3D磁力アクチュエータと多機能蛍光イメージングを組み合わせて核メカノバイオロジーを研究

要約

本研究では、細胞質内に送達される磁気マイクロビーズを介して細胞核に直接力を加え、生細胞蛍光イメージングを同時に行うための新しいプロトコルを提示します。

要約

メカノバイオロジーにおける基本的な問題は、細胞生理学と病理学の文脈で、生細胞が細胞外の機械的刺激をどのように感知するかということです。細胞外力学的刺激の細胞メカノ感覚は、膜受容体、関連するタンパク質複合体、および細胞骨格を介して行われると考えられています。メカノバイオロジーの最近の進歩は、細胞質自体の細胞核が独立して機械的刺激を同時に感知できることを示しています。しかし、細胞核が機械的刺激をどのように感知し、形質導入し、応答するかについての機構的理解は、主に従来のツールによる核力学へのアクセスと定量化における技術的課題のために不足しています。この論文では、正確で非侵襲的な3D機械的刺激を適用して細胞核を直接変形させる新しい磁力アクチュエータの設計、製造、および実装について説明します。CRISPR/Cas9で改変された細胞を用いて、このツールと高解像度の共焦点蛍光イメージングを組み合わせることで、単一細胞におけるメカノ感受性Yes随伴タンパク質(YAP)のリアルタイムダイナミクスを核変形の関数として明らかにすることができることを実証する。この簡単な方法は、メカノバイオロジーコミュニティにおける現在の技術ギャップを埋め、核のメカノトランスダクションと細胞機能との関係に存在する知識ギャップに対する答えを提供する可能性を秘めています。

概要

本研究では、細胞核に直接機械的な力を加える磁気アクチュエータと、細胞内構造変化と機能変化を同時に撮像する共焦点蛍光顕微鏡を組み合わせることで、核メカノバイオロジーを解明する新しい技術を開発し、応用することを目的としています。細胞は、組織の硬さ1,2,3,4、間質液圧およびせん断応力^5,6,7、表面トポロジー/形状8,9,10,11,12、および引張/圧縮応力^13,14を含む細胞外生物物理学的シグナルを感知します。

プロトコル

1. CRISPR/Cas9遺伝子改変B2B細胞のメンテナンス

1. 10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640を含むT25フラスコでB2B細胞を培養します。
2. B2B細胞を加湿インキュベーター内で5%_CO2を含む37°Cに維持する。
3. コンフルエントが70%〜80%に達したときにB2B細胞を継代培養する。
4. B2B細胞株を10%(v/v)DMSOを含むRPMI-1640培養培地の-80°C冷凍庫に保管します。
5. 実験では継代数が10未満のB2B細胞を使用します。

2. 細胞培養

1. 細胞をガラス底のペトリ皿に播種します。
   1. 内部にB2B細胞を含むフラスコをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移動します。
   2. 真空ポンプを接続した吸引ピペットを使用してフラスコ内の培養液を除去します。
   3. フラスコを2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
   4. 吸引ピペットを使用してPBSを取り外します。
   5. 0.5 mLの0.05%トリプシン溶液を加えて、フラスコ基質の底から細胞を剥離します。
   6. フラスコをインキュベーター....

結果

磁石移動装置の設計と磁力の応用
磁気マイクロビーズを介して原子核に力を加えるために、磁石の空間位置を制御するために磁石移動装置が設計および構築されました。磁石移動装置には、中央フレーム、3つのノブ、およびレールが含まれており、取り付けられた磁石をサイクルあたり1.59mmの空間分解能でx、y、z方向に独立して移動させます(図1A)。磁?.......

ディスカッション

細胞外マイクロビーズは核に直接力を加えることができないため、磁気マイクロビーズの内在化(セクション2.2)は重要です。力の適用とイメージング(セクション5.3)は、この実験の重要なステップであり、核を変形させて意味のある生物学的結果を誘発するために必要な力は、サンプルに依存する可能性があります。この実験の力の大きさ(0.8 nNと1.4 nN)をさらに大きくして、感度の低い細胞で?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05 % Trypsin	Corning	25-051-CI
25 cm2 flask	Corning	156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads	N/A	N/A
A1R confocal system	Nikon
Carbonyl Iron Powder CM	BASF	30042253	Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640)	Gibco	11875093
Desktop Computer	Dell		with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB	Tokai Hit	TIZB
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	26140
Fiji ImageJ	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish	MatTek	P35G-1.5-14-C
Magnet	K&J Magnetics, Inc.	D99-N52
Monochrome Camera	FLIR	BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform	Nikon		software platform
Nucleus mask ImageJ macro			https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650	Biotium	#40082	Nuclear stain
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010023
Ti2-E inverted microscope	Nikon
XYZ mover (CAD files)			https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover