JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا جديدا لتطبيق القوة الميكانيكية مباشرة على نواة الخلية من خلال الميكروبيدات المغناطيسية التي يتم توصيلها إلى السيتوبلازم وإجراء تصوير فلوري متزامن للخلايا الحية.

Abstract

السؤال الأساسي في علم الأحياء الميكانيكي هو كيف تستشعر الخلايا الحية المحفزات الميكانيكية خارج الخلية في سياق فسيولوجيا الخلية وعلم الأمراض. يعتقد أن الإحساس الميكانيكي الخلوي للمنبهات الميكانيكية خارج الخلية يكون من خلال مستقبلات الغشاء ، ومركب البروتين المرتبط به ، والهيكل الخلوي. تظهر التطورات الحديثة في علم الأحياء الميكانيكي أن نواة الخلية في السيتوبلازم نفسها يمكنها أن تستشعر بشكل مستقل المحفزات الميكانيكية في وقت واحد. ومع ذلك ، هناك نقص في الفهم الميكانيكي لكيفية استشعار نواة الخلية للمحفزات الميكانيكية وتحويلها والاستجابة لها ، ويرجع ذلك أساسا إلى التحديات التقنية في الوصول إلى ميكانيكا النواة وقياسها بواسطة الأدوات التقليدية. تصف هذه الورقة تصميم وتصنيع وتنفيذ مشغل قوة مغناطيسية جديد يطبق محفزات ميكانيكية 3D دقيقة وغير جراحية لتشويه نواة الخلية مباشرة. باستخدام الخلايا المهندسة بتقنية كريسبر / كاس 9 ، توضح هذه الدراسة أن هذه الأداة ، جنبا إلى جنب مع التصوير الفلوري متحد البؤر عالي الدقة ، تمكن من الكشف عن ديناميكيات الوقت الفعلي لبروتين مرتبط ب نعم حساس ميكانيكيا (YAP) في الخلايا المفردة كدالة لتشوه النواة. هذه الطريقة البسيطة لديها القدرة على سد الفجوة التكنولوجية الحالية في مجتمع علم الأحياء الميكانيكي وتقديم إجابات لفجوة المعرفة الموجودة في العلاقة بين النقل الميكانيكي للنواة ووظيفة الخلية.

Introduction

تهدف هذه الدراسة إلى تطوير وتطبيق تقنية جديدة لتوضيح البيولوجيا الميكانيكية للنواة من خلال الجمع بين المشغلات المغناطيسية التي تطبق القوة الميكانيكية مباشرة على نواة الخلية والمجهر الفلوري متحد البؤر الذي يصور في وقت واحد التغيرات الهيكلية والوظيفية تحت الخلوية. تستشعر الخلايا الإشارات الفيزيائية الحيوية خارج الخلية بما في ذلك تصلب الأنسجة1،2،3،4 ، وضغط السائل الخلالي وإجهاد القص5،6،7 ، وطوبولوجيا / هندسة السطح8،9،10،11،12 ، وإجهاد التوتر / الضغط13،14 ، 15,16. يتم تحويل الإشارات الفيزيائية الحيوية إلى إشارات كيميائية حيوية وتؤدي إلى تغييرات محتملة في التعبير الجيني وسلوكيات الخلية - وهي عملية تعرف باسم النقل الميكانيكي 17،18،19،20،21،22،23،24،25،26،27 . لدراسة عمليات النقل الميكانيكي ، تم تطوير عدد لا يحصى من التقنيات لتطبيق القوة الميكانيكية على الخلايا ، مثل مجهر القوة الذرية28 ، وجهاز تمدد الخلية29 ، ومستشعر قوة MEMS الحيوي (الأنظمة الكهروميكانيكية الدقيقة)15،30،31 ، ريولوجيا القص 32 ، ونظام الرؤية الاستريو 33 . تلخص مراجعة حديثة مناهج تطبيق الإشارات الميكانيكية خارج الخلية والتدخل في الاستشعار الميكانيكي34. حتى الآن ، تطبق معظم هذه الطرق القوة على غشاء بلازما الخلية ، وتتلقى الخلايا مباشرة هذه الإشارات الفيزيائية الحيوية خارج الخلية عبر مستقبلات الغشاء مثل الأنتغرين والكادهيرين والقنوات الأيونية والمستقبلات المقترنة بالبروتين G. بعد ذلك ، ينقلون الإشارة إلى الهيكل الخلوي داخل الخلايا والنواة. على سبيل المثال ، باستخدام إزفاء البروتين المرتبط ب yes (YAP) كمؤشر على الاستشعار الميكانيكي ، تظهر الخلايا أنها تستشعر الإشارات الميكانيكية لتصلب الركيزة والتوتر خارج الخلية من غشاء الخلية وتنقلها عبر الهيكل الخلوي إلى النواة للحث على انتقال السيتوبلازم YAP إلى النواة28,35.

تشير الأدلة الحديثة إلى أن نواة الخلية نفسها عبارة عن مستشعر ميكانيكي مستقل8،36،37. وقد ثبت ذلك من خلال التجارب التي أجريت على النواة المعزولة التي تم حصادها من الخلايا ، حيث تم الكشف عن أن النوى تغير صلابتها بشكل تكيفي استجابة للقوة الميكانيكية المطبقة عليها مباشرة36. خلال العديد من الحالات الفسيولوجية ، تستشعر النوى في كل من الورم والخلايا السليمة الإشارات الفيزيائية الحيوية خارج الخلية وتغير خصائصها الميكانيكية وتجميعها38،39،40. على سبيل المثال ، عند التسرب ، ينخفض الصلابة النووية للخلايا السرطانية ويحافظ على ليونة لأكثر من 24 ساعة38. أثناء الهجرة عبر الفضاء الخلالي الضيق ، تفقد نوى الخلايا السرطانية بشكل متكرر وتستعيد سلامتها الهيكلية39. ومع ذلك ، فإن الطريقة التي تستشعر بها النواة الإشارة الفيزيائية الحيوية غير معروفة ، على الرغم من أنه تم العثور على العديد من بروتينات الغلاف النووي وعائلات البروتينات ، مثل Lamin A / C ورابط الهيكل النووي والهيكل الخلوي (LINC)المعقدة 38,41. ومن ثم ، فإن الطرق الجديدة غير الغازية التي يمكنها تطبيق القوة مباشرة على النواة ستفصل تأثير انتقال القوة من غشاء بلازما الخلية والهيكل الخلوي ، وستساعد في توضيح الآليات الجزيئية التي كان يتعذر الوصول إليها سابقا للاستشعار الميكانيكي النووي.

أظهرت الأبحاث التي استخدمت ملاقط بصرية لمعالجة العضيات42 والميكروبيدات المحقونة في الخلايا43 القدرة التكنولوجية على تطبيق القوة مباشرة على النواة. ومع ذلك ، فإن تقنية الملقط البصري لها العديد من القيود: (1) غالبا ما تتلاعب الملقط البصري منخفض الإنتاجية بخلية واحدة أو ميكروبيدات واحدة فقط في كل مرة. و (2) يتطلب التلف الضوئي المحتمل وتشوه القطع الأثرية في درجة الحرارة النووية عشرات pN36 ، وتبلغ طاقة الليزر اللازمة المقابلة حوالي 10 ميغاواط لكل pN44,45. شدة الليزر هذه كافية لإحداث تلف ضوئي في الخلايا واضطراب وظائف الخلية أثناء التجربة46.

تظهر القوة المغناطيسية المطبقة من خلال الميكروبيدات داخل الخلايا الحية إمكانية تطبيق القوة مباشرة على النواة وتتغلب على قيود الملقط البصري. بمجرد تسليم الميكروبيدات إلى السيتوبلازم ، يمكن للمجال المغناطيسي أن يمارس قوة مغناطيسية على ميكروبيدات متعددة في وقت واحد بطريقة عالية الإنتاجية. لا يؤثر المجال المغناطيسي على وظائف الخلية47 ، ولكنه يولد قوة من pN إلى nN ، وهو ما يكفي للحث على التشوه النووي36،48،49. حتى الآن ، تم تطبيق التلاعب بالميكروبيدات المغناطيسية على غشاء بلازما الخلية48 ، داخل السيتوبلازم50 ، على F-actin51 ، داخل النواة47 ، وعلى النواةالمعزولة 36. ومع ذلك ، لم يتم استخدام التلاعب المغناطيسي للميكروبيدات لتطبيق قوة ميكانيكية مباشرة على الغلاف النووي لدراسة النقل الميكانيكي في النواة.

