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要約

本研究では、細胞質内に送達される磁気マイクロビーズを介して細胞核に直接力を加え、生細胞蛍光イメージングを同時に行うための新しいプロトコルを提示します。

要約

メカノバイオロジーにおける基本的な問題は、細胞生理学と病理学の文脈で、生細胞が細胞外の機械的刺激をどのように感知するかということです。細胞外力学的刺激の細胞メカノ感覚は、膜受容体、関連するタンパク質複合体、および細胞骨格を介して行われると考えられています。メカノバイオロジーの最近の進歩は、細胞質自体の細胞核が独立して機械的刺激を同時に感知できることを示しています。しかし、細胞核が機械的刺激をどのように感知し、形質導入し、応答するかについての機構的理解は、主に従来のツールによる核力学へのアクセスと定量化における技術的課題のために不足しています。この論文では、正確で非侵襲的な3D機械的刺激を適用して細胞核を直接変形させる新しい磁力アクチュエータの設計、製造、および実装について説明します。CRISPR/Cas9で改変された細胞を用いて、このツールと高解像度の共焦点蛍光イメージングを組み合わせることで、単一細胞におけるメカノ感受性Yes随伴タンパク質(YAP)のリアルタイムダイナミクスを核変形の関数として明らかにすることができることを実証する。この簡単な方法は、メカノバイオロジーコミュニティにおける現在の技術ギャップを埋め、核のメカノトランスダクションと細胞機能との関係に存在する知識ギャップに対する答えを提供する可能性を秘めています。

概要

本研究では、細胞核に直接機械的な力を加える磁気アクチュエータと、細胞内構造変化と機能変化を同時に撮像する共焦点蛍光顕微鏡を組み合わせることで、核メカノバイオロジーを解明する新しい技術を開発し、応用することを目的としています。細胞は、組織の硬さ1,2,3,4、間質液圧およびせん断応力5,6,7、表面トポロジー/形状8,9,10,11,12、および引張/圧縮応力13,14を含む細胞外生物物理学的シグナルを感知します。15,16。生物物理学的シグナルは生化学的シグナルに変換され、遺伝子発現と細胞挙動の潜在的な下流変化を引き起こします-メカノトランスダクションとして知られるプロセス17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27.メカノトランスダクションプロセスを研究するために、原子間力顕微鏡28、細胞伸張装置29、バイオMEMS(微小電気機械システム)力センサ15、30、31、せん断レオロジー32、ステレオビジョンシステム33など、細胞に機械的力を加えるための無数の技術が開発されています。.最近のレビューでは、細胞外の機械的手がかりを適用し、メカノセンシングを妨害するアプローチを要約しています34。現在まで、これらの方法のほとんどは細胞原形質膜に力を加えており、細胞はインテグリン、カドヘリン、イオンチャネル、Gタンパク質共役型受容体などの膜受容体を介してこれらの細胞外生物物理学的シグナルを直接受信しています。続いて、それらは細胞内の細胞骨格および核にシグナルを伝達する。例えば、メカノセンシングの指標としてyes随伴タンパク質(YAP)転座を用いると、細胞は細胞膜からの基質の硬さおよび細胞外張力の機械的シグナルを感知し、それらを細胞骨格を介して核に伝達し、YAP細胞質から核への転座を誘導することが示されている28,35。

最近の証拠は、細胞核自体が独立したメカノセンサーであることを示唆しています8,36,37。これは、細胞から採取された単離された核で行われた実験によって証明され、そこでは、核がそれらに直接加えられた機械的な力に応答してそれらの剛性を適応的に変化させることが明らかになった36。多くの生理学的状態の間、腫瘍細胞および健康な細胞の両方における核は、細胞外生物物理学的シグナルを感知し、それらの機械的特性および集合体を変化させる38,39,40。例えば、血管外漏出時に、腫瘍細胞の核硬直は減少し、24時間38時間にわたって柔らかさを維持する。限られた間質空間を通る移動中に、腫瘍細胞の核はしばしばその構造的完全性を失い、回復する39。しかし、核が生物物理学的シグナルを感知する方法は不明ですが、ラミンA / Cや核骨格と細胞骨格のリンカー(LINC)複合体など、いくつかの核エンベロープタンパク質とタンパク質ファミリーが関与していることがわかっています38,41。したがって、核に直接力を加えることができる新しい非侵襲的方法は、細胞原形質膜と細胞骨格からの力伝達の影響を切り離し、これまでアクセスできなかった核メカノセンシングの分子メカニズムの解明に役立ちます。

光ピンセットを用いて細胞小器官42を操作し、細胞43に注入したマイクロビーズを用いた研究は、核に直接力を加える技術力を示した。しかしながら、光ピンセット技術にはいくつかの制限がある:(1)低スループット光ピンセットは、しばしば一度に1つの細胞またはマイクロビーズしか操作しない。(2)核の潜在的な光損傷および温度アーチファクト変形には数十のpN36が必要であり、対応する必要なレーザー出力はpN44,45あたり約10mWです。このようなレーザー強度は、実験46の間に細胞における光損傷を引き起こし、細胞機能を混乱させるのに十分である。

生細胞内のマイクロビーズを介して加えられる磁力は、核に直接力を加える可能性を示し、光ピンセットの限界を克服します。マイクロビーズが細胞質に送達されると、磁場は複数のマイクロビーズに同時にハイスループットな方法で磁力を及ぼすことができます。磁場は細胞機能47に影響を与えないが、pNからnNまでの力を生成し、これは核変形を誘発するのに十分である36,48,49。現在までに、磁気マイクロビーズの操作は、細胞原形質膜48、細胞質50の内部、F-アクチン51、核47の内部、および単離された核36に適用されてきた。しかし、マイクロビーズの磁気操作は、核内のメカノトランスダクションを研究するために核エンベロープに直接的な機械的力を加えるために使用されたことはありません。

本論文では、磁性マイクロビーズを細胞質に非侵襲的に送達し、このマイクロビーズを使用して核に機械的な力を加える簡単な技術を開発しました(図1)。ここでは、mNeonGreen21-10/11タグ付きYAPを内因的に発現するCRISPR/Cas9操作されたヒト正常B2B細胞株を使用して、この方法を検証します。YAPはメカノ感受性タンパク質であり、YAPの転座は核メカノセンシングによって制御されています14,28。CRISPR/Cas9制御ノックインアプローチは、内因性YAPに蛍光タンパク質(FP)mNeonGreen21-10/11をタグ付けするために選択されました。CRISPR編集は不完全な効率とオフターゲット効果を有することが知られているが、以前の出版物のプロトコルは、正しいオープンリーディングフレーム挿入のために選択するために蛍光ソーティングを統合した52、53、54。この追加の選択層により、以前に生成された20+細胞株においてオフターゲットタグ付け事象は観察されなかった52,53,54,55。これはスプリット蛍光タンパク質構築物ですが、原理的には、任意の発現可能な蛍光タグを使用できます。この標識アプローチは、導入遺伝子または抗体法よりも優れています。第一に、導入遺伝子発現とは異なり、タグ付きタンパク質は単コピー遺伝子投与量を維持し、天然遺伝子調節ネットワークの生理学的状況で発現し、タンパク質濃度、局在、および相互作用の偏差を制限する。この研究で使用されたタグ付け方法は、完全なFPタグ付けよりも桁違いに高いスループットと効率を達成します。また、固定アーチファクトや高品質で特異性の高い抗体の限られた入手による免疫蛍光に関連する課題を回避します。第二に、この論文で使用されているアプローチは、細胞生理学への摂動を最小限に抑え、すべての内因性YAPのリアルタイム啓示を可能にします。対照的に、他の一般的な導入遺伝子法は、しばしばYAPの過剰発現をもたらす。結果として生じる人工的な分布は、潜在的に細胞毒性を引き起こし、細胞のメカノセンシングに影響を与える可能性があります56、57、58。

この研究は、細胞質に送達された磁気マイクロビーズを介して核に直接力を加え、同時に生細胞蛍光イメージングを行うためのプロトコルを提示します。要約すると、ここで提示されたプロトコルは、(1)核の外側で磁気マイクロビーズを細胞内に送達する方法、(2)マイクロビーズを操作して核に磁力を加える方法、(3)操作中に細胞の共焦点蛍光イメージングを実行する方法、および(4)力を加えるプロセス全体を通してYAP核/細胞質(N / C)比を定量的に分析する方法を示しています。結果は、(1)エンドサイトーシスを介して、磁気マイクロビーズが7時間以内にB2B細胞の細胞質に非侵襲的に送達できることを示唆しています(図2および図3)。(2)核に直接加えられた定量化された磁力(図4、図5、および図6)だけで、CRISPR/Cas9操作B2B細胞におけるYAP N / C比の多様な変化を引き起こす可能性があります(図7および図8)。

プロトコル

1. CRISPR/Cas9遺伝子改変B2B細胞のメンテナンス

  1. 10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640を含むT25フラスコでB2B細胞を培養します。
  2. B2B細胞を加湿インキュベーター内で5%CO2を含む37°Cに維持する。
  3. コンフルエントが70%〜80%に達したときにB2B細胞を継代培養する。
  4. B2B細胞株を10%(v/v)DMSOを含むRPMI-1640培養培地の-80°C冷凍庫に保管します。
  5. 実験では継代数が10未満のB2B細胞を使用します。

2. 細胞培養

  1. 細胞をガラス底のペトリ皿に播種します。
    1. 内部にB2B細胞を含むフラスコをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移動します。
    2. 真空ポンプを接続した吸引ピペットを使用してフラスコ内の培養液を除去します。
    3. フラスコを2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
    4. 吸引ピペットを使用してPBSを取り外します。
    5. 0.5 mLの0.05%トリプシン溶液を加えて、フラスコ基質の底から細胞を剥離します。
    6. フラスコをインキュベーターに5分間入れます。
    7. フラスコをバイオセーフティキャビネットに移動します。5 mLの新しい培養液をフラスコに加え、溶液を上下にピペットで固定します。
    8. 細胞を含む培地50 μL(300細胞/μL)をガラス底のペトリ皿に堆積させます。2 mLの培養液をペトリ皿に加えます。
    9. ペトリ皿をインキュベーターに入れます。セルが付着するまで12時間待ちます。
  2. 磁気マイクロビーズで細胞を培養します。
    1. 平均直径7μmのカルボニル鉄マイクロビーズ(以下、7μmマイクロビーズという、 材料表参照)を0.2g秤量する。
    2. ピペットを使用して、マイクロビーズを1 mLのRPMI-1640培地に懸濁します。
    3. B2B細胞の入ったペトリ皿をバイオセーフティキャビネットに持っていきます。
    4. マイクロビーズを含む培地200 μLをペトリ皿に加えます。
      注意: マイクロビーズの沈殿を避けるために、培地をすばやく追加します。
    5. マイクロビーズが細胞によって内在化されるまで、ペトリ皿をインキュベーターに戻します。6時間ごとにインターナリゼーションをチェックして、さまざまな細胞株のインターナリゼーションに最適な時間を決定します。
    6. インターナリゼーションを確認するには、共焦点蛍光イメージングを実行して、マイクロビーズ、核、および細胞境界を視覚化します。マイクロビーズが細胞によって内部化されている場合、それは細胞境界内にあります。

3. 核の可視化

  1. インキュベーター内の培養液1.5 mLを15分間温めます。
  2. バイオセーフティキャビネットのライトをオフにします。細胞、加温した培地、核染色、ベラパミルHClが入ったペトリ皿をバイオセーフティキャビネットに入れます。
    注:核染色成分は光に敏感です。操作中は光にさらさないでください。
  3. DMSOで1000倍の核染色を100倍に希釈します。
  4. 100 mM ベラパミル塩酸塩をDMSOで 10 mM に希釈します。
  5. 15 μLの100x核染色剤と15 μLの10 mMベラパミルHClを1.5 mLの培地に加えます。上下にピペッティングしてよく混ぜます。
  6. ペトリ皿から培地を取り出します。核染色を含む培養液をペトリ皿に加えます。
  7. 細胞をインキュベーターに2時間以上戻します。

4. 磁力印加金物の準備

  1. アクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS)を使用してすべての部品を3Dプリントし、CAD設計に従って組み立てます(図1A)。CAD設計は 材料表に含まれています。
  2. 両面テープを使用して、磁石を磁石移動装置に取り付けます(図1A)。
  3. 磁石移動装置を顕微鏡ステージの横に設置します。3つのノブを使用して、磁石がペトリ皿の上を13mmから120mmの間で移動できるようになるまで、磁石の空間位置を調整します。
    注意: 磁気マイクロビーズに不要な力が加わらないように、磁石とペトリ皿の間の距離の上限ができるだけ大きくなっていることを確認してください。この実験セットアップでは、120mmが最大値です。磁石が対物レンズや電動ステージなどの顕微鏡部品に干渉しないようにしてください。
  4. 磁石を最も高いz位置(120 mm)に設定します。

