Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Zusammenfassung

Die zellfreie Rekonstitution war ein Schlüsselwerkzeug, um die Zytoskelett-Montage zu verstehen, und die Arbeit in den letzten zehn Jahren hat Ansätze zur Untersuchung der Septindynamik in minimalen Systemen etabliert. Hier werden drei komplementäre Methoden zur Beobachtung der Septinmontage in verschiedenen Membrankontexten vorgestellt: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen.

Zusammenfassung

Die meisten Zellen können ihre Form wahrnehmen und verändern, um grundlegende Zellprozesse durchzuführen. Bei vielen Eukaryoten ist das Septin-Zytoskelett ein integraler Bestandteil bei der Koordination von Formveränderungen wie Zytokinese, polarisiertem Wachstum und Migration. Septine sind filamentbildende Proteine, die sich zu verschiedenen Strukturen höherer Ordnung zusammensetzen und in vielen Fällen in verschiedenen Bereichen der Plasmamembran vorkommen, insbesondere in Regionen mit positiver Krümmung im Mikrometerbereich. Die Überwachung des Prozesses der Septinmontage in vivo wird durch die Einschränkungen der Lichtmikroskopie in Zellen sowie durch die Komplexität der Wechselwirkungen mit Membranen und Zytoskelettelementen behindert, was es schwierig macht, die Septindynamik in lebenden Systemen zu quantifizieren. Glücklicherweise gab es in den letzten zehn Jahren erhebliche Fortschritte bei der Rekonstitution des Septin-Zytoskeletts in einem zellfreien System, um die Mechanismen zu sezieren, die die Septin-Assemblierung bei hohen räumlichen und zeitlichen Auflösungen steuern. Die Kernschritte der Septin-Assemblierung umfassen die Septin-Heterooligomer-Assoziation und Dissoziation mit der Membran, die Polymerisation in Filamente und die Bildung von Strukturen höherer Ordnung durch Wechselwirkungen zwischen Filamenten. Hier stellen wir drei Methoden vor, um die Septinmontage in verschiedenen Kontexten zu beobachten: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen. Diese Methoden können verwendet werden, um die biophysikalischen Parameter von Septinen in verschiedenen Stadien der Montage zu bestimmen: als einzelne Oktamere, die die Membran binden, als Filamente und als Anordnungen von Filamenten. Wir verwenden diese Parameter gepaart mit Messungen der Krümmungsprobenahme und der bevorzugten Adsorption, um zu verstehen, wie die Krümmungsmessung auf einer Vielzahl von Längen- und Zeitskalen funktioniert.

Einleitung

Die Formen der Zellen und viele ihrer inneren Kompartimente hängen von den Lipidmembranen ab, die sie umgeben. Membranen sind viskoelastische Strukturen, die durch Wechselwirkungen mit Proteinen, Lipidsortierung und wirkende innere und äußere Kräfte verformt werden können, um eine Vielzahl von Formen^{zu erzeugen} 1,2,3,4. Diese Formen werden oft in Form von Membrankrümmung beschrieben. Zellen verwenden eine Vielzahl von Proteinen, die in der Lage sind, sich bevorzugt auf bestimmte Membrankrümmungen zu setzen oder diese zu "erfassen", um eine d....

Protokoll

HINWEIS: Die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten erfordert die Herstellung von monodispersen kleinen unilamellären Vesikeln (SUVs). Bitte beachten Sie ein bereits veröffentlichtes Protokoll²⁴ zur SUV-Formation. Kurz gesagt, alle SUVs werden durch Sondenbeschallung für insgesamt 12 min bei 70% Amplitude über 4 min Beschallungsperioden gebildet, gefolgt von 2 min Ruhezeiten in Eiswasser. SUV-Lösungen müssen gut geklärt und monodispers sein. Größenverteilungen von SUVs können beispielsweise durch dynamische Lichtstreuung²⁵ gemessen werden.

1. Planare Lipiddoppelschichten....

Ergebnisse

Nach der Herstellung jedes SLB können Septine oder das interessierende Protein mit der gewünschten Unterstützung inkubiert und mittels TIRFM, konfokaler Mikroskopie oder REM abgebildet werden. Die hier gezeigten Ergebnisse verwenden Septine, die rekombinant exprimiert und gereinigt aus E. coli^{17 hergestellt werden}. Mit TIRFM auf planaren SLBs ist es möglich, die Länge von Filamenten und ihre Flexibilität zu bestimmen, die Diffusionskoeffizienten zu messen und die Montage über die Z.......

Diskussion

Zellmembranen nehmen viele verschiedene Formen, Krümmungen und physikalisch-chemische Eigenschaften an. Um die nanometergroße Maschinerie zu untersuchen, durch die Zellen mikrometergroße Baugruppen aufbauen, ist es notwendig, minimale Rekonstitutionssysteme der Membranmimetik zu entwerfen. Dieses Protokoll stellt Techniken vor, die sowohl die Membrankrümmung als auch die Zusammensetzung präzise steuern und es dem Benutzer ermöglichen, quantitative Fluoreszenzmessungen mit weit verbreiteten Mikroskopietechniken durc.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural	Watson	137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubes	USA Scientific	1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslips	Thermo Scientific	152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375
Egg Liss Rhodamine PE	Avanti Polar Lipids	810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade	VWR	16220
EMS Sodium Cacodylate Buffer	VWR	11652
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-223EA
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191
Magnesium chloride	VWR	7791-18-6
Methyl cellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
Microglass coverslips for planar bilayers	Matsunami	Discontinued	22x22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica Microspheres	Bangs Laboratories, Inc.	Depends on size: SS0200*-SS0500*	Silica in aqueous suspension
Optical Adhesive	Norland Thorlabs	NOA 68	Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxide	Millipore Sigma	20816-12-0
Parafilm	VWR	52858-000
Plasma Cleaner	Plasma Etch	PE-25	Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chloride	VWR	0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm	VWR	64-0712
Sonicator bath	Branson	1510R-MT	Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PI	Avanti Polar Lipids	840044
Tabletop centrifuge	Eppendorf	22331
UV Lamp	Spectroline	ENF-260C	115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter Paper	VWR	28455-030	42.5 mm diameter, Grade GF/C