في هذا البحث ، تم تطوير تقنية بسيطة لتوصيل الميكروبيدات المغناطيسية بشكل غير جراحي إلى السيتوبلازم واستخدام هذه الميكروبيدات لتطبيق القوة الميكانيكية على النواة (الشكل 1). هنا ، يتم استخدام خطوط خلايا B2B البشرية الطبيعية المصممة بواسطة CRISPR / Cas9 والتي تعبر داخليا عن mNeonGreen21-10 / 11 الموسومة YAP للتحقق من صحة الطريقة. YAP هو بروتين حساس للميكانيكا ، ويتم تنظيم نقل YAP بواسطة الاستشعار الميكانيكي النووي14,28. تم اختيار نهج الضربة القاضية المنظم بواسطة CRISPR / Cas9 لوضع علامة على YAP الداخلي ببروتين فلوري (FP) mNeonGreen21-10 / 11. على الرغم من أنه من المعروف أن تحرير كريسبر له كفاءة غير مكتملة وتأثير خارج الهدف ، إلا أن البروتوكولات في المنشورات السابقة دمجت الفرز الفلوري لتحديد إدراج إطار القراءة المفتوح الصحيح52،53،54. مع هذه الطبقة الإضافية من التحديد ، لم يلاحظ أي حدث وضع علامات خارج الهدف في 20+ خط خلية تم إنشاؤه مسبقا52،53،54،55. هذا هو بناء بروتين الفلورسنت المنقسم ، ولكن من حيث المبدأ ، يمكن أن تكون أي علامة فلورية قابلة للتعبير قابلة للاستخدام. يتفوق نهج وضع العلامات هذا على طرق التحوير أو الأجسام المضادة. أولا ، على عكس التعبير الجيني المعدل ، يحافظ البروتين الموسوم على جرعة جينية أحادية النسخة ويعبر في السياق الفسيولوجي للشبكة التنظيمية للجينات الأصلية ، مما يحد من الانحرافات في تركيز البروتين وتوطينه وتفاعله. تحقق طريقة وضع العلامات المستخدمة في هذه الدراسة إنتاجية وكفاءة أعلى من ترتيب الحجم مقارنة بوضع علامات FP الكاملة. كما أنه يتجنب التحديات المرتبطة بالتألق المناعي بسبب القطع الأثرية للتثبيت والتوافر المحدود للأجسام المضادة عالية الجودة وعالية النوعية. ثانيا ، النهج المستخدم في هذه الورقة يقلل من الاضطراب في فسيولوجيا الخلية ويتيح الكشف في الوقت الفعلي عن جميع YAPs الداخلية بشكل أصلي. في المقابل ، غالبا ما تؤدي طرق التحوير الشائعة الأخرى إلى الإفراط في التعبير عن YAP. يمكن أن يتسبب التوزيع الاصطناعي الناتج في السمية الخلوية ويؤثر على الاستشعار الميكانيكي للخلايا56،57،58.

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لتطبيق القوة مباشرة على النواة من خلال الميكروبيدات المغناطيسية التي يتم توصيلها إلى السيتوبلازم وإجراء تصوير فلوري متزامن للخلايا الحية. باختصار ، توضح البروتوكولات المعروضة هنا كيفية (1) توصيل الميكروبيدات المغناطيسية إلى الخلية أثناء وجودها خارج النواة ، (2) معالجة الميكروبيدات لتطبيق القوة المغناطيسية على النواة ، (3) إجراء تصوير فلوري متحد البؤر للخلايا أثناء التلاعب ، و (4) تحليل كمي لنسبة YAP النووية / السيتوبلازم (N / C) طوال عملية تطبيق القوة. تشير النتائج إلى أنه (1) من خلال الالتداخل الخلوي ، يمكن توصيل الميكروبيدات المغناطيسية بشكل غير جراحي إلى سيتوبلازم خلايا B2B في غضون 7 ساعات (الشكل 2 والشكل 3) ؛ و (2) يمكن للقوة المغناطيسية الكمية المطبقة مباشرة على النواة (الشكل 4 والشكل 5 والشكل 6) وحدها أن تؤدي إلى تغييرات متنوعة في نسبة YAP N / C في خلايا B2B المصممة بواسطة CRISPR / Cas9 (الشكل 7 والشكل 8).

Protocol

1. صيانة خلايا B2B المصممة هندسيا CRISPR / Cas9

  1. خلايا B2B في قارورة T25 مع RPMI-1640 تستكمل مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية و 1 ٪ البنسلين الستربتومايسين.
  2. الحفاظ على خلايا B2B في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  3. الاستزراع الفرعي لخلايا B2B عندما يصل التقاء 70٪ إلى 80٪.
  4. قم بتخزين خط الخلايا B2B في وسط استزراع RPMI-1640 مع 10٪ (v / v) DMSO في مجمد -80 درجة مئوية.
  5. استخدم خلايا B2B برقم مرور أقل من 10 في التجارب.

2. ثقافة الخلية

  1. بذر الخلايا على طبق بتري ذو قاع زجاجي.
    1. انقل القارورة التي تحتوي على خلايا B2B إلى الداخل من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية.
    2. قم بإزالة وسط الاستزراع في القارورة باستخدام ماصة شفط مع مضخة تفريغ متصلة.
    3. اغسل القارورة ب 2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    4. قم بإزالة PBS باستخدام ماصة الاستنشاق.
    5. أضف 0.5 مل من محلول التربسين 0.05٪ لفصل الخلايا من قاع ركيزة القارورة.
    6. ضع القارورة في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
    7. انقل القارورة إلى خزانة السلامة البيولوجية. أضف 5 مل من وسط الاستزراع الجديد إلى القارورة وماصة المحلول لأعلى ولأسفل.
    8. قم بإيداع 50 ميكرولتر من الوسط مع الخلايا (300 خلية / ميكرولتر) على طبق بتري ذو القاع الزجاجي. أضف 2 مل من وسط الاستزراع إلى طبق بتري.
    9. ضع طبق بتري في الحاضنة. انتظر لمدة 12 ساعة حتى يتم إرفاق الخلايا.
  2. زراعة الخلايا مع الميكروبيدات المغناطيسية.
    1. يزن 0.2 غرام من ميكروبيدات حديد الكربونيل ذات القطر المتوسط 7 ميكرومتر (يشار إليها فيما يلي باسم ميكروبيدات 7 ميكرومتر ، انظر جدول المواد).
    2. استخدم ماصة لتعليق الميكروبيدات في 1 مل من وسط الاستزراع RPMI-1640.
    3. خذ طبق بتري مع خلايا B2B إلى خزانة السلامة البيولوجية.
    4. أضف 200 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على ميكروبيدات إلى طبق بتري.
      ملاحظة: أضف الوسط بسرعة لتجنب ترسيب الميكروبيدات.
    5. ضع طبق بتري مرة أخرى في الحاضنة حتى يتم استيعاب الميكروبيدات بواسطة الخلايا. تحقق من الاستيعاب كل 6 ساعات لتحديد الوقت الأمثل لاستيعاب خطوط الخلايا المختلفة.
    6. للتحقق من الاستيعاب ، قم بإجراء تصوير مضان متحد البؤر لتصور حدود الميكروبيدات والنووية والخلية. إذا تم استيعاب الميكروبيدات بواسطة الخلية ، فستكون داخل حدود الخلية.

3. تصور النواة

  1. قم بتسخين 1.5 مل من وسط الثقافة في الحاضنة لمدة 15 دقيقة.
  2. أطفئ ضوء خزانة السلامة البيولوجية. خذ طبق بتري الذي يحتوي على الخلية ، ووسط الثقافة الدافئ ، والبقع النووية ، وفيراباميل حمض الهيدروكلوريك في خزانة السلامة البيولوجية.
    ملاحظة: مكونات التلوين النووي حساسة للضوء. تجنب التعرض للضوء أثناء التشغيل.
  3. تمييع 1000x بقعة نووية بواسطة DMSO إلى 100x.
  4. تمييع 100 مليمول فيراباميل حمض الهيدروكلوريك بواسطة DMSO إلى 10 ملليمتر.
  5. أضف 15 ميكرولتر من 100x صبغة نووية و 15 ميكرولتر من 10 mM فيراباميل هيدروكلورايد إلى 1.5 مل من وسط الثقافة. تخلط جيدا عن طريق سحب لأعلى ولأسفل.
  6. قم بإزالة وسط الثقافة من طبق بتري. أضف وسط الاستزراع الذي يحتوي على تلطيخ نووي في طبق بتري.
  7. ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لأكثر من 2 ساعة.