5. 強制適用と生細胞イメージング

  1. 長期イメージングのための環境チャンバーの設置
    1. 75%エタノール溶液を塗布して、環境チャンバーを完全に滅菌および洗浄します。
    2. 倒立顕微鏡の電動ステージに環境チャンバーを置きます。
    3. CO2タンクを開き、CO2流入速度を160mL /分に設定します。
    4. チャンバーの温度を44°C(上)、42°C(バス)、40°C(ステージ)に調整します。
    5. 20mLの精製水を環境チャンバーの浴に加え、湿度90%を維持します。
    6. 組織培養インキュベーターから標的細胞を含むガラス底のペトリ皿を取り出し、チャンバーに入れます。
    7. 環境チャンバーの金属クランプを適用して、ペトリ皿の位置を固定します。
      注意: ペトリ皿は、クランプされていないと磁力が皿を動かす可能性があるため、チャンバー内でしっかりと固定する必要があります。
    8. チャンバーの蓋を閉めます。
  2. イメージングパラメータの最適化
    1. ピンホールサイズの最適化:ピンホールは焦点が合っていない光子をブロックします。ピンホールサイズを大きくすると、焦点が合っていない光子が多くなりますが、画像は明るくなります。ピンホールサイズを小さくすると、より焦点が合った暗い画像が得られます。ピンホールのサイズを最適化して、適切な信号対雑音比で焦点の合った共焦点画像を取得してください。
    2. レーザー強度の最適化:レーザー強度は励起の強度を決定し、したがって発光光を決定します。レーザー強度が低いため、信号対雑音比が低くなります。レーザー強度が高すぎると、光退色が発生します。それに応じてレーザー強度を調整します。
    3. ステップサイズとステップを最適化する:ステップとステップサイズによって、Zスタックで取得する画像の数が決まります。ステップサイズを小さくし、ステップを多くすると、Zスタックの解像度が向上しますが、光退色も増加します。この実験では、細胞高さ~15 μmの細胞に1 μmステップサイズを使用しました。
    4. 露光時間の最適化:露光時間は、細胞が励起レーザーにさらされる時間を決定します。露光時間が短いと、信号対雑音比が低下します。露光時間が長いと、光退色が発生します。この実験では、4秒あたり1フレームの露光時間を使用しました。
    5. イメージングパラメータの最適化:4つのパラメータの1つを繰り返し変更し、他のパラメータの一貫性を維持します。毎回、各画像のYAP N / C比を測定し、YAP N / C比の変化を比較して、光退色レベルを決定します。信号対雑音比、イメージング速度、および光退色のバランスが取れるまで、最適化プロセスを繰り返します。
    6. 最適化されたイメージングパラメータを使用してイメージング構成を定義し、実験中のイメージング設定を高速化します。
      注意: この研究で使用される構成は、イメージングパラメータのセクション5.3で説明されています。セクション5.3の構成のイメージングパラメータを最適化するには、手順5.2.5と同じ方法を使用します。
  3. 小力印加と共焦点イメージング
    注:この研究では、Nikon Ti2-E顕微鏡を使用してイメージングを行い、画像取得の詳細な手順を以下に示します。
    1. 倒立顕微鏡を開きます。ソフトウェアアプリケーション Elementsを開きます。
    2. コンフィギュレーション magnetic_findを定義します。FITCチャネルのみをチェックします。光電子増倍管 HV = 70、オフセット = 0、レーザー強度 = 10 に設定します。1 /2 ボタンをクリックして、スキャン速度を1秒あたり2フレームに設定します。ピンホールのサイズを1.2AUに設定するには、 1.2A.U. ボタンをクリックします。この設定は、手順 5.3.5 で使用されます。
