (RCF)
0.31	4.5
0.54	4.5
0.96	2.3
3.17	0.8
5.06	0.3

Tabella 3: Velocità di sedimentazione per microsfere di diametro variabile. Per ogni diametro di perline, le velocità minime di sedimentazione mostrate sono state utilizzate per pellettare le perline per lavare via i liposomi non legati.

3. Doppi strati lipidici supportati da bastoncelli

NOTA: A differenza degli altri saggi qui presentati, il test dell'asta non consente un attento controllo della superficie totale della membrana. Si può essere coerenti in quantità e volumi tra gli esperimenti, ma poiché questo si traduce in aste di diverse lunghezze e diametri, è difficile estrapolare l'area totale della superficie della membrana nella reazione. Pertanto, mentre questo è un test eccellente per esplorare il rilevamento della curvatura con più curvature su una singola superficie ed è stato utile per esplorare l'ultrastruttura della settina, non è raccomandato per le misurazioni cinetiche. Questo metodo è stato precedentemente segnalato¹⁸ e viene ampliato qui.

1. Ottenere barre di borosilicato da filtri in microfibra di vetro
   1. Strappare un singolo filtro in microfibra di vetro GF/C da 42,5 mm in piccoli pezzi e metterli in un becher da 100 ml con 60 ml di etanolo al 100%. Bagno-sonicare fino a quando la soluzione diventa opaca; questo può richiedere solo 20-30 minuti con un filtro finemente triturato.
      NOTA: Sonicate accuratamente per rompere grossi pezzi; più dissociato/opaco, meglio è.
   2. Coprire la soluzione con pellicola e conservare la soluzione a temperatura ambiente durante la notte.
2. Formatura di doppi strati sulle aste
   NOTA: questo passaggio viene eseguito con lipidi in eccesso per ottenere una copertura completa dell'asta in quanto è impossibile quantificare la superficie totale in questo metodo.
   1. Il giorno successivo la soluzione di etanolo verrà sistemata (passaggio 3.1.2.), quindi mescolarla bene prima dell'uso. Combinare 10 μL di soluzione di asta e 70 μL di SLBB.
   2. Ruotare alla massima velocità in una mini centrifuga per 30 s e rimuovere 50 μL del surnatante. Risospesare in altri 50 μL di SLBB e ripetere lo spin per un totale di quattro lavaggi per diluire l'etanolo.
      NOTA: i supporti dell'asta non formeranno un pellet solido sul fondo del tubo. Sono invece spalmati lungo il lato del tubo; questo li rende difficili da conservare completamente durante il lavaggio. Poiché la superficie totale in questo test non è controllata, va bene se sono disturbati.
   3. Combinare 10 μL di soluzione di asta ben miscelata con 50 μL di SUV da 5 mM e 20 μL di SLBB. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente, ruotando end-over-end come quando si formano due strati sulle microsfere.
3. Lavare via i lipidi in eccesso
   1. Analogamente al punto 3.2.2., far girare la soluzione di asta lipidica alla massima velocità in una mini centrifuga per 30 s per pellettizzare le aste rivestite a membrana fuori dalla soluzione.
   2. Dopo il primo giro, rimuovere 50 μL del surnatante e aggiungere 200 μL di PRB. Dopo il secondo e il terzo giro, rimuovere 200 μL e aggiungere 200 μL di PRB. Dopo il quarto giro, rimuovere 200 μL, aggiungere 220 μL di PRB e pipettare vigorosamente per mescolare.
4. Preparare la reazione
   1. In un tubo microcentrifuga da 1,5 mL, mescolare 721 μL di tampone di reazione con 29 μL di soluzione di asta. Mescolare bene.
   2. In un tubo PCR da 0,2 mL, combinare 75 μL di barre in tampone di reazione e 25 μL di settine alla concentrazione desiderata, diluite in SSB. Lasciare incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
5. Preparazione per la microscopia elettronica a scansione
   1. Dopo l'incubazione, aggiungere la miscela settina-asta da 100 μL su un coperchio rotondo da 12 mm rivestito con PEG e incubare a temperatura ambiente per 1 ora in una capsula di Petri chiusa.
   2. Fissare il campione riempiendo il fondo della capsula di Petri (10 ml dovrebbero essere sufficienti) con il 2,5% di glutaraldeide in cacodilato di sodio 0,05 M (NaCo), pH 7,4, per 30 minuti. Aspirare il liquido con una pipetta di vetro. Lavare il campione incubandolo con 10 ml di 0,05 M NaCo per 5 minuti e ripetere per un totale di due lavaggi.
   3. Postfix in 0,5% OsO₄ tampone cacodilato per 30 min, quindi lavare 3x in 0,05 M NaCo (5 min/lavaggio).
   4. Incubare il campione con acido tannico all'1% per 15 minuti, quindi lavare in NaCo 3x. Incubare per 15 minuti in 0,5% OsO₄ e lavare 3 volte con NaCo.
   5. Disidratare i campioni utilizzando concentrazioni crescenti di etanolo: 30% EtOH per 5 min, 2x; 50% EtOH per 5 min; 75% EtOH per 5 min; e 100% EtOH per 5 min, 2x. Seguire con un'altra incubazione di 10 minuti.
   6. Incubare in fluido di transizione (esametildilisilazane) 3x (5 min, 10 min, poi 5 min).
   7. Lasciare asciugare all'aria, quindi posizionare i campioni in un essiccatore fino a sputter-coating. Sputter-rivestire lo strato di 4 nm con una lega di oro / palladio e quindi l'immagine su un microscopio elettronico a scansione.

Risultati

Dopo la preparazione di ogni SLB, le settine o la proteina di interesse possono essere incubate con il supporto desiderato e fotografate tramite TIRFM, microscopia confocale o SEM. I risultati mostrati qui utilizzano settine espresse in modo ricombinante e purificate da E. coli¹⁷. Utilizzando TIRFM su SLB planari, è possibile determinare la lunghezza dei filamenti e la loro flessibilità, misurare i coefficienti di diffusione e osservare l'assemblaggio nel tempo^28,29

Discussione

Le membrane cellulari assumono molte forme, curvature e proprietà fisico-chimiche diverse. Per studiare il meccanismo su scala nanometrica attraverso il quale le cellule costruiscono assemblaggi su scala micrometrica, è necessario progettare sistemi di ricostituzione minimi di mimetica a membrana. Questo protocollo presenta tecniche che controllano con precisione sia la curvatura della membrana che la composizione, consentendo all'utente di effettuare facilmente misurazioni quantitative di fluorescenza utilizzando tecn...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural	Watson	137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubes	USA Scientific	1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslips	Thermo Scientific	152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375
Egg Liss Rhodamine PE	Avanti Polar Lipids	810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade	VWR	16220
EMS Sodium Cacodylate Buffer	VWR	11652
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-223EA
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191
Magnesium chloride	VWR	7791-18-6
Methyl cellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
Microglass coverslips for planar bilayers	Matsunami	Discontinued	22x22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica Microspheres	Bangs Laboratories, Inc.	Depends on size: SS0200*-SS0500*	Silica in aqueous suspension
Optical Adhesive	Norland Thorlabs	NOA 68	Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxide	Millipore Sigma	20816-12-0
Parafilm	VWR	52858-000
Plasma Cleaner	Plasma Etch	PE-25	Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chloride	VWR	0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm	VWR	64-0712
Sonicator bath	Branson	1510R-MT	Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PI	Avanti Polar Lipids	840044
Tabletop centrifuge	Eppendorf	22331
UV Lamp	Spectroline	ENF-260C	115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter Paper	VWR	28455-030	42.5 mm diameter, Grade GF/C