4. إعداد أجهزة تطبيق القوة المغناطيسية

  1. 3D طباعة جميع الأجزاء باستخدام أكريلونيتريل بوتادين ستايرين (ABS) وتجميعها وفقا لتصميم CAD (الشكل 1A). يتم تضمين تصميم CAD في جدول المواد.
  2. استخدم شريطا على الوجهين لتوصيل المغناطيس بجهاز تحريك المغناطيس (الشكل 1 أ).
  3. اضبط جهاز تحريك المغناطيس بجوار مرحلة المجهر. استخدم المقابض الثلاثة لضبط الموقع المكاني للمغناطيس حتى يتمكن من التحرك فوق طبق بتري بين 13 مم و 120 مم.
    ملاحظة: تأكد من أن الحد الأعلى للمسافة بين المغناطيس وطبق بتري كبير قدر الإمكان لتجنب تطبيق القوة غير المرغوب فيها على الميكروبيدات المغناطيسية. 120 مم هي القيمة القصوى في هذا الإعداد التجريبي. تأكد من أن المغناطيس لا يتداخل مع أجزاء المجهر ، بما في ذلك الأهداف والمراحل الآلية.
  4. اضبط المغناطيس على أعلى موضع z (عند 120 مم).

5. تطبيق القوة والتصوير بالخلايا الحية

  1. إعداد غرفة البيئة للتصوير طويل الأمد
    1. ضع محلول الإيثانول بنسبة 75٪ لتعقيم وتنظيف غرفة البيئة تماما.
    2. ضع غرفة البيئة على المرحلة الآلية من المجهر المقلوب.
    3. افتح خزان CO 2 واضبط معدل تدفق CO2 على 160 مل / دقيقة.
    4. اضبط درجة حرارة الغرفة على 44 درجة مئوية (أعلى) و 42 درجة مئوية (حمام) و 40 درجة مئوية (مرحلة).
    5. أضف 20 مل من الماء النقي إلى حمام غرفة البيئة للحفاظ على رطوبة 90٪.
    6. أخرج طبق بتري ذو القاع الزجاجي الذي يحتوي على خلايا مستهدفة من حاضنة زراعة الأنسجة وضعه في الغرفة.
    7. ضع المشبك المعدني لغرفة البيئة لإصلاح موضع طبق بتري.
      ملاحظة: يجب تثبيت طبق بتري بإحكام في الحجرة لأن القوة المغناطيسية قد تحرك الطبق إذا لم يتم تثبيته.
    8. أغلق غطاء الغرفة.
  2. تحسين معلمات التصوير
    1. تحسين حجم الثقب: يحجب الثقب الفوتونات خارج التركيز. ينتج عن حجم الثقب الأكبر المزيد من الفوتونات خارج التركيز البؤري ولكن صورة أكثر إشراقا. ينتج عن حجم الثقب الأصغر صورة أكثر تركيزا وخفوتا. تأكد من تحسين حجم الثقب للحصول على صور متحدة البؤر داخل التركيز البؤري مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء المناسبة.
    2. تحسين شدة الليزر: تحدد شدة الليزر شدة الإثارة وبالتالي انبعاث الضوء. تعطي شدة الليزر المنخفضة نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة. ارتفاع شدة الليزر سوف يسبب التبييض الضوئي. اضبط شدة الليزر وفقا لذلك.
    3. تحسين حجم الخطوة والخطوات: تحدد الخطوات وحجم الخطوة عدد الصور التي ستلتقطها في Z-stack. ستؤدي أحجام الخطوات الأصغر والمزيد من الخطوات إلى زيادة دقة Z-stack ولكنها ستزيد أيضا من التبييض الضوئي. في هذه التجربة ، تم استخدام حجم خطوة 1 ميكرومتر للخلايا ذات ارتفاع الخلية ~ 15 ميكرومتر.
    4. تحسين وقت التعرض: يحدد وقت التعرض المدة التي ستتعرض فيها الخلية لليزر الإثارة. سيؤدي وقت التعرض المنخفض إلى تقليل نسبة الإشارة إلى الضوضاء. سيؤدي وقت التعرض العالي إلى التبييض الضوئي. تم استخدام وقت التعرض 1 إطار لكل 4 ثوان في هذه التجربة.
    5. تحسين معلمات التصوير: قم بتغيير إحدى المعلمات الأربعة بشكل متكرر وحافظ على اتساق المعلمات الأخرى. في كل مرة ، قم بقياس نسبة YAP N / C لكل صورة وقارن تغيير نسبة YAP N / C لتحديد مستوى التبييض الضوئي. كرر عملية التحسين حتى تحقيق التوازن بين نسبة الإشارة إلى الضوضاء وسرعة التصوير والتبييض الضوئي.
    6. حدد تكوينات التصوير باستخدام معلمات التصوير المحسنة لإعدادات تصوير أسرع أثناء التجارب.
      ملاحظة: تم وصف التكوينات المستخدمة في هذه الدراسة في القسم 5.3 من معلمات التصوير. لتحسين معلمات التصوير للتكوينات في القسم 5.3 ، استخدم نفس الطريقة كما في الخطوة 5.2.5.
  3. تطبيق القوة الصغيرة والتصوير متحد البؤر
    ملاحظة: تم استخدام مجهر نيكون Ti2-E للتصوير في هذه الدراسة، وترد أدناه الخطوات التفصيلية للحصول على الصور.
    1. افتح المجهر المقلوب. افتح عناصر تطبيق البرنامج.
    2. تحديد التكوين magnetic_find. تحقق فقط من قناة FITC. اضبط PMT HV = 70 ، الإزاحة = 0 ، شدة الليزر = 10. اضبط سرعة المسح على إطار واحد لكل 2 ثانية بالنقر فوق الزر 1/2 . اضبط حجم الثقب على 1.2 AU بالنقر فوق الزر 1.2 A.U. سيتم استخدام هذا التكوين في الخطوة 5.3.5.
    3. تحديد التكوين magnetic_YAP_Nucleus. تحقق من قناة FITC. اضبط PMT HV = 70 ، الإزاحة = 0 ، شدة الليزر = 10. اضبط سرعة المسح على إطار واحد لكل 4 ثوان بالنقر فوق الزر 1/2 . اضبط حجم الثقب على 1.2 AU بالنقر فوق الزر 1.2 A.U. لتصوير حدود النواة وشدة البقع النووية ، تحقق من قناة Cy5. اضبط PMT HV = 70 ، الإزاحة = 0 ، شدة الليزر = 10. تم تحسين حجم الثقب للتصوير 3D YAP. لا تنقر فوق الزر 1.2 A.U . مرة أخرى بعد التحقق من قناة Cy5. سيتم استخدام هذا التكوين في الخطوة 5.3.7.
    4. قم بتشغيل DIA من خلال العناصر إذا لزم الأمر. افتح SpinView ، واستخدم مجالا ساطعا ، واضبط تركيز الكائن للحصول على صورة واضحة في التركيز للخلايا. استخدم هدفا 10x للعثور على خلايا مفردة متعددة مناسبة في ثلاثة شروط: مع وجود ميكروبيدات واحدة بالداخل ، مع وجود ميكروبيدات متعددة بالداخل ، وبدون أي ميكروبيدات بالداخل. قم بالتبديل إلى هدف 40x. قم بتسمية هذا المنصب برقم الوظيفة المناسب.
    5. العناصر المفتوحة. انقر فوق magnetic_find. انقر فوق الزر "إزالة التعشيق".
    6. انقر فوق مسح ضوئي واضبط الموضع Z للمستوى البؤري. انقر فوق الزرين العلوي والسفلي لتعيين الحد الأدنى والأعلى لمكدس Z للخلايا المحددة. أوقف المسح الضوئي بالنقر فوق مسح ضوئي مرة أخرى.
    7. قم بالتبديل إلى تكوين magnetic_YAP_Nucleus . قم بتعيين اسم الملف ك before_small_force.nd2. انقر فوق الزر "تشغيل " باستخدام مكدس Z المسجل.
    8. قم بالتبديل إلى مسار الضوء الأيمن وقم بتشغيل DIA. افتح SpinView وانقر على زر التسجيل . في هذه الأثناء ، قم بتدوير مقبض جهاز تحريك المغناطيس لتحريك المغناطيس لأسفل إلى 46 مم فوق قاع طبق بتري. احفظ تسلسل صور المجال الساطع أو الفيديو. تحقق من الفيديو للتأكد من أن الميكروبيدات تظهر الإزاحة التي تسببها القوة المغناطيسية.
    9. كرر الخطوات 5.3.5-5.3.7 ؛ قم بتعيين اسم الملف إلى after_small_force.nd2.
    10. قم بالتبديل إلى مسار الضوء الأيمن وقم بتشغيل DIA. بعد ذلك ، افتح SpinView وانقر على زر التسجيل . وفي الوقت نفسه ، قم بتدوير مقبض جهاز تحريك المغناطيس لتحريك المغناطيس حتى 120 مم فوق قاع طبق بتري. احفظ تسلسل صور المجال الساطع أو الفيديو.
    11. كرر الخطوات 5.3.5-5.3.7 وقم بتعيين اسم الملف إلى before_large_force.nd2.
  4. تطبيق القوة الكبيرة والتصوير متحد البؤر
    1. قم بإزالة غطاء غرفة البيئة للسماح للمغناطيس بالوصول إلى 13 مم فوق قاع طبق بتري.
    2. قم بالتبديل إلى مسار الضوء الأيمن وقم بتشغيل DIA. افتح SpinView وانقر على زر التسجيل . في هذه الأثناء ، قم بتدوير مقبض جهاز تحريك المغناطيس لتحريك المغناطيس لأسفل إلى 13 مم فوق قاع طبق بتري. احفظ تسلسل صور المجال الساطع أو الفيديو. تحقق من الفيديو للتأكد من أن الميكروبيدات تظهر الإزاحة التي تسببها القوة المغناطيسية.
    3. كرر الخطوات 5.3.5-5.3.7 وقم بتعيين اسم الملف إلى after_large_force.nd2.
    4. قم بالتبديل إلى مسار الضوء الأيمن وقم بتشغيل DIA. بعد ذلك ، افتح SpinView وانقر على زر التسجيل . وفي الوقت نفسه ، قم بتدوير مقبض جهاز تحريك المغناطيس لتحريك المغناطيس حتى 120 مم فوق قاع طبق بتري. احفظ تسلسل صور المجال الساطع أو الفيديو.
    5. كرر الخطوات 5.3.5-5.3.7 ؛ قم بتعيين اسم الملف إلى retract_large_force.nd2.
    6. أغلق غطاء غرفة البيئة.
  5. كرر الخطوتين 5.2 و5.3 لحقول عرض متعددة للحصول على مزيد من البيانات إذا لزم الأمر.