    3. 構成 magnetic_YAP_Nucleusを定義します。FITCチャネルを確認してください。光電子増倍管 HV = 70、オフセット = 0、レーザー強度 = 10 に設定します。1 /2 ボタンをクリックして、スキャン速度を4秒ごとに1フレームに設定します。ピンホールのサイズを1.2AUに設定するには、 1.2A.U. ボタンをクリックします。核境界と核染色強度を画像化するには、Cy5チャネルを確認してください。光電子増倍管 HV = 70、オフセット = 0、レーザー強度 = 10 に設定します。ピンホールサイズは、3D YAPイメージング用に最適化されています。Cy5チャネルを確認した後、 1.2 A.U. ボタンを再度クリックしないでください。この設定は、ステップ 5.3.7 で使用されます。
    4. 必要に応じて、エレメントを介してDIAをオンにします。SpinView を開き、明視野を使用してオブジェクトのフォーカスを調整し、セルのピントが合った鮮明な画像を取得します。10倍の対物レンズを使用して、内部に1つのマイクロビーズがある、内部に複数のマイクロビーズがある、内部にマイクロビーズがないという3つの条件で適切な複数の単一セルを見つけます。40倍の対物レンズに切り替えます。この位置に適切な位置番号を付けます。
    5. 要素を開きます。magnetic_findをクリックします。[インターロックの削除]ボタンをクリックします。
    6. [ スキャン ] をクリックし、焦点面の Z 位置を調整します。 [上 ] ボタンと [下 ] ボタンをクリックして、選択したセルの Z スタックの下限と上限を設定します。もう一度 [ スキャン ] をクリックしてスキャンを停止します。
    7. magnetic_YAP_Nucleus構成に切り替えます。ファイル名を before_small_force.nd2 に設定します。記録されたZスタックの[実行]ボタンをクリックします。
    8. 正しい光路に切り替えて、 DIAをオンにします。 スピンビュー を開き、[ 録音 ]ボタンをクリックします。その間、磁石移動装置のノブを回して、磁石をペトリ皿の底から46mm上に移動します。明視野画像シーケンスまたはビデオを保存します。ビデオをチェックして、マイクロビーズが磁力によって誘発される変位を示していることを確認します。
    9. 手順5.3.5〜5.3.7を繰り返します。ファイル名を after_small_force.nd2 に設定します。
    10. 正しい光路に切り替えて、 DIAをオンにします。次に、 SpinView を開き、[ 録音 ]ボタンをクリックします。その間、磁石移動装置のノブを回して、磁石をペトリ皿の底から最大120mm上に移動します。明視野画像シーケンスまたはビデオを保存します。
    11. 手順 5.3.5 から 5.3.7 を繰り返し、ファイル名を before_large_force.nd2 に設定します。
  4. 大きな力の適用と共焦点イメージング
    1. 環境チャンバーの蓋を外して、磁石がペトリ皿の底から13mm上になるようにします。
    2. 正しい光路に切り替えて、 DIAをオンにします。 スピンビュー を開き、[ 録音 ]ボタンをクリックします。その間、磁石移動装置のノブを回して、磁石をペトリ皿の底から13mm上に移動します。明視野画像シーケンスまたはビデオを保存します。ビデオをチェックして、マイクロビーズが磁力によって誘発される変位を示していることを確認します。
    3. 手順 5.3.5 から 5.3.7 を繰り返し、ファイル名を after_large_force.nd2 に設定します。
    4. 正しい光路に切り替えて、 DIAをオンにします。次に、 SpinView を開き、[ 録音 ]ボタンをクリックします。その間、磁石移動装置のノブを回して、磁石をペトリ皿の底から最大120mm上に移動します。明視野画像シーケンスまたはビデオを保存します。
    5. 手順5.3.5〜5.3.7を繰り返します。ファイル名を retract_large_force.nd2 に設定します。
    6. 環境チャンバーの蓋を閉めます。
  5. 複数の視野に対して手順 5.2 と 5.3 を繰り返して、必要に応じてさらにデータを取得します。

6. 画像処理とデータ解析

  1. YAP N/C比の定量化
    1. フィジー画像を開きますJ.手順 5 で取得した .nd2 イメージを開きます。
    2. [ 分析 ]をクリックして> 測定値を設定します。 面積、 積分密度、 平均グレー値、 および形状記述子を確認します。
    3. Cy5チャネルを使用して核を特定します。 フリーハンド 選択をクリックして、自由選択ツールを使用して核の輪郭を描きます。また、ImageJの自動核マスクマクロを確認してください( 材料表を参照)。
    4. FITCチャネルで[分析>測定]をクリックします。なお、Meanの測定値は、平均核YAP強度DNである。
    5. Cy5チャネルを使用して核を特定します。FITC チャネルを使用してセルを識別します。 フリーハンド 選択をクリックして、自由選択ツールを使用して細胞質内の関心領域を選択し、磁気マイクロビーズを回避します。この関心領域には核が含まれていてはなりません。
    6. FITCチャネルで[分析>測定]をクリックします。なお、Meanの測定値は、平均細胞質YAP強度DCである。
    7. ヤップ N/C 比 = D N / DC を計算します。
  2. 核形状と正規化された核染色強度の定量化
    1. フィジー画像を開きますJ.手順 5 で取得した .nd2 イメージを開きます。
    2. [ 分析 ]をクリックして> 測定値を設定します。 面積、 積分密度、 平均グレー値、 および形状記述子を確認します。
    3. Cy5チャネルを使用して核を特定します。 フリーハンド 選択をクリックして、自由選択ツールを使用して核の輪郭を描きます。
    4. Cy5チャンネルで分析>測定をクリックします。平均の測定値は核染色強度です。サークの測定値。核の循環性です。
    5. 異なる力状態での核染色強度を比較するために、すべての核染色強度を「before_small_force.nd2」の核染色強度で割って、正規化された核染色強度を生成します。

結果

磁石移動装置の設計と磁力の応用
磁気マイクロビーズを介して原子核に力を加えるために、磁石の空間位置を制御するために磁石移動装置が設計および構築されました。磁石移動装置には、中央フレーム、3つのノブ、およびレールが含まれており、取り付けられた磁石をサイクルあたり1.59mmの空間分解能でx、y、z方向に独立して移動させます(図1A)。磁?...

ディスカッション

細胞外マイクロビーズは核に直接力を加えることができないため、磁気マイクロビーズの内在化(セクション2.2)は重要です。力の適用とイメージング(セクション5.3)は、この実験の重要なステップであり、核を変形させて意味のある生物学的結果を誘発するために必要な力は、サンプルに依存する可能性があります。この実験の力の大きさ(0.8 nNと1.4 nN)をさらに大きくして、感度の低い細胞で?...

開示事項

宣言する利益相反はありません。

謝辞

このプロジェクトは、UFゲータレードアワードスタートアップパッケージ(X.T.)、UFHCCパイロットアワード(X.T.およびディートマールシーマン博士)、UFオポチュニティシードファンド(X.T.)、およびUFHCC大学奨学生プログラム(HY.ワン)によって資金提供されています。ジョナサン・リヒト博士(UFHCC)、ロルフ・レネ博士(UFHCC)、クリストファー・ヴァルプ博士(UFHCC)、ブランカ・シャルマ博士(BME)、マーク・シェプラク博士(MAE&ECE)、ダニエル・フェリス博士(BME)、マリサ・サルンティノラノン博士(MAE)、アショク・クマール博士(MAE)、ベンジャミン・ケセロウスキー博士(BME)、ブレント・ギラ博士(RSC)、フィリップ・フェン博士(ECE)、 グレゴリー・A・フダラ博士(BME)、スティーブン・ギヴィッツァーニ博士(OSSM)、エニセル・クルス・アルメイダ博士(CDBS)、ロジャー・フィリンギム博士(CD-BS)、ロバート・コードル博士(OMS)、ジョン・ノイバート博士(DN-OR)、ジャスティン・ヒリアード博士(脳神経外科)、天和博士(ハーバード大学)、ヨウフア・タン博士(香港理工大学)、ジェシー・L-S Au博士(定量システム薬理学研究所)、デビッド・ハーン博士(アリゾナ大学) ニコンの支援チーム(ホセ・セラーノ・ベレス博士、ラリー・コードン博士、ジョン・エクマン博士)。唐、山口、シャルマ、アウ、シーマン、グアンの研究所のすべてのメンバーとUF MAE部門のすべてのスタッフからの効果的なサポートに深く感謝しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05 % TrypsinCorning25-051-CI
25 cm2 flaskCorning156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeadsN/AN/A
A1R confocal systemNikon
Carbonyl Iron Powder CMBASF30042253Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640)Gibco11875093
Desktop ComputerDellwith Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZBTokai HitTIZB
Fetal bovine serum (FBS)Gibco26140
Fiji ImageJNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dishMatTekP35G-1.5-14-C
MagnetK&J Magnetics, Inc.D99-N52
Monochrome CameraFLIRBFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platformNikonsoftware platform
Nucleus mask ImageJ macrohttps://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650Biotium#40082Nuclear stain
Penicillin-streptomycinGibco15140122
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010023
Ti2-E inverted microscopeNikon
XYZ mover (CAD files)https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

参考文献

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