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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die zellfreie Rekonstitution war ein Schlüsselwerkzeug, um die Zytoskelett-Montage zu verstehen, und die Arbeit in den letzten zehn Jahren hat Ansätze zur Untersuchung der Septindynamik in minimalen Systemen etabliert. Hier werden drei komplementäre Methoden zur Beobachtung der Septinmontage in verschiedenen Membrankontexten vorgestellt: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen.

Zusammenfassung

Die meisten Zellen können ihre Form wahrnehmen und verändern, um grundlegende Zellprozesse durchzuführen. Bei vielen Eukaryoten ist das Septin-Zytoskelett ein integraler Bestandteil bei der Koordination von Formveränderungen wie Zytokinese, polarisiertem Wachstum und Migration. Septine sind filamentbildende Proteine, die sich zu verschiedenen Strukturen höherer Ordnung zusammensetzen und in vielen Fällen in verschiedenen Bereichen der Plasmamembran vorkommen, insbesondere in Regionen mit positiver Krümmung im Mikrometerbereich. Die Überwachung des Prozesses der Septinmontage in vivo wird durch die Einschränkungen der Lichtmikroskopie in Zellen sowie durch die Komplexität der Wechselwirkungen mit Membranen und Zytoskelettelementen behindert, was es schwierig macht, die Septindynamik in lebenden Systemen zu quantifizieren. Glücklicherweise gab es in den letzten zehn Jahren erhebliche Fortschritte bei der Rekonstitution des Septin-Zytoskeletts in einem zellfreien System, um die Mechanismen zu sezieren, die die Septin-Assemblierung bei hohen räumlichen und zeitlichen Auflösungen steuern. Die Kernschritte der Septin-Assemblierung umfassen die Septin-Heterooligomer-Assoziation und Dissoziation mit der Membran, die Polymerisation in Filamente und die Bildung von Strukturen höherer Ordnung durch Wechselwirkungen zwischen Filamenten. Hier stellen wir drei Methoden vor, um die Septinmontage in verschiedenen Kontexten zu beobachten: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen. Diese Methoden können verwendet werden, um die biophysikalischen Parameter von Septinen in verschiedenen Stadien der Montage zu bestimmen: als einzelne Oktamere, die die Membran binden, als Filamente und als Anordnungen von Filamenten. Wir verwenden diese Parameter gepaart mit Messungen der Krümmungsprobenahme und der bevorzugten Adsorption, um zu verstehen, wie die Krümmungsmessung auf einer Vielzahl von Längen- und Zeitskalen funktioniert.

Einleitung

Die Formen der Zellen und viele ihrer inneren Kompartimente hängen von den Lipidmembranen ab, die sie umgeben. Membranen sind viskoelastische Strukturen, die durch Wechselwirkungen mit Proteinen, Lipidsortierung und wirkende innere und äußere Kräfte verformt werden können, um eine Vielzahl von Formenzu erzeugen 1,2,3,4. Diese Formen werden oft in Form von Membrankrümmung beschrieben. Zellen verwenden eine Vielzahl von Proteinen, die in der Lage sind, sich bevorzugt auf bestimmte Membrankrümmungen zu setzen oder diese zu "erfassen", um eine definierte räumlich-zeitliche Kontrolle über Prozesse wie Zellverkehr, Zytokinese und Migration sicherzustellen 5,6. Die Dynamik der Zellmaschinerie an der Membran ist aufgrund der Schwierigkeit, Zeit und räumliche Auflösung mit der Zellgesundheit in Einklang zu bringen, besonders schwer zu beobachten. Während Super-Resolution-Techniken eine detaillierte Ansicht solcher Strukturen bieten können, erfordern sie langwierige Akquisitionen, die für die meisten Maschinen nicht für die Zeitskalen der Montage / Demontage zugänglich sind. Darüber hinaus machen die molekulare Komplexität dieser Baugruppen in ihrer nativen Umgebung und die Vielzahl der Rollen, die eine einzelne Komponente spielen kann, minimale Rekonstitutionssysteme zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung der Funktionsfähigkeit von Molekülen.

Minimale Membranmimetika wurden entwickelt, um Membraneigenschaften und Protein-Membran-Interaktionen außerhalb der Zelle zu untersuchen. Die Membranmimetik variiert von freistehenden Lipiddoppelschichten wie Liposomen oder riesigen unilamellären Vesikeln bis hin zu unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs) 7,8,9,10. SLBs sind biomimetische Membranen, die auf dem darunter liegenden Träger verankert sind und typischerweise aus Glas, Glimmer oder Kieselsäure11,12 bestehen. Eine Vielzahl von Geometrien kann verwendet werden, einschließlich planarer Oberflächen, Kugeln, Stäbchen und sogar wellenförmiger oder mikrostrukturierter Substrate, um Protein-Membran-Wechselwirkungen auf konkaven und konvexen Krümmungen gleichzeitig zu untersuchen1 3,14,15,16,17,18 . Die Bilayer-Bildung beginnt mit der Adsorption von Vesikeln auf eine hydrophile Oberfläche, gefolgt von Fusion und Bruch zu einer kontinuierlichen Doppelschicht (Abbildung 1)19. Unterstützte Doppelschichten sind besonders licht- und elektronenmikroskopisch zugänglich und bieten sowohl eine bessere zeitliche als auch eine bessere räumliche Auflösung, als dies in Zellen oft möglich ist. Gekrümmte SLBs bieten insbesondere ein attraktives Mittel, um die Proteinkrümmungsempfindlichkeit ohne signifikante Membranverformung zu untersuchen, so dass zwischen Krümmungsmessung und Krümmungsinduktion unterschieden werden kann, die in freistehenden Systemen oft unmöglich zu trennen sind.

Septine sind eine Klasse von filamentbildenden zytoskelettalen Proteinen, die für ihre Fähigkeit bekannt sind, sich auf positiv gekrümmten Membranen zu sammeln 6,18,20. Im Laufe des Zellzyklus in Hefe lagern sich Septine zu einem Ring zusammen und müssen sich neu anordnen, um die Sanduhr- und Doppelringstrukturen zu bilden, die mit der Knospenentstehung bzw. Zytokinese verbunden sind21. Während schöne Arbeiten mit Platin-Replikatelektronenmikroskopie durchgeführt wurden, um die Septinarchitektur in verschiedenen Zellzyklusstadien22 zu beobachten, ist die Beobachtung der Septin-Montage im Laufe der Zeit mit Lichtmikroskopie in Hefe auf eine begrenzte räumliche Auflösung gestoßen. Frühere Arbeiten an Septinen unter Verwendung von Lipidmonoschichten, die durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sichtbar gemacht wurden, konnten mehrere interessante Septinstrukturen wie Ringe, Bündel und Gazerekonstruieren 23. Im Gegensatz zur Fluoreszenzmikroskopie sind EM-Techniken jedoch ebenfalls in ihrer zeitlichen Auflösung begrenzt. Um die kinetischen Parameter des Multiskalenprozesses der Septin-Montage besser zu lösen, haben wir uns der unterstützten Membranmimetik zugewandt, bei der die Membrangeometrie, die Probenbedingungen und die Bildgebungsmodalität sorgfältig kontrolliert werden können.

Die hier beschriebenen Protokolle verwenden planare oder gekrümmte SLBs, gereinigtes Protein und eine Kombination von Mikroskopietechniken. Die quantitative Fluoreszenzkonfokalmikroskopie und die totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) wurden verwendet, um sowohl die Bindung von Massenproteinen an verschiedene Membrankrümmungen als auch die Bindungskinetik einzelner Moleküle zu messen. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll angepasst, um mit der Rasterelektronenmikroskopie (REM) verwendet zu werden, um die Proteinultrastruktur auf verschiedenen Membrankrümmungen zu untersuchen. Während der Fokus dieser Protokolle auf dem Septin-Zytoskelett liegt, können die Protokolle leicht modifiziert werden, um die Krümmungsempfindlichkeit jedes Proteins zu untersuchen, das der Leser interessant findet. Darüber hinaus können diejenigen, die in Bereichen wie Endozytose oder vesikulärem Verkehr arbeiten, diese Techniken nützlich finden, um die krümmungsabhängigen Anordnungen von Multiproteinkomplexen zu untersuchen.

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Protokoll

HINWEIS: Die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten erfordert die Herstellung von monodispersen kleinen unilamellären Vesikeln (SUVs). Bitte beachten Sie ein bereits veröffentlichtes Protokoll24 zur SUV-Formation. Kurz gesagt, alle SUVs werden durch Sondenbeschallung für insgesamt 12 min bei 70% Amplitude über 4 min Beschallungsperioden gebildet, gefolgt von 2 min Ruhezeiten in Eiswasser. SUV-Lösungen müssen gut geklärt und monodispers sein. Größenverteilungen von SUVs können beispielsweise durch dynamische Lichtstreuung25 gemessen werden.

1. Planare Lipiddoppelschichten

  1. Plasmareinigung der Objektträger
    HINWEIS: Die Plasmareinigung entfernt organische Verunreinigungen und erhöht die Hydrophilie des Glases, wodurch eine effiziente Lipidadsorption gewährleistet wird. Die folgenden Schritte können sich je nach verwendetem Plasmareiniger und Glasdeckgläsern ändern oder müssen optimiert werden.
    1. Spülen Sie den Plasmareiniger für 5 Minuten mit Sauerstoff, um Luft aus den Leitungen und der Kammer zu entfernen. Dies soll sicherstellen, dass sich beim Betrieb des Plasmareinigers hauptsächlich Sauerstoff in den Leitungen und der Kammer befindet, was zu konsistenteren Doppelschichtpräparaten führt.
    2. Streamen Sie während der Spülung ein Inertgas wieN2 oder Ar über die Mikroabdeckglasobjektträger, um Staub und Partikel zu entfernen.
      OPTIONAL: Deckglasobjektträger können gewaschen werden, indem jede Seite mit 100% Isopropanol gefolgt von Wasser besprüht wird. Wiederholen Sie die Isopropanol-Wasserwäsche 3x und trocknen Sie dann mit einem N2-Strom .
    3. Ordnen Sie trockene Glasschieber in eine Keramikhalterung ein. Platzieren Sie die Wiege auf der Rückseite der Plasmakammer, so dass die Deckgläser parallel zur langen Kante der Kammer verlaufen (dies hält sie während der Plasmareinigung an Ort und Stelle). Betreiben Sie den Plasmareiniger 15 Minuten lang mit Sauerstoff bei maximaler Leistung.
  2. Kammervorbereitung
    HINWEIS: Das hier beschriebene Verfahren verwendet hausgemachte Kammern aus Kunststoff-PCR-Röhrchen, um die Reaktionsvolumina zu unterstützen, aber auch andere Materialien mit geringer Haftung, wie Silikonvertiefungen, können geeignet sein.
    1. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge oder einer Schere die Kappe direkt unter dem mattierten Teil eines 0,2 ml PCR-Röhrchens ab (Abbildung 2).
    2. Lackieren Sie den Rand der PCR-Tube mit UV-aktiviertem Klebstoff und vermeiden Sie das Innere der Röhre. Legen Sie den PCR-Tubus vorsichtig in die Mitte eines plasmagereinigten Deckglases.
      HINWEIS: Um Klebstoff in der Kammer zu vermeiden, verwenden Sie die minimale Menge an Klebstoff, um eine Dichtung zu erhalten, und behandeln Sie sofort mit UV, ohne die Kammer zu stoßen oder zu stören.
    3. Stellen Sie die Kammer für 5-7 Minuten unter langwelliges UV-Licht, um den Klebstoff auszuhärten.
  3. Bilayer-Bildung
    HINWEIS: Monodisperse SUVs sollten in diesem Schritt für eine effiziente Doppelschichtbildung verwendet werden. Tabelle 1 enthält Rezepte für alle Puffer, die bei der Doppelschichtbildung verwendet werden, einschließlich der Bestands- und Endpufferkonzentrationen.
    1. 40 μL unterstützter Lipiddoppelschichtpuffer (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl2; Tabelle 1), 10 μL von 5 mM SUVs und 1 μL von 100 mM CaCl 2 zum Brunnen. Schütteln Sie die Kammern vorsichtig von einer Seite zur anderen, um die SUVs zu stören, und inkubieren Sie dann bei 37 ° C für 20 Minuten.
      HINWEIS: Um die Verdunstung zu begrenzen, inkubieren Sie in einer abgedeckten Petrischale mit einem Feuchttuch.
  4. Überschüssige Lipide wegwaschen
    HINWEIS: Dieser Schritt entfernt überschüssige SUVs und fungiert als Pufferaustauschschritt. Es ist sehr wichtig, den Doppeldecker beim Waschen nicht mit der Pipettenspitze zu kratzen; Wenn das Glas freigelegt wird, binden Septine und viele andere Proteine irreversibel und reduzieren die effektive Proteinkonzentration.
    1. Nach der Inkubation spülen Sie die Doppelschicht 6x mit 150 μL SLBB ab, pipettieren Sie sie auf und ab, um sie jedes Mal zu mischen und Blasen zu vermeiden.
      HINWEIS: Fügen Sie 150 μL direkt zu den 50 μL Puffer und SUVs hinzu, die bereits für insgesamt 200 μL in der Reaktionsbohrung vorhanden sind.
    2. Wenn Sie bereit sind, mit der Inkubation mit den Septinen oder einem anderen Protein Ihrer Wahl zu beginnen, waschen Sie die Doppelschicht 6x mit 150 μL Reaktionspuffer (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg / ml BSA, 0,14% Methylcellulose, 1 mM BME).
      HINWEIS: Für beste Ergebnisse machen Sie den Reaktionspuffer frisch und seien Sie sehr vorsichtig, während Sie die Reaktion gut mischen, um Blasen zu vermeiden.
    3. Entfernen Sie im letzten Waschschritt 125 μL Reaktionspuffer, so dass 75 μL im Bohrloch verbleiben. 25 μL in Septin-Speicherpuffer verdünnte Septine (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME) in der gewünschten Konzentration und Bild mittels TIRF-Mikroskopie26 hinzufügen.
      HINWEIS: Wenn Sie diesen Assay zum ersten Mal einrichten oder eine neue Lipidzusammensetzung integrieren, ist es eine gute Praxis, sicherzustellen, dass Lipide frei auf der Oberfläche diffundieren, indem Sie die Fluoreszenzrückgewinnung nach dem Photobleichen (FRAP) verwenden. Während die Erholungsrate für verschiedene Lipidzusammensetzungen unterschiedlich und von Natur aus niedriger ist als bei freistehenden Systemen, sollten die Lipide nicht unbeweglich sein.

Unterstützter Lipid-Bilayer-Puffer (SLBB)
LagerVolumenEndkonzentration
2 Mio. kTl.1,5 ml300 mM
1 Mio. HEPES200 μL20 mM
500 mM MgCl2 20 μL1 mM
Wasser8 ml
Vorreaktionspuffer (PRB)
LagerVolumenEndkonzentration
2 Mio. kTl.166 μL33,3 mM
1 Mio. HEPES500 μL50 mM
Wasser9,33 ml
Reaktionspuffer
LagerVolumenEndkonzentration
2 Mio. kTl.166 μL33,3 mM
1 Mio. HEPES300 μL50 mM
10 mg/ml BSA1,39 ml1,39 mg/ml
1% Methylcellulose1,39 ml0.0014
WasserBis zu 10 ml
Bme0,7 μL1 mM
Septin-Speicherpuffer (SSB)
LagerVolumenEndkonzentration
2 Mio. kTl.1,5 ml300 mM
1 Mio. HEPES500 μL50 mM
WasserBis zu 10 ml
Bme0,7 μL1 mM

Tabelle 1: Pufferkomponenten zur Herstellung von unterstützten Lipiddoppelschichten und Reaktionen. Es werden Mengen an Lagerlösungen, die in Puffer eingearbeitet werden, und die Endkonzentrationen jeder Komponente angezeigt. SLB und PRB können bei Raumtemperatur gelagert und zwischen den Experimenten wiederverwendet werden. Reaktionspuffer und SSB werden für jedes Experiment frisch hergestellt.

2. Kugelförmig unterstützte Lipiddoppelschichten

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet Kieselsäure-Mikrosphären, die in Reinstwasser mit einer Dichte von 10% suspendiert sind. Für jede Arbeit an den kinetischen Parametern der Proteinassemblierung ist es wichtig, die gesamte Membranoberfläche zwischen Experimenten und Krümmungen streng zu kontrollieren. Tabelle 2 zeigt die korrigierten Volumina von Perlen und Puffern, um 5 mm2 der gesamten Membranoberfläche aufrechtzuerhalten. Dieses Protokoll erweitert eine zuvor veröffentlichte Methode 8,18.

  1. Bilayer-Bildung
    HINWEIS: Bei planaren Doppelschichten ist es wichtig, hochwertige SUVs für eine robuste Doppelschichtbildung zu haben. Tabelle 2 listet das Volumen der Perlen aus einer Lösung mit einer Dichte von 10 % und ihre jeweiligen SLBB-Volumina auf, die verwendet werden, um eine endgültige Oberfläche von 5 mm 2 für eine Reihe von Perlendurchmessern zu erhalten.
    1. Kieselsäure-Mikrosphären (auch als Perlen bezeichnet) neigen dazu, sich abzusetzen und zu verklumpen; Um die Perlen zu mischen und alle Cluster aufzubrechen, wirbeln Sie die Flasche für 15 s auf, dann badbeschallen Sie für 1 min und wirbeln Sie erneut für 15 s.
    2. Mischen Sie das entsprechende Volumen der Perlen (Tabelle 2) mit dem entsprechenden Volumen von SLBB und 10 μL von 5 mM SUVs in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Adhäsion.
    3. Schaukeln Sie das Perlen-Lipid-Gemisch Ende über Ende für 1 h bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass diese Inkubation auf einem Rotator durchgeführt wird, um eine Sedimentation zu verhindern.
  2. Kammern auf PEGylierten Deckgläsern vorbereiten
    HINWEIS: Bei planaren Doppelschichten werden hausgemachte Kammern aus Kunststoff-PCR-Röhrchen verwendet, um die Reaktionsvolumina zu unterstützen, aber andere Materialien mit geringer Haftung, wie Silikonvertiefungen, können genauso gut funktionieren.
    1. Während die Perlen schaukeln, tauen Sie einen PEGylierten Deckglas bei Raumtemperatur auf. Schneiden Sie ein 0,2 ml PCR-Röhrchen ab und kleben Sie es wie in Schritt 1.2 beschrieben auf das Deckglas. Für 24 mm x 50 mm Schlitten können bis zu 10 Kammern auf einem Schlitten untergebracht werden.
      HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet 24 mm x 50 mm PEGylierte Glasabdeckungen, die im Voraus vorbereitet werden. Kurz gesagt, Glasdeckgläser werden gründlich durch Beschallung in Aceton, Methanol und 3 M KOH gereinigt. Deckgläser werden dann mit n-2-aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilan funktionalisiert und kovalent an mPEG-Succinimidylvalerat gebunden. Fertige PEGylierte Deckgläser werden vakuumversiegelt bei −80 °C gelagert. Für ein ähnliches Passivierungsprotokoll lesen Sie bitte die Arbeit von Gidi et al.27. Während hier PEGylierte Glasabdeckungen vorgeschlagen werden, können andere Passivierungsmethoden, wie BSA- oder Poly-L-Lysin-Methoden, wirksam sein.
  3. Überschüssige Lipide wegwaschen
    HINWEIS: Dieser Schritt dient dazu, überschüssige SUVs zu entfernen und einen Pufferaustausch durchzuführen. Die Perlen werden insgesamt 4x mit Vorreaktionspuffer gewaschen (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). Tabelle 3 listet die Spingeschwindigkeiten in RCF für einen Bereich von Wulstdurchmessern auf.
    1. Spin Beads am dafür vorgesehenen RCF für 30 s (Tabelle 3). Wenn Sie mehrere Perlengrößen verwenden, lassen Sie die Perlen schaukeln, bis es Zeit zum Waschen ist.
      HINWEIS: Es lohnt sich nicht, größere Perlen im gleichen Spin wie kleinere Perlen mit der kleineren Perlensedimentationsgeschwindigkeit zu sedimentieren, um Zeit zu sparen. Dies kann dazu führen, dass Perlen aneinander haften bleiben und die Integrität der Doppelschicht beeinträchtigen.
    2. Nach dem ersten Spin 50 μL Überstand entfernen und 200 μL PRB hinzufügen. Nach dem zweiten und dritten Spin 200 μL entfernen und 200 μL PRB hinzufügen. Nach dem vierten Spin 200 μL entfernen und 220 μL PRB hinzufügen. Pipette kräftig für jede Wäsche.
      HINWEIS: Das endgültige Aufhängungsvolumen unterscheidet sich von den Wäschen. Wirbeln Sie die Perlen nach der Inkubation nicht mit den Lipiden, da dies Lücken in den Doppelschichten hinterlassen kann. Um eine Sedimentation zu vermeiden, während Sie mit den anderen Perlengrößen arbeiten oder andere Teile des Assays einrichten, legen Sie die Perlenmischungen wieder auf den End-über-Ende-Rotator.
  4. Vorbereitung der Reaktion
    HINWEIS: Diese Reaktion wurde entwickelt, um die gesamte Membranoberfläche der Reaktion bei 5 mm2 zu erhalten und eine endgültige Reaktionsbedingung von 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/mL BSA, 0,1% Methylcellulose und 1 mM BME zu erzeugen.
    1. Wenn Sie einen Wettbewerbsassay mit mehreren Perlengrößen durchführen, machen Sie eine 1: 1-Mischung, indem Sie gleiche Volumina jeder Perlengröße miteinander mischen. Mischen Sie dann 29 μL der gewünschten Perlenmischung (oder einer einzelnen Perle) mit 721 μL RXN-Puffer.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Perlen bei jedem Schritt gründlich mit einer Pipette zu mischen, um dichte Bündel von Perlen zu vermeiden. Dies führt zu einer gleichmäßigeren Perlenverteilung und einer genauen Gesamtoberfläche.
    2. Mischen Sie 75 μL verdünnte Perlen und 25 μL in SSB verdünntes Protein zu den Vertiefungen.
      HINWEIS: Die Autoren stellen typischerweise Hefeseptinkomplexe bei 1-50 nM dar.
    3. Wenn Sie Septine in einem stationären Zustand messen, inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 h und nehmen Sie dann entweder eine nahezu TIRF- oder konfokale Mikroskopie auf.
Perlendurchmesser (μm)Volumen der gut gemischten Perlen (μL)Volumen des SLB-Puffers (μL)Volumen der SUVs (μL)
6.468.9461.110
5.0676310
3.174.3965.610
0.961.3368.710
0.540.7569.310
0.310.4369.610

Tabelle 2: Normalisierte Volumina von Mikrosphären. Um eine gleiche Oberfläche jeder Perlengröße beizubehalten und die gesamte Membranoberfläche zwischen den Experimenten konsistent zu halten, wurden Volumina für jede Perlengröße und jeden Puffer, der die Gesamtoberfläche normalisierte, berechnet.

Perlendurchmesser (μm)Sedimentationsgeschwindigkeit (RCF)
0.314.5
0.544.5
0.962.3
3.170.8
5.060.3

Tabelle 3: Sedimentationsgeschwindigkeiten für Mikrosphären unterschiedlicher Durchmesser. Für jeden Perlendurchmesser wurden die gezeigten minimalen Sedimentationsgeschwindigkeiten verwendet, um die Perlen zu pelletieren, um ungebundene Liposomen wegzuwaschen.

3. Stäbchengestützte Lipiddoppelschichten

HINWEIS: Im Gegensatz zu den anderen hier vorgestellten Assays erlaubt der Stabassay keine sorgfältige Kontrolle der gesamten Membranoberfläche. Man kann in Mengen und Volumina zwischen den Experimenten konsistent sein, aber da dies zu Stäben unterschiedlicher Länge und Durchmesser führt, ist es schwierig, die gesamte Membranoberfläche in der Reaktion zu extrapolieren. Obwohl dies ein ausgezeichneter Assay für die Erforschung der Krümmungsmessung mit mehreren Krümmungen auf einer einzigen Oberfläche ist und für die Erforschung der Septin-Ultrastruktur nützlich war, wird er für kinetische Messungen nicht empfohlen. Diese Methode wurde zuvor18 berichtet und wird hier erweitert.

  1. Gewinnung von Borosilikatstäben aus Glasmikrofaserfiltern
    1. Reißen Sie einen einzelnen GF/C-Glasmikrofaserfilter der Klasse 42,5 mm in kleine Stücke und legen Sie sie in ein 100-ml-Becherglas mit 60 ml 100% Ethanol. Bad-Ultraschall, bis die Lösung undurchsichtig wird; Dies kann mit einem fein zerkleinerten Filter nur 20-30 Minuten dauern.
      HINWEIS: Beschallen Sie gründlich, um große Brocken aufzubrechen; Je dissoziierter/undurchsichtiger, desto besser.
    2. Decken Sie die Lösung mit Folie ab und lagern Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur.
  2. Bilden von Doppelschichten an den Stäben
    HINWEIS: Dieser Schritt wird mit überschüssigen Lipiden durchgeführt, um eine vollständige Stäbchenabdeckung zu erreichen, da es unmöglich ist, die Gesamtoberfläche bei dieser Methode zu quantifizieren.
    1. Am nächsten Tag wird die Ethanollösung abgesetzt (Schritt 3.1.2.), also vor der Verwendung gut mischen. Kombinieren Sie 10 μL Stablösung und 70 μL SLBB.
    2. In einer Minizentrifuge 30 s mit Höchstgeschwindigkeit drehen und 50 μL des Überstands entfernen. Suspendieren Sie weitere 50 μL SLBB und wiederholen Sie den Spin für insgesamt vier Wäschen, um das Ethanol zu verdünnen.
      HINWEIS: Stabstützen bilden kein festes Pellet am Boden des Rohres. Sie werden stattdessen entlang der Seite der Röhre verschmiert; Dies macht es schwierig, sie beim Waschen vollständig zu konservieren. Da die Gesamtoberfläche in diesem Assay nicht kontrolliert wird, ist es in Ordnung, wenn sie gestört sind.
    3. Kombinieren Sie 10 μL gut gemischte Stablösung mit 50 μL 5 mM SUVs und 20 μL SLBB. Inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur und drehen Sie Ende-über-Ende wie bei der Bildung von Doppelschichten auf den Mikrokügelchen.
  3. Überschüssige Lipide wegwaschen
    1. Ähnlich wie in Schritt 3.2.2. wird die Lipidstablösung mit Höchstgeschwindigkeit in einer Minizentrifuge für 30 s geschleudert, um die membranbeschichteten Stäbchen aus der Lösung zu pelletieren.
    2. Nach dem ersten Spin 50 μL des Überstands entfernen und 200 μL PRB hinzufügen. Nach dem zweiten und dritten Spin 200 μL entfernen und 200 μL PRB hinzufügen. Nach dem vierten Spin 200 μL entfernen, 220 μL PRB hinzufügen und kräftig pipettieren, um zu mischen.
  4. Vorbereitung der Reaktion
    1. Mischen Sie in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen 721 μL Reaktionspuffer mit 29 μL Stablösung. Gut mischen.
    2. Kombinieren Sie in einem 0,2 ml PCR-Röhrchen 75 μL Stäbchen im Reaktionspuffer und 25 μL Septine in der gewünschten Konzentration, verdünnt in SSB. Lassen Sie es bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde inkubieren.
  5. Vorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie
    1. Nach der Inkubation das 100 μL Septin-Stab-Gemisch auf ein rundes, PEG-beschichtetes 12 mm Deckglas geben und bei Raumtemperatur 1 h in einer geschlossenen Petrischale inkubieren.
    2. Fixieren Sie die Probe, indem Sie den Boden der Petrischale (10 ml sollten ausreichen) mit 2,5% Glutaraldehyd in 0,05 M Natriumcacodylat (NaCo), pH 7,4, für 30 min füllen. Saugen Sie die Flüssigkeit mit einer Glaspipette ab. Waschen Sie die Probe, indem Sie sie mit 10 ml 0,05 m NaCo für 5 min inkubieren und für insgesamt zwei Wäschen wiederholen.
    3. Postfix in 0,5% OsO4 Cacodylatpuffer für 30 min, und dann waschen Sie 3x in 0,05 M NaCo (5 min/Waschen).
    4. Die Probe 15 min lang mit 1% Gerbsäure inkubieren und dann in NaCo 3x waschen. 15 min in 0,5% OsO 4 inkubieren und 3x mit NaCo waschen.
    5. Dehydrieren Sie die Proben mit steigenden Ethanolkonzentrationen: 30% EtOH für 5 min, 2x; 50% EtOH für 5 min; 75% EtOH für 5 min; und 100% EtOH für 5 min, 2x. Folgen Sie mit einer weiteren 10-minütigen Inkubation.
    6. In Übergangsflüssigkeit (Hexamethyldisilazan) 3x (5 min, 10 min, dann 5 min) inkubieren.
    7. An der Luft trocknen lassen und dann die Proben bis zur Sputterbeschichtung in einen Exsikkator legen. Sputtern Sie die 4-nm-Schicht mit einer Gold/Palladium-Legierung und bilden Sie sie dann auf einem Rasterelektronenmikroskop ab.

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Ergebnisse

Nach der Herstellung jedes SLB können Septine oder das interessierende Protein mit der gewünschten Unterstützung inkubiert und mittels TIRFM, konfokaler Mikroskopie oder REM abgebildet werden. Die hier gezeigten Ergebnisse verwenden Septine, die rekombinant exprimiert und gereinigt aus E. coli17 hergestellt werden. Mit TIRFM auf planaren SLBs ist es möglich, die Länge von Filamenten und ihre Flexibilität zu bestimmen, die Diffusionskoeffizienten zu messen und die Montage über die Z...

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Diskussion

Zellmembranen nehmen viele verschiedene Formen, Krümmungen und physikalisch-chemische Eigenschaften an. Um die nanometergroße Maschinerie zu untersuchen, durch die Zellen mikrometergroße Baugruppen aufbauen, ist es notwendig, minimale Rekonstitutionssysteme der Membranmimetik zu entwerfen. Dieses Protokoll stellt Techniken vor, die sowohl die Membrankrümmung als auch die Zusammensetzung präzise steuern und es dem Benutzer ermöglichen, quantitative Fluoreszenzmessungen mit weit verbreiteten Mikroskopietechniken durc...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health (NIH) Grant Nr. R01 GM-130934 und National Science Foundation (NSF) Grant MCB-2016022. B.N.C., E.J.D.V. und K.S.C. wurden zum Teil durch einen Zuschuss des National Institute of General Medical Sciences im Rahmen der Auszeichnung T32 GM119999 unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR Tubes with flat cap, NaturalWatson137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubesUSA Scientific1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME)Sigma-AldrichM6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslipsThermo Scientific152450Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPCAvanti Polar Lipids850375
Egg Liss Rhodamine PEAvanti Polar Lipids810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM GradeVWR16220
EMS Sodium Cacodylate BufferVWR11652
Ethanol, 200 proofFisher Scientific04-355-223EA
HEPESSigma AldrichH3375-1KG
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich440191
Magnesium chlorideVWR7791-18-6
Methyl cellulose 4000cpSigma-AldrichM052-100G
Microglass coverslips for planar bilayersMatsunamiDiscontinued22x22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica MicrospheresBangs Laboratories, Inc.Depends on size: SS0200*-SS0500*Silica in aqueous suspension
Optical AdhesiveNorland ThorlabsNOA 68Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxideMillipore Sigma20816-12-0
ParafilmVWR52858-000
Plasma CleanerPlasma EtchPE-25Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chlorideVWR0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm  VWR64-0712
Sonicator bathBranson1510R-MTBransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PIAvanti Polar Lipids840044
Tabletop centrifugeEppendorf22331
UV LampSpectrolineENF-260C115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter PaperVWR28455-03042.5 mm diameter, Grade GF/C

Referenzen

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