6. معالجة الصور وتحليل البيانات

  1. القياس الكمي لنسبة YAP N / C
    1. افتح فيجي ImageJ. افتح صور .nd2 التي تم التقاطها في الخطوة 5.
    2. انقر فوق تحليل > تعيين القياسات. تحقق من المساحة والكثافة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية وواصفات الشكل.
    3. استخدم قناة Cy5 لتحديد النواة. انقر فوق التحديدات اليدوية لاستخدام أداة التحديد الحر لتحديد النواة. تحقق أيضا من ماكرو القناع النووي التلقائي في ImageJ (انظر جدول المواد).
    4. انقر فوق تحليل > القياس في قناة FITC. القيمة المقاسة للمتوسط هي متوسط شدة YAP النووية DN.
    5. استخدم قناة Cy5 لتحديد النواة. استخدم قناة FITC لتحديد الخلية. انقر فوق التحديدات اليدوية لاستخدام أداة التحديد الحر لتحديد منطقة ذات أهمية داخل السيتوبلازم وتجنب الميكروبيدات المغناطيسية. يجب ألا تتضمن منطقة الاهتمام هذه النواة.
    6. انقر فوق تحليل > القياس في قناة FITC. القيمة المقاسة للمتوسط هي متوسط كثافة YAP السيتوبلازمية DC.
    7. احسب نسبة YAP N / C = D N / DC.
  2. القياس الكمي للشكل النووي وكثافة البقع النووية الطبيعية
    1. افتح فيجي ImageJ. افتح صور .nd2 التي تم التقاطها في الخطوة 5.
    2. انقر فوق تحليل > تعيين القياسات. تحقق من المساحة والكثافة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية وواصفات الشكل.
    3. استخدم قناة Cy5 لتحديد النواة. انقر فوق التحديدات اليدوية لاستخدام أداة التحديد الحر لتحديد النواة.
    4. انقر فوق تحليل > القياس في قناة Cy5. القيمة المقاسة للمتوسط هي شدة البقع النووية. القيمة المقاسة للسيرك. هي دائرية نووية.
    5. لمقارنة شدة البقع النووية في حالة قوة مختلفة ، يتم تقسيم كل شدة البقع النووية على شدة البقع النووية في "before_small_force.nd2" لتوليد كثافة البقع النووية الطبيعية.

النتائج

تصميم جهاز تحريك مغناطيسي وتطبيق القوة المغناطيسية
لتطبيق القوة على النواة من خلال الميكروبيدات المغناطيسية ، تم تصميم وبناء جهاز تحريك مغناطيسي للتحكم في الموقع المكاني للمغناطيس. يحتوي جهاز تحريك المغناطيس على إطار مركزي وثلاثة مقابض وقضبان لتحريك المغناطيس المرفق في اتجا...

Discussion

يعد استيعاب الميكروبيدات المغناطيسية (القسم 2.2) أمرا بالغ الأهمية لأن الميكروبيدات خارج الخلية لا يمكنها تطبيق القوة مباشرة على النواة. يعد تطبيق القوة والتصوير (القسم 5.3) من الخطوات الحاسمة في هذه التجربة ، وقد تعتمد القوة اللازمة لتشويه النواة والحث على عواقب بيولوجية ذات مغزى على العين?...

Disclosures

لا يوجد تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgements

يتم تمويل هذا المشروع من قبل حزمة بدء جائزة UF Gatorade (X. T.) ، وجائزة UFHCC التجريبية (X. T. والدكتور ديتمار سيمان) ، وصندوق UF Opportunity Seed Fund (X. T.) ، وبرنامج علماء جامعة UFHCC (H. Y. Wang). نحن نقدر بصدق المناقشات الفكرية والدعم الفني من الدكتور جوناثان ليخت (UFHCC) ، الدكتور رولف رين (UFHCC) ، الدكتور كريستوفر فولبي (UFHCC) ، الدكتورة بلانكا شارما (BME) ، الدكتور مارك شيبلاك (MAE و ECE) ، الدكتور دانيال فيريس (BME) ، الدكتورة ماليسا سارنتينورانونت (MAE) ، الدكتور أشوك كومار (MAE) ، الدكتور بنيامين كيسيلوفسكي (BME) ، الدكتور برنت جيلا (RSC) ، الدكتور فيليب فنغ (ECE) ، الدكتور غريغوري أ. هودالا (BME) ، الدكتور ستيفن غيفزاني (OSSM) ، الدكتور ينيسل كروز ألميدا (CDBS) ، الدكتور روجر فيلينجيم (CD-BS) ، الدكتور روبرت كودل (OMS) ، الدكتور جون نيوبرت (DN-OR) ، الدكتور جاستن هيليارد (جراحة المخ والأعصاب) ، الدكتور تيان هي (جامعة هارفارد) ، الدكتور يوهوا تان (جامعة هونغ كونغ للفنون التطبيقية) ، الدكتور جيسي L-S Au (معهد علم الأدوية للأنظمة الكمية) ، الدكتور ديفيد هان (جامعة أريزونا) ، وفريق دعم نيكون (الدكاترة خوسيه سيرانو فيليز ولاري كوردون وجون إيكمان). نحن ممتنون للغاية للدعم الفعال من جميع أعضاء مختبرات أبحاث Tang's و Yamaguchi و Sharma's و Au's و Siemann و Guan وجميع موظفي قسم UF MAE.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05 % TrypsinCorning25-051-CI
25 cm2 flaskCorning156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeadsN/AN/A
A1R confocal systemNikon
Carbonyl Iron Powder CMBASF30042253Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640)Gibco11875093
Desktop ComputerDellwith Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZBTokai HitTIZB
Fetal bovine serum (FBS)Gibco26140
Fiji ImageJNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dishMatTekP35G-1.5-14-C
MagnetK&J Magnetics, Inc.D99-N52
Monochrome CameraFLIRBFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platformNikonsoftware platform
Nucleus mask ImageJ macrohttps://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650Biotium#40082Nuclear stain
Penicillin-streptomycinGibco15140122
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010023
Ti2-E inverted microscopeNikon
XYZ mover (CAD files)https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in 'omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
  50. Berret, J. -. F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185 9 YAP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved